泛素-蛋白酶體途徑的組成和功能

1、泛素-蛋白酶體途徑的組成和功能*倪曉光趙平(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所,北京100021摘要泛素-蛋白酶體途徑是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑,泛素分子主要通過泛素活化酶、泛素結(jié)合酶和泛素-蛋白連接酶與靶蛋白結(jié)合形成一條多泛素鏈,最后被26S蛋白酶體識(shí)別和降解。泛素-蛋白酶體途徑參與細(xì)胞內(nèi)的多種活動(dòng)過程,包括細(xì)胞凋亡、MHC I類抗原的遞呈、細(xì)胞周期以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),與細(xì)胞的一些生理功能和病理狀態(tài)有著密切的聯(lián)系。本文主要對(duì)組成泛素-蛋白酶體途徑的各成分作一綜述。關(guān)鍵詞泛素;蛋白酶體;泛素化;蛋白降解中圖分類號(hào)Q519;R329.2泛素-蛋白酶體途徑由泛素(ubiqui

2、tin,Ub、泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme,E1、泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzymes,E2s、泛素-蛋白連接酶(ubiquitin-protein ligases,E3s、26S蛋白酶體和泛素解離酶(deubiquitinating enzymes, DUBs等組成,其對(duì)靶蛋白的降解是一種級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程(圖1。泛素首先在E1催化下,其C-末端甘氨酸殘基與E1的半胱氨酸殘基間形成高能硫酯鍵而獲得活性。E1-泛素結(jié)合的中間體再將泛素轉(zhuǎn)移給E2,形成E2-泛素中間體。最后靶蛋白的泛素化還需要另一個(gè)特異的泛素蛋白連接酶E3s。E3

3、s可以直接或間接與底物結(jié)合,促使泛素從與E2s形成的硫酯中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到靶蛋白賴氨酸殘基的氨基基團(tuán)上,形成異肽鍵(isopeptide bond。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)泛素分子連接到靶蛋白上后,另外一些泛素分子在E3s的催化下相繼與底物相連的泛素分子的第48位賴氨酸殘基相連,形成一條多聚泛素鏈,作為底物被蛋白酶體識(shí)別和降解的靶向性信號(hào)。完成泛素化的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被展平進(jìn)入26S蛋白酶體,在20S催化中心中被降解,泛素分子可被DUBs從底物上水解下來,重復(fù)利用1。本文主要對(duì)組成泛素-蛋白酶體途徑的各成分作一綜述。圖1 蛋白質(zhì)經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑降解示意圖一、泛素(Ub泛素是1975年由Goldstein首先發(fā)現(xiàn)的一

4、種在真核生物細(xì)胞內(nèi)高度保守的多肽,單個(gè)泛素分子由76個(gè)氨基酸組成,分子量約8.5kD。泛素分子緊密折疊成球形,5股混合的片層形成一個(gè)腔樣結(jié)構(gòu),內(nèi)部對(duì)角線位置有1個(gè)螺旋,這個(gè)結(jié)構(gòu)稱為泛素折疊。這個(gè)小蛋白含有一個(gè)明顯的疏水核心和大量的氫鍵,表現(xiàn)出特殊的穩(wěn)定性,能夠防止在結(jié)合和靶向性降解循環(huán)中變性失活,從而保證泛素循環(huán)的運(yùn)行。從泛素折疊中突出來的是具有一定變形性的C 末端延伸部分,這個(gè)末端第76位含有一個(gè)必須的甘氨酸。泛素與其它蛋白都是通過C-末端第76位甘氨酸來連接的。二、泛素活化酶(E1E1是泛素與底物蛋白結(jié)合所需要的第一個(gè)酶,但是對(duì)靶蛋白的特異性卻幾乎沒有影響。E1是一種廣泛表達(dá)的多肽,大約1

5、100個(gè)氨基酸,含有位置固定的保守的半胱氨酸殘基。E1有2個(gè)亞型,是由同一個(gè)mRNA在不同的起始位點(diǎn)翻譯而成的,存在于細(xì)胞漿和細(xì)胞核中。酵母的E1基因失活后是致命的,說明這個(gè)蛋白對(duì)于細(xì)胞的生存是至關(guān)重要的(Stephen等.1996。E1可以水解ATP,與泛素的羧基末端形成高能硫酯鍵而激活泛素。在真核生物這個(gè)激活反應(yīng)由兩步構(gòu)成:起始形成泛素-腺苷酸中間物,接下來這個(gè)中間物與E1半胱氨酸殘基發(fā)生反應(yīng)形成E1-Ub硫酯鍵。通常一個(gè)泛素分子有一*國家自然科學(xué)基金(30500582和“十五”國家科技攻關(guān)計(jì)劃(2004BA703B11資助課題 個(gè)單獨(dú)的E1。E1具有高度的催化效能,在低濃度的情況下就能夠

