抗?jié)h坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體抗病毒作用的研究_圖文

1、抗?jié)h坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體抗病毒作用的研究王濤,李建東,張全福,李川,劉琴芝,梁米芳3,李德新3(中國疾病預防與控制中心病毒病預防控制所,傳染病預防控制國家重點實驗室,北京100052摘要:本文報道在內(nèi)質網(wǎng)和細胞漿內(nèi)穩(wěn)定表達抗?jié)h坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體,研究抗?jié)h坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體抗病毒作用及其抗病毒作用機理。在獲得穩(wěn)定表達抗?jié)h坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體的細胞系的基礎上,用M TT 法檢測細胞內(nèi)表達抗?jié)h坦病毒單鏈抗體對細胞增殖的影響,證實細胞內(nèi)抗體的表達不會影響到細胞的生長。不同時間收集病毒感染毒后細胞培養(yǎng)培養(yǎng)上清和細胞裂解物,用EL ISA 方法檢測細胞內(nèi)外病毒結構蛋白含量的變化,結果表明定位于

2、細胞內(nèi)質肉和細胞漿內(nèi)的抗?jié)h坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體均能不同程度降低感染細胞上清中的核蛋白含量,但是不能或輕微抑制細胞內(nèi)漢坦病毒核蛋白的合成。利用病毒微量滴定免疫熒光方法,對細胞內(nèi)抗體與病毒的增殖關系進行了研究,證實無論在內(nèi)質網(wǎng)還是在胞質,抗核蛋白細胞內(nèi)抗體都能夠抑制病毒的增殖,具有抗病毒活性?？?jié)h坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體不能抑制病毒結構蛋白的合成,其抗病毒效果是通過抑制病毒的包裝而實現(xiàn)。關鍵詞:漢坦病毒;核蛋白;抗病毒;細胞內(nèi)抗體中圖分類號:R37313+2文獻標識碼:A 文章編號:1000-8721(200602-0089-07收稿日期:2005-09-23;修回日期:2006-01-23基金項

3、目:國家自然科學基金項目(編號:30371269作者簡介:王濤(1972-,中國疾病預防與控制中心病毒病預防控制所博士研究生。漢坦病毒屬于布尼亞病毒科漢坦病毒屬,為分節(jié)段的負鏈RNA 病毒,其病毒基因組由L 、和S 三個片段組成,分別編碼病毒多聚酶、包膜糖蛋白G1、G2和核蛋白。漢坦病毒引起的腎綜合征出血熱主要發(fā)生在我國,臨床病死率較高,至今沒有特異性藥物治療,且抗?jié)h坦病毒感染的機理研究方面尚存在許多欠缺。因此,抗病毒感染機理以及新的治療途徑的研究具有理論和實際意義。細胞內(nèi)抗體在細胞內(nèi)特定部位表達,可與靶分子蛋白或多肽結合,直接使其失活或影響靶分子蛋白或多肽在細胞內(nèi)的合成,運輸及各種可能的信號

4、傳導,抑制靶分子在細胞內(nèi)的活性,因而細胞內(nèi)抗體已成為細胞內(nèi)蛋白功能、蛋白與蛋白相互作用及信號傳導等多種功能的一種新工具,并同時具有臨床治療的應用潛力,故細胞內(nèi)抗體技術近年來已廣泛用于病毒病、腫瘤治療1,以及心血管疾病、移植及自身免疫疾病2、甚至中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病3等方面的基礎和應用研究。為更好地了解漢坦病毒在細胞內(nèi)的成熟組裝及其病毒結構蛋白在病毒成熟過程中的關鍵作用和與病毒感染后發(fā)病機制的關系,我們構建了分別定位于內(nèi)質網(wǎng)和細胞漿穩(wěn)定表達的抗?jié)h坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體細胞系,感染漢坦病毒后研究其抗病毒作用,為研究漢坦病毒感染的機理奠定了基礎。材料與方法1載體與細胞質粒pOPE -101-215(Y

5、ol 為單鏈抗體表達構建載體,具有pelB 分泌信號序列及3個標簽基因:Y ol 2Epitope 為EEGEFSEAR 9個氨基酸殘基的Linker 序列、c 2myc Epitope 和6個組氨酸標簽,德國海德堡大學Stefan D übel 教授惠贈。真核表達載體p EF/myc/ER 和p EF/myc/cyto 購自Invitrogen 公司,為EF 21啟動子攜帶c 2myc 2Epi 2tope 。其中p EF/myc/cyto 多克隆位點N 端沒有分泌及定位信號N 2端以蛋氨酸起始,蛋白合成后分布于細胞漿中,p EF/myc/ER 多克隆位點N 端有定位ER 信號肽,

6、C 端具有ER滯留信號肽SEK DEL ,克隆基因表達后將定位于內(nèi)質網(wǎng)。Vero 2E6細胞由美國A TCC 引進,本實驗室保存,使用代次為1230代。營養(yǎng)液為含有10%小牛血清的DMEM 液,維持液為含2%小牛血清DMEM 液。瞬時表達用COS 27細胞由美國A TCC 引進本室保存,營養(yǎng)液為10%小牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液。E 1coli XL12blue ,由本室保存,E 1coli DH5,由本室保存1抗?jié)h坦病毒核蛋白單鏈抗體表達載體pOPE1012L13F3scFv 和pOPE1012H34scFv 本室構建并保存4。2試劑實驗用酶購自Biolabs 、Takara 和GIBCO

