流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤臨床和研究中的應(yīng)用

1、流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤臨床和研究中的應(yīng)用 周永列 1.3免疫分型中的幾個(gè)問(wèn)題 白血病免疫分型時(shí)盡量選用系列特異性強(qiáng)的單抗作為一線單抗，目前較為公認(rèn)系列特異性單抗有T系的cyCD3, B系的cyCD79a、cyCD22和髓系的MPO、cyCD13等。一般說(shuō)胞漿比胞膜的標(biāo)志特異性強(qiáng)。用此特異性強(qiáng)的標(biāo)志作為初篩，基本可確定T、 B或髓系，然后再進(jìn)一步分析。以下為各系列較特別的標(biāo)志： AML： MPO、 CD33、 CDl3、 CDl4 CDl5、 CDllB、 CDllCT-ALL： cmCD3、 CD2、 CD5、 CD7、 CD4CD8、 CD38B-ALL： cCD22、cCD79、 CDl9、 C

2、Dl0、 CD24、 HLA-DR、 CD20、 CD38造血干祖細(xì)胞CD34、 CDll7、 CD38、 HLA-DR、 ACl33 AML各亞型的免疫分型中有時(shí)仍較難分辨，有以下特點(diǎn)可供參考： CD41、 CD61是巨核細(xì)胞的標(biāo)志，見于FAB-M7，但血小板粘附于某細(xì)胞上可造成假陽(yáng)性。 CD71與血型糖蛋白是紅系的標(biāo)志，見于FAB-M6型。 CDl4、 CD64是單核細(xì)胞的標(biāo)志，見于M4或M5。 FAB-M3，t(15；17)者典型的免疫表型是CDl3+、 CD33+、 CD9+、 CD38+、 CD34-、 DR-。 t(8；21)M2的表型為 CDl3+、 DR+、 CD34+、 CD

3、33+、 CDl5+、 CDl9+或CD56+。 M0與M1較難區(qū)分，應(yīng)有髓系標(biāo)志而無(wú)淋系標(biāo)志，胞漿MPO應(yīng)陰性。 CD34及DR在M0較強(qiáng)，并可伴有CD7與CD4。 CDll7+多見于AML。 CD7常與CD34共表達(dá)， CD4見于M4、M5。 CD2+見于M4Eo，往往伴有16號(hào)染色體異常。 M3亦可有 CD56+表達(dá)。正常粒細(xì)跑可表達(dá) CDl0。由此可見，單抗本身有其多向性，勿輕易判斷為雜合型白血病。 TB-ALL可分為幾個(gè)亞型，然而對(duì)臨床價(jià)值不大。但若B-ALL伴有CD34表達(dá)時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步作遺傳學(xué)與基因檢測(cè)，以確定是否是Ph+ALL，不論是M-bcl/abl或m-bcrablmRNA陽(yáng)

4、性者，其預(yù)后均較差，應(yīng)接受大劑量化療或早期接受異基因骨髓移植。 白血病免疫分型是對(duì)骨髓或外周血中的白血病細(xì)胞進(jìn)行免疫標(biāo)記，從而診斷白血病的類型。為此分型時(shí)如何提高設(shè)門的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。用FCM單參數(shù)測(cè)定的準(zhǔn)確性不高?，F(xiàn)今國(guó)際上通用的是 CD45SSC設(shè)門法，其目的是排除正常細(xì)胞的干擾，將不正常的細(xì)胞群孤立出來(lái)便于重點(diǎn)分析。其原理是CD45是所有白細(xì)胞的抗原， CD45表達(dá)量在成熟淋巴細(xì)胞最高，單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、早期造血細(xì)胞依次減弱。紅細(xì)胞(中、晚幼紅細(xì)胞、成熟紅細(xì)胞)不表達(dá) CD45。側(cè)向角光散射(SSC)反映細(xì)胞的顆粒性，成熟粒細(xì)胞 SSC最高，依次為單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、 早期造血細(xì)胞、紅細(xì)

5、胞。以 CD45SSC典型圖即可獲得初步印象。若同時(shí)加上一個(gè)或二個(gè)以上其它單抗進(jìn)行二、三色甚至四色分析，則很容易識(shí)別非正常細(xì)胞群的表型，并排除正常細(xì)胞的干擾，當(dāng)標(biāo)本中幼稚細(xì)胞低于50或檢測(cè)殘存白細(xì)胞時(shí)尤為必要。 是否結(jié)合FAB形態(tài)學(xué)報(bào)告值得探討。 2、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)殘存白血病細(xì)胞(MRD) 白血病病人在獲得血液學(xué)緩解后體內(nèi)還可存在1010以下的白血病細(xì)胞。這樣少量的細(xì)胞常規(guī)的顯微鏡不能測(cè)出。在強(qiáng)化治療和維持治療后可逐步減少，但難以徹底清除，這是復(fù)發(fā)的根源。檢測(cè)MRD是決定進(jìn)一步治療策略和選擇采集外周血造血干/祖細(xì)胞自體移植及進(jìn)行異基因骨髓移植時(shí)機(jī)的依據(jù)。 2.1 MRD檢測(cè)方法的評(píng)價(jià) 目前已經(jīng)