6、激活泛素,滿足下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程(Pickart.2001。三、泛素結(jié)合酶(E2s級(jí)聯(lián)反應(yīng)的第二步是泛素分子經(jīng)過轉(zhuǎn)硫醇反應(yīng)從E1半胱氨酸殘基轉(zhuǎn)移給E2s活化的半胱氨酸位點(diǎn)。E2s在哺乳動(dòng)物中至少有25個(gè)基因,所有的E2s都含有一個(gè)保守的大約150個(gè)氨基酸的核心結(jié)構(gòu)域,在結(jié)構(gòu)域的中央是決定E2s活性的半胱氨酸殘基,位于蛋白表面淺的裂隙內(nèi)(Hamilton等. 2001。E2s家族中的一小部分成員只含有這個(gè)核心結(jié)構(gòu),但是其它的大部分成員還有N-或C-末端的延伸,這種結(jié)構(gòu)可能與E3s的識(shí)別、E2s自身的活性以及底物識(shí)別有關(guān)。E1和E3s通過相同的基序與E2s連接,這說明在反應(yīng)循環(huán)過程中,E2s必須在

7、E1和E3s之間穿梭往返運(yùn)行。因此為了保證在激活的泛素與數(shù)量巨大的E3s之間得到平衡的分布,需要多個(gè)E2s異構(gòu)體。E2s/Ub非共價(jià)結(jié)合的親和力非常低,說明其在轉(zhuǎn)移泛素分子到靶蛋白上起著重要的作用。四、泛素-蛋白連接酶(E3s泛素化途徑最重要的特征就是底物的多樣性和選擇性,這一功能由E3s直接決定。目前主要有3種類型的E3s,即含有HECT(homologous to E6-as-sociated protein carboxyl terminus結(jié)構(gòu)域的E3s、含有環(huán)指狀(RING finger結(jié)構(gòu)域的E3s和含有U-box 結(jié)構(gòu)域的E3s2。在高等生物E3的總數(shù)從幾百到一千以上,新的E3亞

8、家族仍不斷被發(fā)現(xiàn)。正是由于這些復(fù)雜多變的E3s家族成員可以對(duì)不同的底物進(jìn)行特異性的識(shí)別,才呈現(xiàn)出蛋白降解的高度選擇性。(一含有HECT結(jié)構(gòu)域的E3s HECT E3s的命名是因?yàn)槠銫-末端含有一段大約350個(gè)氨基酸的區(qū)域與E6-AP(E6-associated protein的C-末端同源。HECT E3s催化轉(zhuǎn)硫醇反應(yīng)將E2s中的泛素轉(zhuǎn)移給HECT結(jié)構(gòu)域內(nèi)的保守的半胱氨酸殘基。E6AP-HECT/UbcH7復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)顯示HECT 結(jié)構(gòu)域呈L形,活性位點(diǎn)位于L形的拐彎處(Huang 等.1999。游離的HECT結(jié)構(gòu)域與E2s有較強(qiáng)的相互作用,E2s結(jié)合位點(diǎn)位于L形基底部的末端。HECT結(jié)

9、構(gòu)域的缺失不影響底物的結(jié)合,高度可變的N末端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)對(duì)特異底物的識(shí)別和結(jié)合。(二含有環(huán)指狀結(jié)構(gòu)域的E3s 其特征是含有一個(gè)保守的組氨酸和半胱氨酸殘基復(fù)合體,在其中心有2個(gè)Zn2+離子。RING E3s沒有直接催化蛋白泛素化的作用,其作為一個(gè)?？课稽c(diǎn)將靶蛋白和E2s聚集在一起,然后介導(dǎo)泛素的轉(zhuǎn)移而不是與泛素形成硫酯鍵。含有環(huán)指狀結(jié)構(gòu)域的E3s可被分成2種類型,一種是單個(gè)蛋白,其代表是作為P53的E3s的MDM2(mouse double minute2癌蛋白(Hon-da等.2000以及作為受體酪氨酸激酶如表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EG

10、FR和血小板衍生因子受體(platelet-derived growth factor receptorE3s的c-Cbl(Tsygankov等.2001。另一種是多蛋白組成的復(fù)合體,包括SCF(Skp1-Cullin/ Cdc53-F-box-Rbx1、有絲分裂后期促進(jìn)復(fù)合物(an-aphase promoting complex,APC和VBC-Cul2復(fù)合體(the von-Hippel-Lindau-elongins B and C-Cul2 complex。SCF E3s是至少有4種多肽組成的復(fù)合體。被命名為SCF是因?yàn)槠渲械娜齻€(gè)核心亞基(Skp1、Cul-lin/CDC53和一個(gè)F

