扁穗牛鞭草種質(zhì)遺傳多樣性的ISSR分析

1、扁穗牛鞭草種質(zhì)遺傳多樣性的ISSR分析范彥1,2，李芳1，張新全1* ，馬嘯1（1. 重慶市畜牧科學(xué)研究院 重慶 400039；2 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系，四川 雅安 625014.）摘要：用ISSR標(biāo)記對(duì)來(lái)自中國(guó)西南地區(qū)(四川、重慶、貴州)的28份扁穗牛鞭草材料的遺傳多樣性進(jìn)行了檢測(cè)。從96個(gè)ISSR引物中共篩選出13個(gè)多態(tài)性明顯、反應(yīng)穩(wěn)定的引物，對(duì)28份材料DNA共擴(kuò)增出129條譜帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出9.9條帶，多態(tài)性條帶比率達(dá)84.2%。材料間遺傳相似系數(shù)在0.4660.98之間，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。通過(guò)聚類分析和主成分分析，將28份扁穗牛鞭草分為兩大類，同一地區(qū)的扁穗牛鞭草品種(

2、系)基本聚在同一類，呈現(xiàn)出一定的地域性分布規(guī)律?；痦?xiàng)目：重慶市自然科學(xué)基金（CSTC,2006BA1022）；教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃”(NCET-04-0909)。作者簡(jiǎn)介：范彥（1973-），男，四川樂(lè)山人，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀博士，研究方向：牧草與草坪草種質(zhì)資源及育種。E-mail:cq_fy001；Tel：02346792513關(guān)鍵詞：扁穗牛鞭草；種質(zhì)；ISSR；遺傳多樣性分析Genetic Diversity of Hemarthria compressa Germplasm Detected by Inter-simple Sequence Repeat (ISSR)FAN Y

3、an1,2, LI Fang1，ZHANG Xin-Quan1*, MA Xiao1（1. Department of Grassland Science, Sichuan Agricultural University, Sichuan Yaan 625014，China）（2. Chongqing Municipal Institute of Animal Husbandry Chongqing 400039, China）Abstract: Inter-simple sequence repeat (ISSR) method was applied to detect genetic v

4、ariation of 28 Hemarthria compressa accessions from Southwest China (Sichuan Province, Chongqing City and Guizhou Province). Thirteen primers were selected from 96 ISSR primers, and 129 DNA fragments were amplified from 28 samples. Of which, 110 fragments were polymorphic (percentage of polymorphic

5、bands was 84.2%), and the average number of DNA bands was 9.9 per primer. The genetic similarity among all accessions ranged from 0.466 to 0.98, which indicated that the genetic diversity was comparatively rich among the tested accessions. UPGMA cluster based on genetic similarity and principle comp

6、onent analyses (PCoA) based on band patterns divided the accessions into two groups corresponding to their geographical sources. Key words: Hemarthria compressa; Germplasm；ISSR; Genetic diversity analysis牛鞭草屬(Hemarthria R.Br.)植物主要分布在熱帶、亞熱帶及北半球的溫帶濕潤(rùn)地區(qū)，我國(guó)有4個(gè)種和1個(gè)變種，即:扁穗牛鞭草H.compressa(L.F.)R.Br.、牛鞭草H. A

7、ltissima (Poir) Stapfet C. E. Hubb.、長(zhǎng)花牛鞭草H. Longiflora (Hook.f.) A.Canus、小牛鞭草(H.protensa Steud.)及變種族穗牛鞭草H.compress var.fasciculate(Lam.)Keng，其中分布最廣的是扁穗牛鞭草1。扁穗牛鞭草為多年生匍匐性禾草，主要靠地上莖繁殖，是一種生長(zhǎng)期長(zhǎng)、生長(zhǎng)速度快、再生力強(qiáng)和產(chǎn)量高的常年青綠優(yōu)良飼草2。在長(zhǎng)江流域，野生扁穗牛鞭草分布相當(dāng)廣泛，且存在多種生態(tài)類型。因其綠期長(zhǎng)、固土力強(qiáng)且耐粗放管理，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和抗逆性，也可作為水土保持植物和草坪草開(kāi)發(fā)利用，對(duì)長(zhǎng)江流域退耕還