6、清楚，殘留白血病細(xì)胞可以在患者體內(nèi)存在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)期，隨著緩解和治療時(shí)間長(zhǎng)短可以出現(xiàn)數(shù)量變化，因此應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)長(zhǎng)程動(dòng)態(tài)地而不是孤立單次地監(jiān)測(cè)MRD，從定性水平向定量水平發(fā)展。如何從分子水平定義CR，正確評(píng)價(jià)化療和骨髓移植治療的效果? 究竟MRD陰性持續(xù)多長(zhǎng)時(shí)間才算治愈，為什么治療后仍然長(zhǎng)期有MRD? CR患者存在多少M(fèi)RD細(xì)胞才不會(huì)影響生存期?這些問(wèn)題都吸引著白血病工作者的興趣。可以預(yù)計(jì)，回答了殘留白血病檢測(cè)和診斷的這些問(wèn)題，將了解白血病的生物學(xué)本質(zhì)，有助于最終治愈白血病。 3、 白血病的多藥耐藥 (Multidurg Resistant MDR) 所謂耐藥即是腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒藥物失去敏感性，致使化

7、療失敗。目前研究的熱點(diǎn)是多藥耐藥的發(fā)生機(jī)制及逆轉(zhuǎn)方法，多藥耐藥的特點(diǎn)表現(xiàn)在細(xì)胞一旦產(chǎn)生對(duì)某種藥物的耐受性，同時(shí)對(duì)另外一些在結(jié)構(gòu)和功能上完全不同的藥物也產(chǎn)生耐受性，這些MDR相關(guān)藥物多為一些大分子的天然藥物。雖然這種耐藥現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)是在臨床工作中總結(jié)的，但是，其耐藥機(jī)制的研究則是通過(guò)在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用藥物誘導(dǎo)細(xì)胞株細(xì)胞或動(dòng)物模型的耐藥表型。主要存在以下幾種耐藥機(jī)制。（1）細(xì)胞膜異常表達(dá)某些起外排藥物作用的蛋白：最早研究并且得到臨床證實(shí)的是MDR1基因表達(dá)產(chǎn)物P-gp蛋白，近年又發(fā)現(xiàn)了多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)和肺耐藥相關(guān)蛋白(LRP)等。（2）細(xì)胞內(nèi)某些酶系統(tǒng)在數(shù)量和結(jié)構(gòu)上的異常，研究較多的是谷脹甘肽S

8、轉(zhuǎn)移酶和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(Topo)。另外還有一些非特異性的細(xì)胞氧化和解毒酶系統(tǒng)如P-450、 DNA修復(fù)酶、與蛋白磷酸化相關(guān)的磷酸化酶PKC等。（3）細(xì)胞凋亡(apoptosis)的抑制引起的耐藥，這是近年來(lái)在耐藥研究領(lǐng)域中提出的一個(gè)新概念，涉及到細(xì)胞凋亡抑制的因子及基因已發(fā)現(xiàn)多種，目前在耐藥研究中初步觀測(cè)了bc-2、 c-myc、及P53基因的改變與耐藥存在相關(guān)性。 3.1多藥耐藥基因蛋白 （ P-糖蛋白，P-gp）   腫瘤細(xì)胞一旦對(duì)某種化療藥物產(chǎn)生耐藥,即對(duì)其他不同類型的多種結(jié)構(gòu),細(xì)胞靶點(diǎn)和作用機(jī)理迥然不同的抗癌藥物產(chǎn)生耐藥,是一種獨(dú)特的廣譜耐藥現(xiàn)象. P糖蛋白是一種分子量1