11、-Box蛋白。后來第四個(gè)亞基Rbx1(RING box1protein被發(fā)現(xiàn),其含有一個(gè)RING H2-型結(jié)構(gòu)域。在SCF E3s中的Rbx1能夠集合E2,Cullins蛋白作為Rbx1與蛋白之間的支架參與底物的選擇性。底物的識(shí)別由底物特異性的F-box蛋白所介導(dǎo),F-box本身被SCF E3s復(fù)合體中的Skp1接頭因子所識(shí)別和聚集。Skp1與Cullins結(jié)合,因此將底物和泛素并列排開。F-box蛋白的特征是含有一個(gè)大約40個(gè)氨基酸的基序,最初在細(xì)胞周期蛋白F中鑒定出來。人類含有大量的F-box蛋白,可以分成不同的亞類,在多數(shù)情況下F-box蛋白結(jié)合磷酸化的蛋白質(zhì)。如SCF E3s通過引起p

12、27和cdc25的快速降解來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期3。APC的核心顆粒至少含有13個(gè)亞基,最初發(fā)現(xiàn)在降解Cyclin的過程中起著重要作用。隨后研究發(fā)現(xiàn),其具有控制在有絲分裂進(jìn)展和結(jié)束過程中起著至關(guān)重要的一些因子的半衰期的功能4。APC中的2個(gè)亞基APC2和APC11分別與SCF E3s復(fù)合體中的Cullin1和Rbx1相關(guān),推測APC2可能具有連接其它亞基的作用,而APC11則具有結(jié)合Ub-E2s中間體的作用。von-Hippel Lindau(VHL腫瘤抑制因子蛋白E3復(fù)合體與SCF型復(fù)合體有所不同,其核心區(qū)有Rbx1和Cul2A結(jié)構(gòu),然而Skp1被轉(zhuǎn)錄延伸因子B/C所代替。轉(zhuǎn)錄延伸因子B/C復(fù)合體能

13、夠調(diào)節(jié)VHL與其它蛋白的相互作用,包括RNA聚合酶II延長因子A和細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子(suppressors ofcytokine signalling,SOCS盒裝蛋白。這種復(fù)合體與靶蛋白特異結(jié)合的方式雖然簡單,但是效率卻很高(Kim等.2003。(三含有U-box結(jié)構(gòu)域的E3s U-box E3s是一個(gè)相對(duì)較小的E3s家族,在結(jié)構(gòu)上與RING結(jié)構(gòu)域相似(Ohi等.2003,因此有的人將U-box E3s與環(huán)指狀結(jié)構(gòu)域的E3s歸為一類。在一些情況下多泛素鏈的形成還需要泛素鏈延長因子的輔助,人們將具有這類功能的酶命名為E4s。U-box家族成員具有E4s的特點(diǎn)。第一個(gè)被鑒定的E4s家族是

14、泛素融合降解蛋白(ubiquitin fusion degradation2,UFD2,其特征是C末端含有一個(gè)大約70個(gè)氨基酸的保守的U-box,在結(jié)構(gòu)上與RING-finger E3s相關(guān),能與含有13個(gè)泛素分子的底物結(jié)合,催化其它的泛素分子附加到底物上,形成含有多泛素鏈的底物。U-box 家族的另一個(gè)成員是與熱休克蛋白70碳末端相互作用蛋白(C terminus of Hsc70-interacting protein, CHIP,在降解途徑中作為泛素鏈延長因子與另外的E3s協(xié)同作用,能夠結(jié)合伴侶分子識(shí)別的異常或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì),導(dǎo)致他們被26S蛋白酶體所降解,是另一個(gè)含有U-box的具有

15、E4功能的蛋白質(zhì)。目前還不清楚是否含有U-box結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)都具有E4s的活性5。(四E3s與靶蛋白多聚泛素鏈的形成靶蛋白的泛素鏈最少需要四個(gè)泛素分子的長度才能夠被蛋白酶體有效降解。關(guān)于靶蛋白的泛素鏈?zhǔn)侨绾涡纬傻倪€不清楚,推測可能存在以下4種模型6:(1有序增加模型(sequential addition model也稱為標(biāo)準(zhǔn)模型,即E3通過不同的結(jié)構(gòu)域(如RING E3s與E2和底物結(jié)合,形成E2-E3-底物復(fù)合體,E3促使與E2連接的泛素分子直接轉(zhuǎn)移到底物的賴氨酸殘基,然后E2-E3-底物復(fù)合體中的E2再接受來自E1分子傳遞的新的泛素分子,在E3的作用下將泛素分子直接轉(zhuǎn)移到與底物相連的第

