植物組織培養(yǎng)中的細(xì)胞分化與器官建成

1、植物組織培養(yǎng)中的細(xì)胞分化與器官建成(一植物細(xì)胞的全能性植物細(xì)胞的全能性即是每個(gè)植物的本細(xì)胞或性細(xì)胞都具有該植物的全套遺傳基因,因此在一定培養(yǎng)條件下每個(gè)細(xì)胞都可發(fā)育成一個(gè)與母體一樣的植株。這個(gè)概念雖然在本世紀(jì)初已經(jīng)提出,但在當(dāng)時(shí)的技術(shù)條件下,在實(shí)踐上并沒做到,經(jīng)過幾十年來組織培養(yǎng)技術(shù)的不斷改進(jìn),目前細(xì)胞的全能性不但在理論上完全被證實(shí),而且為組織培養(yǎng)在實(shí)踐上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。植物細(xì)胞要表現(xiàn)出全能性,須經(jīng)過幾個(gè)步驟:成熟細(xì)胞分生細(xì)胞胚狀體完整植株。成熟細(xì)胞愈傷組織出根出芽完整植株。脫分化也就是已經(jīng)分化定型的細(xì)胞,經(jīng)過誘導(dǎo)成為重新恢復(fù)了分裂能力(也就是成為分生狀態(tài)細(xì)胞的過程。不但植物體細(xì)胞可以表現(xiàn)全能

2、性,花粉在培養(yǎng)條件下也可能進(jìn)行脫分化,通過愈傷組織或胚狀體發(fā)育成單倍體植株。植物細(xì)胞為什么表現(xiàn)出全能性呢?就要從動(dòng)物與植物細(xì)胞的區(qū)別說起。不論是植物、動(dòng)物還是微生物,其代謝的分子基礎(chǔ)基本是一樣的,從微生物到人,遺傳的信息是一致的。但動(dòng)物與植物細(xì)胞區(qū)別還是很大的這差別主要地在于:第一,自養(yǎng)與異養(yǎng)的差別。高等綠色植物是自養(yǎng)的,對(duì)營養(yǎng)的要求較簡(jiǎn)單,因此培養(yǎng)基的成分大部分為無機(jī)物和少量簡(jiǎn)單有機(jī)物。而高等動(dòng)物是需要多種復(fù)雜營養(yǎng)的異養(yǎng)生物,它們從復(fù)雜的來源中吸收、消化和同化其營養(yǎng),并通過血液將養(yǎng)分輸送到全身細(xì)胞和器官。第二,外界環(huán)境的差別。動(dòng)物細(xì)胞直接所處的內(nèi)部環(huán)境,以上對(duì)濃縮的形式來滿足其營養(yǎng)要求。植物

3、所處的環(huán)境變化大,它中收養(yǎng)分是以稀釋的狀態(tài)。植物細(xì)胞束縛在纖維素壁內(nèi),內(nèi)部液泡保持相當(dāng)穩(wěn)定的成分。植物細(xì)胞又以很大的能力維持著大的液泡、原生質(zhì)與外界培養(yǎng)基進(jìn)行物質(zhì)交換。第三,胚胎得到養(yǎng)分的方式不同。動(dòng)物的胚靠預(yù)先存在卵里的營養(yǎng)發(fā)育,靠胎座與母體聯(lián)系,植物的胚獲得營養(yǎng)方式相對(duì)地簡(jiǎn)單,胚存在于胚囊和胚株中,通過胚乳供應(yīng)胚的養(yǎng)分,原胚與子葉通過其外表面吸收養(yǎng)分。所以植物細(xì)胞誘導(dǎo)成胚從外部取得營養(yǎng)容易,不象動(dòng)物要通過血液。第四,器官發(fā)育的差別。動(dòng)物很早就開始器官發(fā)育,這些器官有高度特化的功能,然后靠血液循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、脊髓、大腦、激素把各器官連成整體。并且動(dòng)物器官的發(fā)育過程基本上只有一次,而高等植

