淺論siRNA反向轉(zhuǎn)染法提高原代懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的應(yīng)用

1、淺論siRNA反向轉(zhuǎn)染法提高原代懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的應(yīng)用 【關(guān)鍵詞】 小干擾RNA； 反向轉(zhuǎn)染法； 正向轉(zhuǎn)染法； 原代細(xì)胞； 懸浮細(xì)胞RNA干擾（RNA interference, RNAi)是指小干擾RNA(small interference RNA,siRNA)進(jìn)入細(xì)胞后，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與靶mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)，進(jìn)而引發(fā)靶mRNA的降解、抑制靶基因的表達(dá)。RNAi因其對(duì)靶基因的沉默具有高度的特異性和強(qiáng)大的抑制作用正越來(lái)越多地被應(yīng)用于多種疾病的預(yù)防和治療研究1。siRNA必須進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)才能發(fā)揮對(duì)基因的沉默作用2，因此，如何將外源性siRNA高效地轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞就成為基因抑制成功與否的關(guān)鍵。

2、 基因轉(zhuǎn)染的方法很多,如磷酸鈣沉淀法、電穿孔、脂質(zhì)體法、顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒法等。 逆轉(zhuǎn)錄病毒是目前效率最高的轉(zhuǎn)染載體，但由于其價(jià)格昂貴，構(gòu)建耗時(shí)而不作為實(shí)驗(yàn)的首選。陽(yáng)離子脂質(zhì)體法是較方便的轉(zhuǎn)染方法之一 3，在各種體外培養(yǎng)細(xì)胞的RNA干擾實(shí)驗(yàn)中,多以陽(yáng)離子脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，但其對(duì)于原代懸浮細(xì)胞仍存在轉(zhuǎn)染效率低的問(wèn)題，故本實(shí)驗(yàn)在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下，運(yùn)用反向轉(zhuǎn)染法4和傳統(tǒng)正向轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染小鼠脾淋巴細(xì)胞，比較兩種方法的轉(zhuǎn)染效率，尋找對(duì)原代懸浮細(xì)胞更高效的基因轉(zhuǎn)染方法。 1 材料與方法 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 810周清潔級(jí) BALB/c 雌性小鼠（揚(yáng)州大學(xué)比較學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），小鼠淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊?/p>

3、制品科技有限公司），RPMI1640培養(yǎng)基，OptiMEM無(wú)血清液體培養(yǎng)基（Gibco公司），小牛血清（杭州四季青公司），Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen公司)，Cy3熒光標(biāo)記的siRNA片段（廣州銳博生物科技有限公司），24孔板（Corning公司）， 熒光倒置顯微鏡（Olympus公司），流式細(xì)胞儀（BD公司）。 1.2 研究方法斷頸處死小鼠，75%乙醇浸泡23 min,無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)取出脾臟，將200目無(wú)菌不銹鋼篩網(wǎng)置于60 mm平皿中，加入適量Hanks液，脾臟剪成碎塊置篩網(wǎng)內(nèi)，無(wú)菌玻璃注射器活塞輕柔研磨，使得分散的單細(xì)胞透過(guò)篩網(wǎng)進(jìn)入Hanks中；Fico

4、ll密度梯度離心法分離淋巴細(xì)胞，用PBS將所得細(xì)胞沉淀洗滌兩遍，重懸于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)及臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算活細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)共分為3組。實(shí)驗(yàn)組采用反向轉(zhuǎn)染法，每孔加Cy3siRNA 1.5 l至不含血清的OptiMEM簡(jiǎn)化培養(yǎng)基200 l中稀釋?zhuān)挥们皳u勻RNAiMAX, 取3 l至每孔中，與液輕柔混勻成為轉(zhuǎn)染復(fù)合物，室溫孵育20 30 min；用不含抗生素的RPMI1640完全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，每孔細(xì)胞懸液為400 l，整細(xì)胞數(shù)為（11.5）106，加入液中，輕微前后推動(dòng)平板使其混勻，每組設(shè)復(fù)孔。對(duì)照組按照傳統(tǒng)的正向轉(zhuǎn)染法操作，先將細(xì)胞在孔板中孵育24 h后再加入轉(zhuǎn)染復(fù)合