16、一個(gè)泛素分子,接下來循環(huán)此過程,完成靶蛋白泛素鏈的組裝;(2指數(shù)模型(indexation model是指在形成E2-E3-底物復(fù)合體后,E2上的第一個(gè)泛素分子首先與E3s的HECT結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸活化位點(diǎn)結(jié)合,然后依次在此位置形成一條泛素鏈,最后泛素鏈從E3上轉(zhuǎn)移到底物的賴氨酸殘基;(3秋千模型(seesaw model是指E3與2個(gè)E2和底物形成復(fù)合體后,泛素鏈的組裝發(fā)生在2個(gè)E2的活化位點(diǎn)上,即一個(gè)E2上的泛素分子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)E2上后,新轉(zhuǎn)移過來的泛素位于最底層直接與E2連接的位置,而原來與E2直接連接的泛素則與新轉(zhuǎn)移過來的泛素相連,依此從后向前的方式形成一條泛素鏈,最后泛素鏈直接從E2

17、轉(zhuǎn)移到底物上;(4雜和模型(hybrid model是指E2-E3-底物復(fù)合體形成后,E2上的泛素分子首先轉(zhuǎn)移到E3上,在E3上形成一條泛素鏈,然后泛素鏈按照E3&E1&E2&底物的傳遞順序連接到靶蛋白上。不同的E3s可能通過不同的機(jī)制組裝靶蛋白的多泛素鏈。五、泛素解離酶(DUBs雖然泛素與細(xì)胞內(nèi)快速降解的蛋白連接在一起,但是其本身卻是長壽命蛋白,這是由于泛素蛋白偶連物在水解之前DUBs將泛素從底物上解離下來。DUBs屬于蛋白酶超家族,根據(jù)其催化機(jī)制,可以分為5類(天門冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶,生物信息學(xué)研究顯示大約有79個(gè)有

18、功能的DUBs7,其中大部分為半胱氨酸蛋白酶。DUBs能夠識(shí)別最接近的泛素基序,特異性地在泛素和與其C末端最后一個(gè)殘基(Gly76相連的分子之間斷開(Amerik等. 2004。半胱氨酸蛋白酶型DUBs根據(jù)泛素-蛋白酶結(jié)構(gòu)域又可分為4個(gè)亞類:泛素特異性蛋白酶(USP、碳末端水解酶(UCH、卵巢腫瘤蛋白酶(OTU和MJD蛋白酶。金屬蛋白酶型DUBs的泛素-蛋白酶結(jié)構(gòu)域稱為JAMM(JAB1/MPN/Mov34 metalloenzyme(Amerik等.2004。半胱氨酸蛋白酶的活性信賴于活性位點(diǎn)中的一個(gè)半胱氨酸的硫醇基團(tuán)。這個(gè)半胱氨酸在鄰近組蛋白的輔助下去質(zhì)子化,在一個(gè)天門冬氨酸殘基的作用下產(chǎn)

19、生極性,這三個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成催化三聯(lián)體。在催化過程中,半胱氨酸表現(xiàn)出親質(zhì)子作用,攻擊靶蛋白與泛素之間易斷裂肽鍵的羰基端,結(jié)果將靶蛋白釋放出來,泛素與UDBs形成一個(gè)共價(jià)連接的中間體。中間體與水分子反應(yīng)釋放出游離的酶和泛素。六、26S蛋白酶體26S蛋白酶體是降解泛素化底物的一個(gè)ATP依賴型蛋白水解復(fù)合體,由20S核心蛋白酶(core pro-tease,CP和19S調(diào)節(jié)顆粒(regulatory particle,RP構(gòu)成。CP是由4個(gè)七聚體蛋白組成的環(huán)層疊在一起形成的一個(gè)空心圓柱體樣結(jié)構(gòu)(1-71-71-71-7,是26S蛋白酶體的水解核心。活性位點(diǎn)位于20S圓柱體空心結(jié)構(gòu)中心的2個(gè)環(huán)上,含有