4、物重復(fù)地產(chǎn)生器官而且是無限的。植物器官的發(fā)育是在生長區(qū)通過活細(xì)胞的活動(dòng),如頂端分生組織不斷產(chǎn)生葉、芽、花,在這些具有活細(xì)胞的部位,可取活細(xì)胞進(jìn)行移植和培養(yǎng)。誘導(dǎo)細(xì)胞的脫分化,需要許多外界條件。任何一個(gè)分化的細(xì)胞都具有保持分生組織狀態(tài)的潛勢(shì),不過它平常處于受抑制的狀態(tài),消除抑制作用就可以使細(xì)胞恢復(fù)分裂。在各種外界條件中,外源激素對(duì)脫分化起重要作用。有些植物的外植體僅需加入生長素(IAA吲哚乙酸, NAA萘乙酸,2,4-D即可誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂與生長,如菊苣;有的僅需加入加細(xì)胞激動(dòng)素類,如大豆、蘿卜;另一類需加生長素和細(xì)胞激動(dòng)素類,如煙草髓、胡蘿卜、馬鈴薯;還有一類不需加任何激素,如冠癭組織,煙草腫瘤

5、組織。(二組織的分化與器官建成1、維管組織的分化早期研究發(fā)現(xiàn)(Wetmore,1955,丁香的芽可以誘導(dǎo)鄰近的組織分化出維管束,后證明這是芽中IAA的作用。將一塊含有14C-IAA 和蔗糖的瓊膠楔形物插入到愈傷組織切口中, 14C-IAA表明蔗糖和IAA通過瓊膠擴(kuò)散到愈傷組織,從而在愈傷組織中造成這兩種物質(zhì)的梯度,在楔形物一頗有同感形成維管束的瘤狀物,瘤狀物含有一形成層帶,一面形成韌皮部,一面形成木質(zhì)部,與正常的維管束有類似的排列。增加IAA的濃度,導(dǎo)致木質(zhì)部形成,增加蔗糖濃度則導(dǎo)致韌皮部形成。生長素水平恒定時(shí),2%蔗糖則全部分化出木質(zhì)部,4%蔗糖幾乎全部分化出韌皮部,3%蔗糖則可以分化出二者

6、。所以,生長素和蔗糖濃度決定愈傷組織中維管束的類型與數(shù)量。Rier和Beslow進(jìn)一步報(bào)道,蔗糖不僅影響細(xì)胞的數(shù)目,而且影響其結(jié)構(gòu)。低濃度蔗糖(0.5%誘導(dǎo)出環(huán)紋和梯紋管胞,1.5-3.-5%蔗糖誘導(dǎo)出梯紋和網(wǎng)紋細(xì)胞。細(xì)胞分裂素類對(duì)促進(jìn)木質(zhì)部形成也有作用。它們使碳水化合物代謝趨向于五碳糖途徑,促進(jìn)木素前體苯丙烷的合成,不同的細(xì)胞分裂素作用不同。玉米素激動(dòng)素6-BA(6-芐基腺嘌呤,NAA/激動(dòng)素的比值為0.5/20時(shí)有木質(zhì)部發(fā)生和根形成,而比值降為0.025/0.4時(shí),只發(fā)生木質(zhì)部而不發(fā)生根,赤霉素(GA、乙烯、脫落酸對(duì)木質(zhì)部發(fā)生有抑制作用。2、根和芽的分化外植體誘導(dǎo)出愈傷組織后,經(jīng)過繼代培養(yǎng)

7、,可以在愈傷組織內(nèi)部形成一類分生組織(meristemoid即具有分生能較往年小細(xì)胞團(tuán),然后,再分化成不同的器官原基。有些情況下,外植體不經(jīng)愈傷組織而直接誘導(dǎo)出芽、根。所以器官發(fā)生有兩種方式,即直接和間接的。(1外植體器官發(fā)生(根、芽或胚狀體再生植株。(2外植體愈傷組織類分生組織根、芽再生植株。根是組織培養(yǎng)中易形成的器官,早在30年代,就看以胡蘿卜培養(yǎng)物中根的形成,以后又在多種植物中看到,同一植物不同器官可以誘導(dǎo)出根來:如棉花幼苗子葉、下胚軸切段、油菜葉片、葉柄、下胚軸等,多種植物愈傷組織也易生根。形成芽的培養(yǎng)基條件常有不同,有時(shí)芽與根可以同時(shí)在組織培養(yǎng)中形成,一般說,培養(yǎng)物中形成的芽如胡蘿卜

8、懸浮培養(yǎng),油菜愈傷組織等。在組織培養(yǎng)中通過根、芽誘導(dǎo)再生植株方式有三種:一種在芽產(chǎn)生之后,于芽形成的基部長根而形成小植株,一種是在根上生長出芽來,另一種即在愈傷組織的不同部位分別形成芽和根,然后兩者結(jié)合起來形成一株植物。除營養(yǎng)芽之外,在組織培養(yǎng)中有時(shí)也有花芽的形成,如煙草、花生等。也有變態(tài)器官的形成,如百合鱗片切塊分化出的芽,形成小鱗莖,唐菖蒲莖端可誘導(dǎo)形成小球莖,馬鈴薯的莖切段可以形成塊莖。植物激素的成分影響著器官建成,Skoog和Miller等所提出的生長素和激動(dòng)素比例決定根和芽分化的觀點(diǎn),曾被大量的試驗(yàn)結(jié)果所證明。在很多禾谷類作物的組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),用較高濃度的生長素(2,4-D誘導(dǎo)形成的