8、草、種草養(yǎng)畜、水土保持及環(huán)境綠化等均具有重要意義，是熱帶、亞熱帶建植人工草地、南方草山草坡改良的優(yōu)良草種3。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)牛鞭草屬植物的研究主要集中在細(xì)胞學(xué)、抗逆性和適應(yīng)性、侵占性、獨(dú)居和化感作用等方面，而在種質(zhì)遺傳多樣性方面的研究報(bào)道較少48。1994年由Zietkiewicz9等創(chuàng)建的ISSR(Inter-simple sequence repeat)分子標(biāo)記技術(shù)克服了RAPD標(biāo)記穩(wěn)定性差、RFLP技術(shù)費(fèi)用高、AFLP技術(shù)操作繁瑣和SSR技術(shù)預(yù)先根據(jù)其靶序列設(shè)計(jì)引物等缺點(diǎn)，其重復(fù)性和穩(wěn)定性好10，已被廣泛用于品種鑒定11、種質(zhì)遺傳多樣性分析1214、指紋圖譜構(gòu)建15等研究中。本試驗(yàn)運(yùn)用IS

9、SR標(biāo)記對(duì)我國(guó)西南區(qū)28份扁穗牛鞭草資源的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，旨在明確ISSR標(biāo)記在扁穗牛鞭草品種鑒定和種質(zhì)遺傳多樣性研究中的作用，為我國(guó)扁穗牛鞭草種質(zhì)的合理利用及新品種選育提供理論依據(jù)。1 材料與方法1.1 供試材料 材料為西南區(qū)收集的的28份優(yōu)良扁穗牛鞭草無(wú)性系 (表1)。其中，“重高”和“廣益”是四川農(nóng)業(yè)大學(xué)杜逸等1987年利用無(wú)性系重復(fù)選育，從野生扁穗牛鞭草中選育的直立型扁穗牛鞭草品種16。表1 扁穗牛鞭草材料編號(hào)及來(lái)源Table 1 Sampled locations and habitant of Hemarthria compressa編號(hào)NO.名稱name采集地點(diǎn)Collec

10、tion Location海拔Altitude(m)編號(hào)NO.名稱name采集地點(diǎn)Collection Location海拔Altitude(m)1YA2002-2四川洪雅陽(yáng)坪Hong Ya County Sichuan province41615H029四川寧南Nin Nan County Sichuan province6502YA2002-4四川洪雅陽(yáng)坪Hong Ya County Sichuan province41616H031重慶李子壩Li Zi Ba Chong Qing Province2603YA2002-5四川洪雅陽(yáng)坪Hong Ya County Sichuan provi

11、nce41617H033重慶萬(wàn)州WanZhou County Chong Qing Province4904YA2003-1四川洪雅陽(yáng)坪Hong Ya County Sichuan province41618H035重慶梁平Liang Pin County Chong Qing Province4005YA2003-2四川洪雅陽(yáng)坪Hong Ya County Sichuan province41619H040重慶墊江DianJiang County Chong Qing Province4106YA2003-3四川洪雅陽(yáng)坪Hong Ya County Sichuan province41620

12、H042貴州獨(dú)山Du Shan County Gui Zhou Province9307YA2003-4四川雅安Ya An County Sichuan province41621H043貴州獨(dú)山Du Shan County Gui Zhou Province9508YA2003-5四川雅安Ya An County Sichuan province41622H047貴州荔波Li Bo County Gui Zhou Province3709YA2003-6四川雅安Ya An County Sichuan province41623H053四川寧南Nin Nan County Sichuan p

13、rovince110010H001四川大渡河Da Du River Sichuan province50024H054四川自貢Zi Gong County Sichuan province64011H002四川雅安Ya An County Sichuan province41625H055四川自貢Zi Gong County Sichuan province62012H016四川眉山Mei Shan County Sichuan province46526H065四川雅安Ya An County Sichuan province41613H019四川草壩Cao Ba County Sichua

