DNA合成誤差校正

1、Error correction in gene synthesis technologyTrends in Biotechnology March 2012, Vol. 30, No. 3 基因的合成通常是用酶組裝通過化學(xué)基因的合成通常是用酶組裝通過化學(xué)方法合成的寡聚合甘酸，合成的結(jié)果不方法合成的寡聚合甘酸，合成的結(jié)果不可避免的出現(xiàn)缺失、插入和堿基替換等可避免的出現(xiàn)缺失、插入和堿基替換等情況，基因合成的保真度是確?；蛘闆r，基因合成的保真度是確保基因正確表達(dá)的首要條件，在自然條件下，不確表達(dá)的首要條件，在自然條件下，不管原核還是真核生物其合成基因的錯誤管原核還是真核生物其合成基因的錯誤率一

2、般在率一般在1/107左右，而我們?nèi)藶榈幕蜃笥?，而我們?nèi)藶榈幕蚝铣善溴e誤率一般在合成其錯誤率一般在1/102左右左右. 本文介紹了一些基因合成過程中校正本文介紹了一些基因合成過程中校正技術(shù)。技術(shù)。1) 合成寡核苷酸過程中的錯誤刪除。2) 合成基因過程中的錯誤刪除。 2.1) 用 MutS 錯誤不協(xié)調(diào)綁定蛋白消除錯誤。 2.2) 用不協(xié)調(diào)切斷酶校正錯誤。目錄亞磷酰胺法示意圖合成流程合成流程1）1）主要錯誤的形式：主要錯誤的形式：第一、亞磷酰胺單體沒能結(jié)合到延伸鏈上，第一、亞磷酰胺單體沒能結(jié)合到延伸鏈上，導(dǎo)致出現(xiàn)缺失出現(xiàn)，出錯率在導(dǎo)致出現(xiàn)缺失出現(xiàn)，出錯率在1.5%0.5%左左右。右。第二、尚未

3、耦合的鏈被乙酰化而終止反應(yīng)，第二、尚未耦合的鏈被乙?；K止反應(yīng)，導(dǎo)致提前終止合成，出錯率在導(dǎo)致提前終止合成，出錯率在0.5%左右。左右。第三、第二步合成過量的催化劑會導(dǎo)致第三、第二步合成過量的催化劑會導(dǎo)致DMT脫保護，然后再結(jié)合一份子亞磷酰胺而導(dǎo)致脫保護，然后再結(jié)合一份子亞磷酰胺而導(dǎo)致插入的出現(xiàn)，出錯率在插入的出現(xiàn)，出錯率在0.4%左右左右.1）錯誤的排除方法錯誤的排除方法用用HPLC和和PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）（聚丙烯酰胺凝膠電泳）通過長度大小的不同對其進行純化。疏水的凈化通過長度大小的不同對其進行純化。疏水的凈化筒可以對尚未脫去筒可以對尚未脫去DMT保護基的保護基的Oligos進行

4、純化，進行純化，用這兩種方法可以除掉用這兩種方法可以除掉90%的雜質(zhì)（大部分是插的雜質(zhì)（大部分是插入、刪除和切斷）。入、刪除和切斷）。 缺點是：人力勞動量太大，而且沒辦法除去堿缺點是：人力勞動量太大，而且沒辦法除去堿基替換和單個堿基的插入或刪除?；鎿Q和單個堿基的插入或刪除。2) 盡管對盡管對Oligos 經(jīng)過了繁瑣的純化還是有經(jīng)過了繁瑣的純化還是有一部分錯誤會隨著一部分錯誤會隨著Oligos進入下游的合成進入下游的合成中，而且在聚合酶的延伸過程中也會引入中，而且在聚合酶的延伸過程中也會引入一些新的錯誤，例如錯配等。選擇一個正一些新的錯誤，例如錯配等。選擇一個正確無誤的基因序列經(jīng)常要用到克隆測

5、序的確無誤的基因序列經(jīng)常要用到克隆測序的方法，此外表達(dá)分析和方法，此外表達(dá)分析和functional screens 也經(jīng)常用于檢查基因的正確與否，但是這也經(jīng)常用于檢查基因的正確與否，但是這種方法只對蛋白的編碼區(qū)域有效，對其他種方法只對蛋白的編碼區(qū)域有效，對其他不表的區(qū)域無效。不表的區(qū)域無效。2) 對于長鏈對于長鏈DNA的合成一般是通過合的合成一般是通過合成長度小于成長度小于1kb的的BB，測序正確之后再，測序正確之后再把把BB連成長的基因連成長的基因.下面介紹一大類在下面介紹一大類在基因合成過程中排除錯誤的方法：用基因合成過程中排除錯誤的方法：用 MutS 錯誤不協(xié)調(diào)綁定蛋白消除錯誤；錯誤不