9、愈傷組織,當(dāng)培養(yǎng)在除去生長素,或適當(dāng)濃度的活性較低的生長素中時(shí),就可以誘導(dǎo)芽的形成。Nitsch等用Linsmaier(LM培養(yǎng)基附加10-5摩爾2,4-D培養(yǎng)水稻愈傷組織可以生根,一旦轉(zhuǎn)入無生長素的培養(yǎng)基時(shí)就能產(chǎn)生芽。Rangan將小米愈傷組織從含生長素的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到無生長素的培養(yǎng)基,一個(gè)星期內(nèi)就形成了芽。但在另一些例子中激素比例控制器官分化的問題則出現(xiàn)完全相反的情況。苜蓿在有2, 4-D和細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中,可以形成愈傷組織,轉(zhuǎn)入不加以上兩種激素的培養(yǎng)基中能分化,但分化的情況與原來的激素比例有關(guān)。如果愈傷組織是在高細(xì)胞分裂素/生長素比例的培養(yǎng)基中形成的,易于生根,而在高生長素/細(xì)胞分裂素

10、比例的培養(yǎng)基中形成的,易于生根,而在高生長素/細(xì)胞分裂素比例的培養(yǎng)基中形成的愈傷組織,則易生芽。由此看來,分化與激素的關(guān)系同植物的遺傳性有著密切的關(guān)系,用五個(gè)品種的煙草做實(shí)驗(yàn),用相同的生長素/細(xì)胞分裂素比例,結(jié)果有的品種形成很多芽,有的形成很少芽,有的完全不生芽。培養(yǎng)基的物理因素和外界條件對(duì)器官建成有一定影響。固體培養(yǎng)基有利于誘導(dǎo)愈傷組織,而液體培養(yǎng)基有利于細(xì)胞和胚狀體增殖。藍(lán)光有利于芽的分化,而紅光、遠(yuǎn)紅光對(duì)芽分化有抑制作用,但促進(jìn)根分化,紫光對(duì)生芽有刺激作用。石刁柏、虎耳草屬、鳳梨科植物分化前期需要低光強(qiáng)(1000勒克斯,后期要求高光強(qiáng)(3000-10000勒克斯,降低氧濃度促進(jìn)胡蘿卜愈傷

11、組織芽的形成,增加氧濃度促進(jìn)不定根形成。3、胚狀體是指在組織培養(yǎng)呂從一個(gè)非合子細(xì)胞,通過合子胚相似的胚胎發(fā)生過程所形成的胚狀結(jié)構(gòu)。從胚狀體可以形成完整的植株,這是植株細(xì)胞全能性的最強(qiáng)有力的一個(gè)證據(jù)。50年代末期,Steward等人從胡蘿卜的韌皮部用液體培養(yǎng)基通過游離細(xì)胞的分化,獲得了胚狀體。據(jù)統(tǒng)計(jì),在植物組織培養(yǎng)中具有胚狀體分化能力的種子植物已達(dá)117種,分屬43科, 75屬(見遺傳學(xué)報(bào)5卷1期,1980年。在植物組織組織培養(yǎng)中,誘導(dǎo)胚狀體與誘導(dǎo)芽相比較,具有顯著的優(yōu)點(diǎn),一是數(shù)量多,二是速度快,三是成苗率高。由于胚狀體具有這些優(yōu)點(diǎn),所以在育種工作及園藝工作中,可用胚狀體作為特定的優(yōu)良基因型個(gè)體的無性繁殖手段,同時(shí)在研究胚胎發(fā)育中也有很重要的理論意義。培養(yǎng)基的激素成分和氮源影響胚狀體的發(fā)生。有的植物可在無激素培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出胚狀體,如煙草、曼陀蘿、水稻、小麥花藥培養(yǎng);有的植物需要生長素與細(xì)胞分裂素的一定比例誘導(dǎo)胚狀體,如油茶、酸棗、桃等。石龍芮下胚軸,石刁柏愈傷組織,還有一些植物先在有激素的培養(yǎng)基上,然后轉(zhuǎn)入無激素培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體。有人證明培養(yǎng)基