14、n province48027廣益Guang Yi四川雅安Ya An County Sichuan province41614H026四川寧南Nin Nan County Sichuan province120028重高Chong Gao重慶Chong Qing Province600注：編號(hào)為1、2、3、4、5、6、7、8、9的材料為“廣益” 扁穗牛鞭草品種的選系Note: Codes 1-6 and codes 7-9 are the excellent clone strains from cultivar Guangyi.1.2 DNA提取 取生長(zhǎng)良好的扁穗牛鞭草幼嫩植株的葉片，參照S

15、aghai-Maroof M A等(1998)的CTAB17方法提取DNA。1.3 ISSR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化本試驗(yàn)參考了地毯草（Axonopus compressus (Sw.) Beauv）18、鴨茅（Dactylis glomerata）19的ISSR擴(kuò)增程序和反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4預(yù)變性5min；94變性45s，52退火60s，72延伸90s,45個(gè)循環(huán)；72延伸7min，4保存。并對(duì)反應(yīng)體系各組份進(jìn)行了梯度PCR試驗(yàn)，所得20L優(yōu)化反應(yīng)體系為：Mg2+ 1.625mM、dNTP 250M、Taq酶1.0U、引物濃度 0.75m、模板DNA量 4ng/L。1.4 ISSR引

16、物的篩選采用加拿大British Columbia大學(xué)公布的96個(gè)常用ISSR引物序列，由大連寶生物公司合成。每個(gè)引物取少量稀釋成10pmol/L，用YA2003-3、H001、H043、H055 4份材料的DNA作為模板，在96個(gè)引物中篩選出多態(tài)性高的引物，再對(duì)全部材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1.5 PCR擴(kuò)增及電泳PCR擴(kuò)增在Thermo Hybaid PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)結(jié)束后向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入6L的6×loading buffer，用1.6%的瓊脂糖凝膠電泳（5V/cm），凝膠中含0.01%溴化乙錠，電泳5h后用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)對(duì)凝膠板檢測(cè)并照相并分析。1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

17、對(duì)獲得的DNA條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在相同遷移位置，有帶記為1，無(wú)帶記為0，依此構(gòu)成原始數(shù)據(jù)矩陣，利用NTSY-PC2.10軟件計(jì)算Dice遺傳相似系數(shù)，根據(jù)UPGMA法 (Unweighted pair group method arithmetic averages) 20進(jìn)行聚類分析和主成分分析（PCoA）。2 結(jié)果與分析2.1 篩選引物從96條引物中共篩選出13條多態(tài)性好、條帶清晰的引物(表2)，用于供試28個(gè)材料的PCR擴(kuò)增。在13個(gè)引物中，有8個(gè)二核苷酸重復(fù)序列，1個(gè)四核苷酸重復(fù)序列，2個(gè)五核苷酸重復(fù)序列，1個(gè)5錨定的重復(fù)序列，1個(gè)混合基元。表2 用于扁穗牛鞭草ISSR分析的引物序列Tab

18、le 2 Primer sequences used in ISSR analyses of Hemarthria compressa引物代號(hào)引物序列(5-3)引物代號(hào)引物序列(5-3)Primer codePrimer sequencePrimer codePrimer sequence811(GA)8C860(TG)8RA817(CA)8A873(GACA)4821(GT)8T880(GGAGA)3853(TC)8RT881(GGGGT)3855(AC)8YT886VDV(TC)856(AC)8YA895AGA GTT GGT ACG TCT TGA TC857(AC)8YG：D = (A

19、,G,T)，V = (A,C,G)，R = (A,G)，Y = (C,T)2.2 ISSR擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性分析13個(gè)引物共擴(kuò)增出129條帶，片段大小在300bp2000bp之間;平均每個(gè)引物的擴(kuò)增條帶數(shù)為9.9條，最多能得到14條清晰帶(857、895),最少有7條(860、881、886);多態(tài)性條帶總數(shù)為110條，平均每個(gè)引物能擴(kuò)增出8.5條，引物的平均多態(tài)性比率為84.2%(表3)。其中，多態(tài)性最高的為混合基元895號(hào)和二核苷酸重復(fù)序列857號(hào)，可分別擴(kuò)增出14條和13條多態(tài)帶，多態(tài)性比率分別達(dá)100%和92.9%。這表明，如果對(duì)扁穗牛鞭草進(jìn)一步做ISSR研究，其引物最好選混合基元和二核