9、70KDa的跨膜糖蛋白(P170)，它具有能量依賴性"藥泵"功能。P-gp既能與藥物結(jié)合,又能與ATP結(jié)合,ATP供能,使細(xì)胞內(nèi)藥物泵出細(xì)胞外,減低了細(xì)胞內(nèi)的藥物深度,使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。 MDR1 有兩種不同的表型，對(duì)第一次化療產(chǎn)生的耐藥天然性耐藥。在化療過(guò)程中產(chǎn)生耐藥的獲得性耐藥?；熐癕DR高表達(dá)的腫瘤,其化療效果往往不理想 ,化療前MDR低表達(dá)的腫瘤,對(duì)化療有較好的效果,化療后高表達(dá)的腫瘤與腫瘤的療效及復(fù)發(fā)有關(guān), 如非何杰金氏病,急淋,慢淋等,有資料報(bào)道,復(fù)發(fā)和難治的白血病其P-gp表達(dá)增加. 成人白血病P-gp表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系： 據(jù)蘇州醫(yī)學(xué)院對(duì)成人白細(xì)胞P-gp檢測(cè)

10、的報(bào)道，以P-gp 10%為陽(yáng)性，P-gp+的AML完全緩解率明顯小于P-gp-的AML，（20.5%VS 78.5%），而在ALL中無(wú)顯著性差異，P-gp+的ALL，ALL6個(gè)月復(fù)發(fā)率高于P-gp-患者，P-gp+患者的平均無(wú)病生存期較P-gp-者短，提示P-gp過(guò)度表達(dá)是成人AL的不良預(yù)后因素，是判斷療效及早期復(fù)發(fā)的一個(gè)重要指標(biāo)。 成人ALL P-gp表達(dá)與形態(tài)學(xué)、免疫表型的關(guān)系：ALL 的P-gp表達(dá)與FABL1、L2、L3分型無(wú)關(guān)，與T、B免疫分型無(wú)關(guān)，但MY+ALL的P-gp表達(dá)明顯高于MY-ALL。 AML P-gp表達(dá)與免疫分型的關(guān)系：成人AML P-gp表達(dá)與CD7、CD14、

11、CD42b、CD61、CD34高度相關(guān)，老年人AMLP-gp表達(dá)與CD14、CD42b、CD61有相關(guān)，與CD34高度相關(guān)。 3.2 細(xì)胞凋亡(apoptosis)的抑制引起的耐藥 近年提出化療藥物是細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)劑,從這個(gè)意義上來(lái)說(shuō)，耐藥就是細(xì)胞凋亡的抑制。細(xì)胞凋亡或細(xì)胞程序化死亡與細(xì)胞受損傷后的壞死不同，細(xì)胞凋亡通常不引起Na、 K、 Ca、Mg 等離子濃度的紊亂及由此產(chǎn)生的細(xì)胞腫脹、破碎。最具細(xì)胞凋亡特征性變化的是細(xì)胞DNA斷裂成180-200bp的多個(gè)寡核苷酸片段，細(xì)胞凋亡不僅在腫瘤發(fā)生、細(xì)胞損傷反應(yīng)、抗腫瘤藥物治療、生長(zhǎng)因子的應(yīng)用等方面起重要作用，進(jìn)一步的研究表明細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制在

12、腫瘤耐藥中也起重要作用。許多基因可以調(diào)控細(xì)胞凋亡，如最早研究的bcl-2、P53、 c-myc等基因。基因轉(zhuǎn)染結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染bcl-2基因的骨髓細(xì)胞對(duì)表鬼臼毒素毒性的敏感性明顯降低。白血病與bcl-2表達(dá)的關(guān)系的研究顯示，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示5種髓系白血病細(xì)胞系的 bcl-2表達(dá)與對(duì)阿霉素、阿糖胞苛、氨甲蝶吟誘導(dǎo)凋亡的敏感性有關(guān)。更多的實(shí)驗(yàn)研究顯示bcl-2的高表達(dá)與白血病細(xì)胞對(duì)各種誘導(dǎo)劑的高抗性有關(guān)，而且這種對(duì)化療藥物的不同敏感性受bcl-2表達(dá)水平的影響，bcl-2使抗癌藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用變成了對(duì)細(xì)胞死亡的抑制作用，即bcl-2導(dǎo)致耐藥的主要機(jī)制是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡途徑完成，可以認(rèn)為這是一種新型的耐藥基因。另外，野生型p53基因是細(xì)胞凋亡的激活劑，而突變型p53與bcl-2相同都能抑制細(xì)胞凋亡，同時(shí)也抑制了c-myc基因?qū)?xì)胞凋亡的加強(qiáng)作用，它們共同的作用結(jié)果是增加了腫瘤細(xì)胞的耐藥性。有關(guān)細(xì)胞調(diào)亡的誘導(dǎo)和抑制基因尚有很多，并且還在不斷發(fā)現(xiàn)新的，僅bcl-2家族就發(fā)現(xiàn)7個(gè)成員，其中baxbcl-2的比率是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵，而bcl-2和bcl-xI的二聚體也可促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡的發(fā)生。它們中的多數(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡的作用尚不十分清楚，尤其