治療劑量高壓氧對(duì)胎鼠及新生鼠視網(wǎng)膜血管的影響

1、治療劑量高壓氧對(duì)胎鼠及新生鼠視網(wǎng)膜血管的影響    【摘要】  目的: 探討臨床治療劑量高壓氧（HBO）對(duì)胎鼠及新生鼠視網(wǎng)膜的影響. 方法: SD新生大鼠，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)13組、對(duì)照組（常壓空氣組）及ROP模型組各5只，實(shí)驗(yàn)1組于孕鼠分娩前單純予治療劑量的HBO 5 d（2ATA， 800 mL/L O2，1 h）、實(shí)驗(yàn)2組新生大鼠不僅予宮內(nèi)HBO，且出生后7 d起繼續(xù)HBO 5 d、實(shí)驗(yàn)3組僅予新生鼠7 d HBO（2ATA， 800 mL/L O2，1 h）連續(xù)5 d；對(duì)照組置于常壓空氣中；ROP模型組第7 d常壓吸氧（800 mL/L）5

2、d，然后吸空氣. 全部新生大鼠于17 d制作視網(wǎng)膜組織切片，計(jì)數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的細(xì)胞核數(shù)目及免疫組織化學(xué)方法測定血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在視網(wǎng)膜的表達(dá). 結(jié)果: 實(shí)驗(yàn)13組突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的細(xì)胞核數(shù)目與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）,ROP模型組與對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)13組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（37.9±6.1 vs 1.4±0.9, 1.6±1.1, 1.4±0.8, P<0.01）. 實(shí)驗(yàn)各組及對(duì)照組的VEGF的表達(dá)均以弱陽性為主，均弱于ROP模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）. 結(jié)論: 臨床治療劑量高壓氧對(duì)胎鼠

3、及新生鼠視網(wǎng)膜無影響. 【關(guān)鍵詞】  高壓氧 ；早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜?。谎軆?nèi)皮生長因子； 視網(wǎng)膜血管 ； 動(dòng)物模型     0引言    近年來，高壓氧作為一種較新的治療手段走上了圍產(chǎn)科治療的舞臺(tái)，在胎兒生長受限、胎兒宮內(nèi)窘迫以及預(yù)防新生兒缺血缺氧性腦病等方面頗有療效1-2. 然而治療劑量的HBO帶給組織器官的高氧濃度是否會(huì)引起胎兒尚未成熟的視網(wǎng)膜發(fā)生氧毒性損傷，導(dǎo)致新生兒發(fā)生早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜?。╮etinopathy of prematurity, ROP）一直是國內(nèi)外擔(dān)心的問題，目前大多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為HBO治療對(duì)視力無影響，

4、但其結(jié)論多僅通過眼科隨訪獲得1. 我們通過模擬臨床HBO對(duì)圍產(chǎn)兒的治療情況，通過計(jì)數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的細(xì)胞核數(shù)目及VEGF的表達(dá)來探討治療劑量高壓氧對(duì)胎鼠及新生鼠視網(wǎng)膜的影響.    1材料和方法    1.1材料SD成年雌鼠40只，雄鼠20只，由廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，按21同籠. 每天早晨檢查陰道涂片，用沾有生理鹽水的棉簽取陰道分泌物，涂抹到預(yù)先放有生理鹽水的載波片上，鏡檢發(fā)現(xiàn)精子，算為孕期的第零天. 選擇受孕的20只孕鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（HBO組，n=10）和常壓空氣組（n=10）. 醫(yī)用多人空氣加壓艙，型號(hào)NG280?900，浙

5、江寧波高壓氧艙總廠制造.    1.2方法實(shí)驗(yàn)組孕鼠于妊娠16 d進(jìn)入高壓氧艙內(nèi)，置于密閉塑料氣囊中，由測氧儀監(jiān)控氣囊內(nèi)氧濃度達(dá)800 mL/L，氧艙壓力0.2 MPa(表壓)，加壓1015 min，穩(wěn)壓期60 min，緩慢減壓1015 min出艙，其后打開氣囊，暴露于正?？諝庵?，每天1次，連續(xù)5 d. 常壓空氣組孕鼠只置于常壓空氣中. 全部孕鼠于21 d分娩，HBO組母鼠所產(chǎn)新生存活大鼠隨機(jī)選擇10只分配到實(shí)驗(yàn)1組（n=5）和實(shí)驗(yàn)2組（n=5）. 常壓空氣組母鼠所產(chǎn)新生存活大鼠隨機(jī)選擇15只分配到實(shí)驗(yàn)3組（n=5）、對(duì)照組（n=5）及ROP模型組（n=5），期間

6、如有新生鼠死亡，則另外選取妊娠大鼠補(bǔ)充. 實(shí)驗(yàn)1,3組新生大鼠于出生7 d起置于HBO下1 h（2ATA，800 mL/L O2），連續(xù)5 d后置于常壓空氣中5 d；實(shí)驗(yàn)2組及對(duì)照組新生大鼠置于常壓空氣中. ROP模型組新生大鼠按Smith提供的方法建立ROP模型：將7 d的大鼠先置800 mL/L O2中飼養(yǎng)5 d，然后在空氣中繼續(xù)飼養(yǎng).    統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用方差分析及LSD?t檢驗(yàn)比較各組突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的細(xì)胞核數(shù)目，VEGF的表達(dá)采用等級(jí)資料表示，利用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.     2結(jié)果  &