20、胰蛋白酶、糜蛋白酶和谷氨酰樣肽水解活性,具有能夠使大多數(shù)肽鍵斷裂的能力(Voges等.1999。2個(gè)亞基的氨基末端封住蛋白水解腔隙的入口,對(duì)蛋白酶體CP的活性具有自身抑制作用,這樣只有進(jìn)入蛋白酶體圓柱體內(nèi)部的蛋白才能夠被水解。RP由基底(Base和蓋子(Lid兩個(gè)亞單位組成,分別與CP兩端的環(huán)相結(jié)合。基底亞單位是由6個(gè)相關(guān)的AAA-ATPases RPT1-6(regulatory particle triple-A protein和3個(gè)non-ATPase RPN(regulatory particle non-ATPase1、2和10組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu),能夠活化20S核心顆粒(Glickman

21、等.1998。蓋子亞單位含有其余的non-ATPase(RPN3、5-9、11和12,是泛素依賴性蛋白降解所必須的(Fu等.2001。靶蛋白進(jìn)入蛋白酶體需要底物傳送蛋白的輔助,這些蛋白含有UBL或UBX(ubiquitin-like pro-tein和UBA(ubiquitin-associated結(jié)構(gòu)域,包括Rad23(radiation gene23、Dsk2(dominant suppressor of Kar2、Ddi1(DNA damage molecule-1和Shp1/ p47。Rad23、Dsk2和Ddi1的UBL結(jié)構(gòu)域能夠直接與26S蛋白酶體相互作用,然而Shp1/p47的U

22、BX 結(jié)構(gòu)域能夠與Cdc48/p97相互作用,通過Cdc48/ p97與蛋白酶體聯(lián)系在一起。目前多數(shù)的泛素化底物通過與RPN1/S2結(jié)合進(jìn)入蛋白酶體。另外,泛素化的靶蛋白能夠直接與RPN10/S5a和ATPase5 (RPT5/S6'/S6a結(jié)合。RPT5/S6'/S6a ATPase也能夠與VHL E3s中的VHL結(jié)合,因此底物與蛋白酶體的結(jié)合有許多直接和間接的機(jī)制。這些不同的機(jī)制為多種蛋白在蛋白酶體中提供了選擇性降解過程8。綜上所述,RP輔助識(shí)別和伸展適當(dāng)?shù)牡孜?裂解與Ub連接的共價(jià)鍵,開放-環(huán),然后伸展開的多肽直接進(jìn)入CP的腔內(nèi)被斷裂成6-10個(gè)氨基酸長度的片斷,最后在胞

23、漿中被水解成單個(gè)氨基酸。七、結(jié)語泛素-蛋白酶體途徑是細(xì)胞內(nèi)ATP依賴的蛋白質(zhì)選擇性降解的主要途徑,是真核細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)質(zhì)控系統(tǒng),參與細(xì)胞凋亡、MHC I類抗原的遞呈、細(xì)胞周期以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理過程,對(duì)維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)具有十分重要的意義9。該途徑在20世紀(jì)80年代初期首先被Avram Hershko、Aaron Ciechanover和Irwin Rose等幾位科學(xué)家所認(rèn)識(shí),三人以此項(xiàng)成果共享2004年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。經(jīng)過30年的研究,人們對(duì)泛素-蛋白酶體途徑的組成和在生物體內(nèi)的功能有了深刻的認(rèn)識(shí),但是這遠(yuǎn)遠(yuǎn)還不夠,還有許多問題未被闡明,如E3s的組成及是如何被調(diào)節(jié)的?多聚泛素鏈?zhǔn)侨绾?/p>

24、聚集的?細(xì)胞是如何操作讓不同長度的泛素鏈修飾不同的蛋白質(zhì)? 26S蛋白酶體RP各個(gè)亞基的功能是什么?泛素-蛋白酶體途徑功能失常已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與多種疾病有重要的關(guān)系,已有研究顯示針對(duì)失常的關(guān)鍵環(huán)節(jié)設(shè)計(jì)藥物或基因的靶標(biāo),對(duì)疾病的治療起到了良好的效果10。相信隨著技術(shù)手段的進(jìn)步,泛素-蛋白酶體途徑會(huì)逐漸被揭示,從而豐富人們對(duì)人體生理狀態(tài)的了解和對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)。參考文獻(xiàn)1 Smalle J,Vierstra RD.The ubiquitin26S proteasome prote-olytic pathway.Annu Rev Plant Biol,2004,55"555 590.2 Robinson PA,Ardley HC.Ubiquitin-protein ligases.J CellSci,2004,117"51915194.3 Zheng N,Schulman BA,Song L,et al.Structure of theCul1-Rbx1-Skp1-F boxSkp2SCF ubiquitin ligase complex.Nature,2002,416"703709.4 Passmore LA,Booth CR,Venien-Bryan C,et al.Structuralanaly