6、協(xié)調(diào)綁定蛋白消除錯誤； 用不協(xié)調(diào)切斷酶校正錯誤。作用機理如用不協(xié)調(diào)切斷酶校正錯誤。作用機理如圖所示圖所示2)2.1） MutS 蛋白是一種細(xì)菌的蛋白是一種細(xì)菌的 MutHLS 錯配修復(fù)器錯配修復(fù)器的一部分，它能夠識別并綁定各種錯配堿基。在變的一部分，它能夠識別并綁定各種錯配堿基。在變性和再次退火之后，錯誤包含在異源雙鏈核酸分子性和再次退火之后，錯誤包含在異源雙鏈核酸分子中，用中，用 MutS 蛋白把含有錯誤的鏈給綁定，通過凝蛋白把含有錯誤的鏈給綁定，通過凝膠電泳來分離。這種方法經(jīng)一次處理能使錯誤減小膠電泳來分離。這種方法經(jīng)一次處理能使錯誤減小到到1/3.5kb，其缺陷是需要其自身大量雙聯(lián)是正確

7、無，其缺陷是需要其自身大量雙聯(lián)是正確無誤的。對于錯誤多的可以采用以下方法，這種方法誤的。對于錯誤多的可以采用以下方法，這種方法叫叫consensus shuffling, DNA經(jīng)過退火后，加入限制經(jīng)過退火后，加入限制性內(nèi)切酶的混合物，然后加入到固載有性內(nèi)切酶的混合物，然后加入到固載有MutS 蛋白蛋白的筒形過濾器中，洗脫再做一個菌落的筒形過濾器中，洗脫再做一個菌落PCR即可消除即可消除錯誤。錯誤。MutS 錯誤不協(xié)調(diào)綁定蛋白消除錯誤錯誤不協(xié)調(diào)綁定蛋白消除錯誤核酸內(nèi)切酶2.1）2.2）用不協(xié)調(diào)切斷酶校正錯誤用不協(xié)調(diào)切斷酶校正錯誤 不協(xié)調(diào)切斷酶是說一類能夠在異源雙鏈核酸分子中識別和切斷錯配序列的

8、限制性內(nèi)切酶，它可以分為三類： 第一類是游離酶，例如：噬菌體T4內(nèi)切酶VII，T7內(nèi)切酶I，大腸桿菌核酸內(nèi)切酶V；第二類是錯配修復(fù)核酸內(nèi)切酶MutH ；第三類是單鏈特異性核酸酶，例如：S1核酸酶，P1核酸酶，綠豆核酸酶，CEL核酸酶。 游離酶的作用機制： The reannealed heteroduplexes are cleaved in both strands by mismatch-specific enzymes 25 bp downstream of the mismatches, generating stagger ends that are immediately diss

9、ociated at the reactiontemperature. The single-stranded overhangs that contain mismatch bases are degraded by an exonuclease in the reaction mixture. Full-length genes with fewer errors are recovered by overlap assembly PCR錯配修復(fù)核酸內(nèi)切酶MutH 大腸桿菌的MutH, MutL 和MutS 蛋白構(gòu)成的細(xì)菌錯配修復(fù)機制：首先是 MutS 檢出并綁定錯配堿基和 single-

10、strand loops，然后 MutH 和 MutL 一起作用于MutS 綁定的突變體，在兩股鏈不匹配 的地方產(chǎn)生切口，再通過解旋酶和外切酶的作用是錯配位點形成平末端。形成的缺口可以用聚合酶和連接酶補齊。單鏈特異性核酸酶 單鏈特異性的核酸酶在一定程度上非常專一性的作用特定的錯誤為類型，例如：SI和P1核酸酶能夠更有效作用于富含AT的區(qū)域，S1不能夠識別單個不匹配的堿基，而綠豆核酸酶在pH 66.5 的條件下能夠切除一定量單個堿基的突變。CEL核酸內(nèi)切酶是第一個從真核生物中發(fā)現(xiàn)的核酸內(nèi)切酶，它能夠作用于各種類型的堿基的錯配和DNA的畸變。 CEL核酸內(nèi)切酶作用機制： 錯配的堿基先通過CEL核酸

11、內(nèi)切酶切開和 再用Phusion DNA polymerase校正，這種方法非常適合于錯誤較多的合成序列。低質(zhì)量的合成序列經(jīng)過退火一般都會產(chǎn)生少量的無誤的雙鏈DNA， CEL核酸內(nèi)切酶在異源雙鏈核酸分子中緊挨著錯誤位點切開， Phusion DNA polymerase切掉錯誤的位點，最后無誤的DNA片段通過PCR組裝成全長的基因。steps: (i) reannealing of assembled gene constructs to present erroneous bases as mismatches; (ii) CEL nuclease cleavage on both strands at the 3 side of the mismatches; (iii) exonuclease trimming of single-stranded mismatch overhangs by added exonuclease or the 3-5 exonuclease activity of the proofreadin