20、苷酸重復(fù)序列類型的引物。2.3ISSR鑒定標(biāo)記在所用的ISSR引物中，以引物857區(qū)分28個(gè)材料的效果較為明顯，即使是親緣關(guān)系很近的材料，也可根據(jù)其指紋將其分開(kāi)(圖1)?！皬V益”的9個(gè)選系與“廣益”相比都存在一定的ISSR變異；其次，在“廣益”的9個(gè)選系中，來(lái)自四川雅安的3個(gè)材料和來(lái)自四川洪雅陽(yáng)坪的6個(gè)材料間在約1100bp、600bp、440bp處有分別有一條多態(tài)性帶，在來(lái)自四川洪雅陽(yáng)坪的6個(gè)材料中，YA2003-2在700bp處有一條特有帶(箭頭所示)，與其它5個(gè)材料間均存在一定差異，這說(shuō)明ISSR標(biāo)記在扁穗牛鞭草指紋圖譜建立和品種鑒定中具有較好的效果。表3 扁穗牛鞭草ISSR標(biāo)記的多態(tài)性

21、分析Table 3 Polymorphism analysis for banding patterns amplified of H. compressa by different ISSR primers引物primer擴(kuò)增總條帶Total numbers of polymorphism bands多態(tài)性條帶數(shù)Numbers of polymorphism bands多態(tài)性比率The percent of polymorphism bands811121083.3%81711981.8%8219777.8%85310880%8558787.5%8569888.9%857141392.9%8

22、607571.4%8739777.8%880121083.3%8817685.7%8867685.7%8951414100%合計(jì)(Sum)129110平均 (Mean)9.98.584.2%2000bp1000bp750bp500bp250bp圖1 857號(hào)引物對(duì)28份材料DNA的ISSR擴(kuò)增圖譜Fig.1 ISSR fingerprint amplified with primer No.857 in 28 DNA of Hemarthria compressa2.528份扁穗牛鞭草材料聚類分析利用NTSYS軟件計(jì)算出的28份扁穗牛鞭草材料間遺傳相似系數(shù)(GS)值變動(dòng)于0.4660.98之間

23、，平均GS值為0.722。其中來(lái)自四川寧南的H029和貴州獨(dú)山的H042之間的遺傳相似系數(shù)最小，為0.466，表明它們之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；來(lái)自四川陽(yáng)坪的YA2002-4和YA2002-5之間的遺傳相似系數(shù)最大，為0.98，說(shuō)明其親緣關(guān)系最近。第類第類圖2 28個(gè)扁穗牛鞭草材料的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram for 28 Hemarthria compress accessions based on DICE coefficient進(jìn)一步采用UPGMA法對(duì)供試28份材料進(jìn)行聚類分析，其結(jié)果如圖2所示。在GS=0.61處，可把28份扁穗牛鞭草分為2個(gè)類群，其中來(lái)自貴

24、州的3個(gè)材料H042、H043、H047聚為一類(第類)；剩下的所有材料聚為一類(第類)，均來(lái)自重慶和四川的材料，這與重慶和四川地理位置很接近，生境比較相似有一定關(guān)系。另外，結(jié)合陳永霞等對(duì)供試牛鞭草材料的形態(tài)聚類分析21，又可將28份材料分為4組。第類均為較纖細(xì)低矮型(A組)；在第類中，H019、H031、“重高”為粗壯低矮型(B組)，H001、H016、H026、H029、H033、H040、H035、H053、H054、H05為最纖細(xì)最低矮的類型(C組)，YA2002-2、YA2002-4、YA2002-5、YA2003-1、YA2003-2、YA2003-3、YA2003-4、YA200