7、#160; 2.2視網(wǎng)膜中VEGF的表達(dá)實(shí)驗(yàn)各組、對(duì)照組及ROP模型組均有VEGF的棕黃色顆粒，主要位于內(nèi)叢狀層和內(nèi)核層毛細(xì)血管及內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，但實(shí)驗(yàn)各組及對(duì)照組的VEGF的表達(dá)以弱陽性為主（圖1A,B），均明顯弱于ROP模型組（圖1C,D），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=2.0, P=0.000，表1）.    3討論    現(xiàn)已明確與ROP發(fā)生相關(guān)的三大高危因素為早產(chǎn)、低體重及氧療4. 由于胎兒及早產(chǎn)兒未成熟的視網(wǎng)膜血管對(duì)氧特別敏感，吸入高濃度的氧可刺激視網(wǎng)膜血管收縮和閉塞，正常發(fā)育中的視網(wǎng)膜血管停止生長，已存在的血管慢慢關(guān)閉. 當(dāng)

8、停止高濃度氧吸入時(shí)，低氧又刺激新生血管形成，異常血管增生和擴(kuò)張，新生血管出現(xiàn)了形態(tài)上的異常而且缺乏正常的血管屏障特性，最終發(fā)展為視網(wǎng)膜病，導(dǎo)致新生兒失明5. 我們采用SD大鼠，在其胎齡16 d起（相當(dāng)于人類孕晚期）予HBO 5 d；新生大鼠7 d眼球發(fā)育相當(dāng)于人類的早產(chǎn)兒期，此時(shí)是進(jìn)入高氧環(huán)境的最佳時(shí)間,大鼠視網(wǎng)膜血管尚未發(fā)育成熟,高氧刺激后可產(chǎn)生血管增生性改變,而這一時(shí)期大鼠的玻璃體血管基本退行,可最大限度減少計(jì)算視網(wǎng)膜血管增生時(shí)出現(xiàn)的誤差. 在本研究中實(shí)驗(yàn)1組孕鼠于分娩前單純予治療劑量的HBO 5 d（2ATA， 800 mL/L O2，1 h）、實(shí)驗(yàn)2組新生大鼠不僅予宮內(nèi)HBO，且出生后

9、7 d起繼續(xù)HBO 5 d,實(shí)驗(yàn)3組僅予新生鼠HBO，因而此3組均存在產(chǎn)生ROP的可能性，但應(yīng)以實(shí)驗(yàn)2組最大，因其在胎兒期及新生兒期均接受了HBO，結(jié)果顯示3組新生大鼠 17 d時(shí)，其突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮數(shù)與正常對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這與Calvert等6的研究一致.    ROP的發(fā)生是眾多血管因子相互作用和調(diào)節(jié)的結(jié)果，其中VEGF在血管生成的過程中起著中心調(diào)控作用，是啟動(dòng)新生血管形成所必須的最重要及最有效的物質(zhì). VEGF參與調(diào)節(jié)正常視網(wǎng)膜血管化過程,羅先瓊等7研究發(fā)現(xiàn)，空氣對(duì)照組小鼠未成熟視網(wǎng)膜生后7 d是視網(wǎng)膜血管發(fā)育最活躍的時(shí)期，此時(shí)VEGF表達(dá)最強(qiáng)

10、；生后14 d，視網(wǎng)膜血管發(fā)育近成熟時(shí)，VEGF的表達(dá)信號(hào)明顯減弱. 而在出生7 d接受高氧的ROP組，VEGF僅有弱表達(dá)，生后14 d，即停止吸氧后ROP發(fā)生過程中，視網(wǎng)膜血管異常增生活躍，VEGF表達(dá)增強(qiáng). 本研究亦表明ROP組VEGF表達(dá)較其他各組均明顯增強(qiáng)，說明VEGF表達(dá)水平的變化與視網(wǎng)膜血管發(fā)育及ROP血管變化具有重要關(guān)系，VEGF是導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管變化的重要因素,同時(shí)從發(fā)病機(jī)制上也進(jìn)一步表明治療劑量HBO對(duì)胎鼠及新生小鼠視網(wǎng)膜無明顯影響. 【參考文獻(xiàn)】  1 肖小敏，王彥林，龍穎，等.高壓氧治療晚發(fā)型胎兒生長受限 J.中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志， 2003,11(6):3

11、59-362.2 胡電，洪新如，古航. 高壓氧預(yù)處理對(duì)宮內(nèi)缺血缺氧大鼠腦組織及血漿神經(jīng)膚Y含量的影響J.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2004，1（13）：14-15.3 石文靜，陳超,周國民,等.高氧誘導(dǎo)新生鼠視網(wǎng)膜病變的實(shí)驗(yàn)研究J.中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志，2004，7（3）：168-170.4 中華醫(yī)學(xué)會(huì).早產(chǎn)兒治療用氧和視網(wǎng)膜病變防治指南J.中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志，2006，11（6）：363-364.5 Chen J, Smith LE. Retinopathy of prematurityJ. Angiogenesi,2007，10(2):133-140.6 Calvert JW, Zhou C, Zhang JH. Transient exposure of rat pups to hyperoxia at normobaric and