5、物，所加物質(zhì)用量及濃度與實(shí)驗(yàn)組完全相同?？瞻捉M未轉(zhuǎn)染siRNA細(xì)胞。將3組細(xì)胞均置于5 % CO2、37飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，于46 h后更換含10%小牛血清的完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后24 h每組細(xì)胞各取1106，分別用0.4 %的臺(tái)盼藍(lán)染色5 min后,隨機(jī)各選取3個(gè)視野,顯微鏡下計(jì)數(shù)所有細(xì)胞。以下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞活性=(總細(xì)胞數(shù)-著色細(xì)胞數(shù))/總細(xì)胞數(shù)100%。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染后24 h倒置顯微鏡下（1020）每組隨機(jī)取3個(gè)視野觀察各組細(xì)胞，從細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞膜完整性、細(xì)胞數(shù)目等方面評(píng)估生存狀態(tài)。轉(zhuǎn)染后24 h，熒光倒置顯微鏡觀察各組Cy3siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光攜帶率。Cy3為紅

6、色熒光標(biāo)記物，應(yīng)用Cy3siRNA轉(zhuǎn)染小鼠淋巴細(xì)胞后，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)紅色熒光的數(shù)量來(lái)判斷轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量5。于可見(jiàn)光下固定一個(gè)視野, 計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù), 轉(zhuǎn)換熒光光源計(jì)數(shù)攜帶紅色熒光的細(xì)胞數(shù),轉(zhuǎn)染效率有熒光表達(dá)的細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)100%, 每組選取3孔細(xì)胞，每孔細(xì)胞隨機(jī)選擇5個(gè)觀察視野，重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染后24 h實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各取 1106細(xì)胞，4 PBS洗細(xì)胞2次。流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)發(fā)紅色光的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。2 結(jié)果2.1 細(xì)胞活性測(cè)定 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h臺(tái)盼藍(lán)拒染率計(jì)算結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性為89.5%，對(duì)照組和空白組分別為84.5%和94.9%，3組之間細(xì)胞活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.0

7、5）。見(jiàn)圖1。 2.2 細(xì)胞生存狀態(tài)觀察 倒置顯微鏡下觀察比較轉(zhuǎn)染后24 h實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組之間細(xì)胞生存狀態(tài)，結(jié)果顯示3組無(wú)明顯差異。2.3 熒光顯微鏡下細(xì)胞熒光表達(dá)率 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)均可見(jiàn)紅色熒光，實(shí)驗(yàn)組帶有紅色熒光的細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組，空白組無(wú)熒光信號(hào)；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組經(jīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到平均轉(zhuǎn)染率分別為69.58%和39.83%，表明實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組轉(zhuǎn)染效率高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。見(jiàn)圖2，表1。表1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的轉(zhuǎn)染效率（略）2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染后24 h，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的Cy3siRNA對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率分別為63%和29%，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染效率明

8、顯高于對(duì)照組（P0.05）。見(jiàn)圖3。 3 討論 高效的siRNA轉(zhuǎn)染是研究基因沉默是否成功的前提。目前，RNAi由于轉(zhuǎn)染效率低而成為其發(fā)展的瓶頸并限制其進(jìn)一步應(yīng)用6。所以選擇最合適的轉(zhuǎn)染方法是整個(gè)實(shí)驗(yàn)非常重要的一步。siRNA轉(zhuǎn)染的方法很多，磷酸鈣沉淀法雖然操作簡(jiǎn)便，但轉(zhuǎn)染效率低，重復(fù)性差；電穿孔法適用于所有細(xì)胞，電壓越高，轉(zhuǎn)染效率越高，而細(xì)胞的存活率越低，成功的電穿孔均伴隨高水平的細(xì)胞毒性,因此其應(yīng)用受到了限制；DEAE葡聚糖多用于DNA分子的轉(zhuǎn)染，僅限于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，且一般只用于BSC1,CV1,COS細(xì)胞系；顯微注射法是用微吸管吸取siRNA溶液,在顯微鏡下準(zhǔn)確的插入細(xì)胞核中,將siRNA注