25、3-5、YA2003-6、H002、H065、“廣益”為高大粗壯型(D組)，且“廣益”扁穗牛鞭草的無(wú)性選系全部聚在一起。從聚類結(jié)果可以看出，相同或相近地理來(lái)源的材料基本聚在一起，說(shuō)明遺傳多樣性與其地理來(lái)源有一定關(guān)系；其次，同一形態(tài)類型的扁穗牛鞭草材料也基本聚在一起，其遺傳多樣性與其形態(tài)多樣性相吻合。2.6扁穗牛鞭草主成分分析 對(duì)28份扁穗牛鞭草種質(zhì)的ISSR標(biāo)記的原始矩陣進(jìn)行主成分分析，前3個(gè)主成分所能解釋的遺傳變異分別為18.52%、11.49%和9.64%。對(duì)28份種質(zhì)做前3個(gè)主成分的三維排序圖（圖3），位置靠近者表示關(guān)系密切，遠(yuǎn)離者表示關(guān)系疏遠(yuǎn)，將位置靠近的扁穗牛鞭草材料劃歸在一起，可將

26、供試材料分成4個(gè)組，與聚類分析結(jié)果基本一致。圖3 依據(jù)ISSR標(biāo)記對(duì)扁穗牛鞭草種質(zhì)進(jìn)行主成分分析的三維散點(diǎn)圖Fig.3 The 3 dimensions plot of the principal components analysis on H. compressa accessions with ISSR markers3.討論與結(jié)論 對(duì)來(lái)源于四川、重慶、貴州地區(qū)的28份扁穗牛鞭草材料進(jìn)行ISSR分子標(biāo)記遺傳多樣性分析的結(jié)果表明，平均每個(gè)引物擴(kuò)增的多態(tài)條帶數(shù)為8.5條，多態(tài)性條帶比率為84.2%；材料間遺傳相似系數(shù)范圍在0.466到0.98間，平均GS值為0.722，從而在DNA分子水平上

27、說(shuō)明了不同扁穗牛鞭草種質(zhì)材料(無(wú)性系)之間的遺傳差異較大，遺傳多樣性較豐富。聚類分析和主成分分析結(jié)果顯示，28份扁穗牛鞭草材料可劃分為2大類4組，這與形態(tài)學(xué)的劃分基本一致，但同屬C組的H001在ISSR聚類圖上與C組其它材料明顯分屬2個(gè)聚類群，這說(shuō)明形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)由于數(shù)量有限、且易受環(huán)境影響，不足以表明扁穗牛鞭草種質(zhì)的所有多樣性。一般而言，對(duì)扁穗牛鞭草等以無(wú)性繁殖為主的牧草，宜采用無(wú)性系的系統(tǒng)選擇來(lái)進(jìn)行品種選育，因而建立快速的品種指紋圖譜對(duì)于加快育種進(jìn)程和新品種保護(hù)具有重要意義。從本研究的結(jié)果看，利用ISSR標(biāo)記技術(shù)可以獲得清晰且多態(tài)性高的扁穗牛鞭草電泳圖譜。利用單獨(dú)一個(gè)多態(tài)性好的引物基本上能將2

28、8份材料分開(kāi)，且各材料特征帶明顯，說(shuō)明ISSR標(biāo)記用于扁穗牛鞭草遺傳多樣性研究及不同材料的DNA水平識(shí)別是可靠的，這為利用ISSR技術(shù)構(gòu)建扁穗牛鞭草品種的指紋圖譜，保護(hù)產(chǎn)權(quán)和輔助育種奠定了良好基礎(chǔ)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自“廣益”的無(wú)性系選系間存在一定的變異，這可能是由于長(zhǎng)期種植后，自然條件及栽培環(huán)境等的變化所產(chǎn)生的基因變異，這為在優(yōu)良扁穗牛鞭草品種中進(jìn)一步選育提供了理論依據(jù)。 參考文獻(xiàn)：1 中國(guó)科學(xué)院植物所.中國(guó)植物志(第十卷,第二分冊(cè))M.北京:科學(xué)出版社,1997,10(2):262.2 張健,黃勇富,張家驊,等.扁穗牛鞭草生產(chǎn)及利用的發(fā)展現(xiàn)狀和潛力J.草業(yè)科學(xué),2003,20(7):161

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31、association emtlon: I. Effects of H. altissima (Poir.) stapf. and Hubb root residues on the growth of Desmodium miortum (Mill.). urb. and H. altissima in a tropical soil J. CropScience, 1981, 2l (5):770774. 9 Zietikiewicze, Rafalske R A, Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (ISS

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