9、射進(jìn)去，轉(zhuǎn)染率高,對(duì)細(xì)胞無(wú)藥物毒害,但是技術(shù)要求高，操作繁瑣耗時(shí),工作效率低,裝置昂貴；陽(yáng)離子脂質(zhì)體在克服細(xì)胞屏障方面與病毒相似，容易透過(guò)細(xì)胞膜，而且操作簡(jiǎn)便，容易實(shí)施，在各種體外培養(yǎng)細(xì)胞的RNA干擾實(shí)驗(yàn)中得到了廣泛的應(yīng)用，但對(duì)于原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞仍存在轉(zhuǎn)染效率低的情況7；逆轉(zhuǎn)錄病毒法適用于各種細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率高，但構(gòu)建病毒載體耗時(shí)長(zhǎng)且價(jià)格昂貴，尤其不適合于有效片段的篩選實(shí)驗(yàn)8，并且需考慮安全因素。以上方法均有其優(yōu)缺點(diǎn)，通過(guò)對(duì)各種轉(zhuǎn)染方法的綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選用脂質(zhì)體為媒介轉(zhuǎn)染小鼠脾淋巴細(xì)胞，基于其在采用傳統(tǒng)正向轉(zhuǎn)染法時(shí)對(duì)原代懸浮細(xì)胞存在轉(zhuǎn)染效率較低的現(xiàn)象，我們應(yīng)用反向轉(zhuǎn)染法克服這一困難，把提高轉(zhuǎn)

10、染效率作為實(shí)現(xiàn)高效沉默靶基因的基礎(chǔ)。 轉(zhuǎn)染效率除了由轉(zhuǎn)染方法所決定外，轉(zhuǎn)染細(xì)胞狀態(tài)和siRNA劑量、轉(zhuǎn)染試劑的選擇、轉(zhuǎn)染復(fù)合物的孵育時(shí)間、培養(yǎng)液中血清和抗生素含量等也是影響轉(zhuǎn)染效率的重要因素。本實(shí)驗(yàn)在以上條件參數(shù)恒定和規(guī)范操作的基礎(chǔ)上，提取小鼠脾淋巴細(xì)胞，選用脂質(zhì)體Lipofectamine RNAiMAX介導(dǎo)轉(zhuǎn)染小鼠淋巴細(xì)胞，RNAiMAX比Lipofectamine2000細(xì)胞毒性小，轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞效果更好；并用熒光素Cy3標(biāo)記siRNA，使轉(zhuǎn)染情況在鏡下直接可見(jiàn),從而提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。反向轉(zhuǎn)染法與傳統(tǒng)正向轉(zhuǎn)染法的區(qū)別9 是傳統(tǒng)方法需在轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞鋪板，培養(yǎng)24 h后再加轉(zhuǎn)染復(fù)合物轉(zhuǎn)染

11、；而反向轉(zhuǎn)染則是先加入轉(zhuǎn)染試劑和siRNA混合物在培養(yǎng)板上共同溫育數(shù)十分鐘，然后加入細(xì)胞鋪板培養(yǎng)，其優(yōu)點(diǎn)在于：節(jié)約培養(yǎng)時(shí)間，淋巴細(xì)胞體外存活時(shí)間有限，可為轉(zhuǎn)染后檢測(cè)提供充足的時(shí)間和保持細(xì)胞良好的生存狀態(tài)；操作程序簡(jiǎn)便，避免傳統(tǒng)正向轉(zhuǎn)染方法培養(yǎng)條件的頻繁變化對(duì)細(xì)胞表達(dá)可能產(chǎn)生的影響；轉(zhuǎn)染效率高，對(duì)于原代懸浮細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染，從而使干擾效果比傳統(tǒng)方法更好。1小時(shí)即可完成轉(zhuǎn)染，快速、省時(shí)并且操作方便。實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)染后24 h臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)各組細(xì)胞活性、顯微鏡下觀察各組細(xì)胞生存狀態(tài)；從熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀兩方面檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。 在其他實(shí)驗(yàn)條件相同的情況下，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的轉(zhuǎn)染效率分別為66.5%和34.

12、5%，說(shuō)明反向轉(zhuǎn)染得到的RNA轉(zhuǎn)染效果比傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法更好，對(duì)于原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞這一類(lèi)難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞也能得到較為理想的轉(zhuǎn)染效果，值得一試。同時(shí)，轉(zhuǎn)染24 h后實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及空白組臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞活性分別為89.5%，84.5%和94.9%，顯微鏡下細(xì)胞生存狀態(tài)亦無(wú)明顯差異，提示該方法細(xì)胞毒性較低，操作過(guò)程對(duì)細(xì)胞損傷較小，對(duì)于原代懸浮細(xì)胞有著很好的應(yīng)用前景，為siRNA轉(zhuǎn)染原代懸浮細(xì)胞及應(yīng)用RANi技術(shù)進(jìn)行體外研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Bi F，Liu N，F(xiàn)an D. Small interfering RNA：a new tool for gene therapyJ. Curr G

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