7、 公司;L IPOFECTAMIN E K it (GIBCO BRL 。FITC 標記抗鼠IgG Fab 特異性抗體,FITC 標記抗人IgG Fab 特異性抗體,TRITC 標記抗鼠IgGHRP 酶標抗人IgG Fab 特異性抗體,第22卷第2期2006年3月病毒學報CHIN ESE JOURNAL OF VIROLO GY Vol.22No.2March 2006HRP酶標抗鼠IgG Fab特異性抗體,HRP酶標抗出血熱抗體購自美國Sigma公司。抗鼠anti2myc單克隆抗體購自美國Invitrigen公司。全病毒感染Vero2E6細胞制備的抗原片和漢坦病毒核蛋白抗原由本室自制并保存。

8、3細胞內(nèi)抗體表達載體的構建及其在細胞內(nèi)的表達311單鏈抗體細胞內(nèi)表達載體的構建細胞內(nèi)抗體基因來自鼠源漢坦病毒核蛋白組特異性抗體L13F3和人源漢坦病毒型特異性抗體H345。ER2scFv N端有ER信號肽,C端具有ER滯留信號肽SEK DEL,scFvs表達后將定位于內(nèi)質網(wǎng)。PCR擴增單鏈抗體基因,分別以52A GG TCC A GC TGC TCG A GT CTGG23,52G A G GTG CA G CTG CTC G A G TCT GGG23為正向引物,單鏈抗體K appa鏈可變區(qū)3端引物為反向引物分別擴增鼠源L13F3scFv和人源H34scFv。PCR產(chǎn)物經(jīng)Xho I和Not

9、I酶切克隆入p EF/myc/ ER載體,命名為p EF/myc/ER/L13F3和p EF/myc/ER/ H34,相應的細胞內(nèi)抗體命名為:L13F32ER和H342ER。cy2 to2scFv沒有分泌及定位信號,N2端以蛋氨酸起始,在細胞內(nèi)表達的scFv將分布于細胞質中,選擇Nco I和Not I作為scFv克隆進入位點,可由pOPE1012scFv原核表達載體經(jīng)Nco I和Not I酶切消化后直接克隆進入p EF/myc/cyto載體,命名為p EF/myc/cyto/L13F3,p EF/myc/cyto/H34,相應的細胞內(nèi)抗體命名為:L13F32Cyto,H342Cyto。312細

10、胞內(nèi)抗體在真核細胞內(nèi)的表達4種載體L IPO2 FECTAMIN E2000法轉染24孔板中COS27細胞(操作方法按K it說明書,48h后消化細胞,制備抗原片。IFA檢測單鏈抗體在細胞內(nèi)的表達,加鼠anti2myc單克隆抗體,37孵育后加熒光素FITC標記抗鼠IgG Fab特異性抗體,熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察抗體細胞內(nèi)表達。4穩(wěn)定表達細胞內(nèi)抗體細胞系的建立質粒p EF/myc/cy2 to/AH100,p EF/myc/cyto/Y5,p EF/myc/ER/AH100和p EF/myc/ER/Y5L IPOFECTAMIN E2000法分別轉染24孔板中Vero2E6細胞,24h

11、后轉種于T25方瓶。24h后,加入終濃度為300g/ml的G418,37,5%CO2培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中逐漸加大G418至終濃度為1000g/ml,且細胞長滿T25方瓶。胰酶消化細胞,10-510-6稀釋細胞,轉種于96孔板,有限稀釋法進行細胞克隆,建立穩(wěn)定表達細胞內(nèi)抗體細胞系。制備細胞抗原片,激光共聚焦顯微鏡觀察抗體細胞內(nèi)表達。5MTT法檢測穩(wěn)定表達細胞系的細胞活力基本按文獻6進行:以每孔103104個細胞接種Vero2E6細胞和上述所建細胞系于96孔板,每孔體積200l,每種細胞8孔,共傳4塊板,將培養(yǎng)板移入CO2孵箱,37,5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。從第3d開始,每天取一塊培養(yǎng)板,每孔

12、加入M TT溶液(5mg/ml20l,37,繼續(xù)孵育4h,終止培養(yǎng),小心吸棄培養(yǎng)孔內(nèi)上清,每孔加入150l DMSO,震蕩10min,使結晶充分溶解。測定各孔490nm波長時光吸收值,記錄結果。以時間為橫軸,光吸收值為縱軸繪制細胞生長曲線。6漢坦病毒染毒實驗將穩(wěn)定表達scFv2cyto和scFv2ER 的Vero2E6細胞系在無G418的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng),細胞長滿單層后,無血清DMEM培養(yǎng)液沖洗細胞3遍,去掉死細胞。漢坦病毒762118以每個細胞011PFU病毒(011MOI感染細胞,正常Vero2E6細胞設為對照。在37吸附2h,每15 20min輕輕晃動培養(yǎng)瓶,以使病毒吸附均勻。用含2

13、%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將每瓶細胞沖洗2遍,然后每瓶補加DMEM維持液維持培養(yǎng)細胞。7漢坦病毒結構蛋白的檢測及其在V ero2E6細胞中產(chǎn)生的動態(tài)觀察711漢坦病毒結構蛋白的獲得7每天收獲病毒感染的Vero2E6細胞培養(yǎng)液,-70凍存待用;收獲的感染細胞,棄上清。預冷的PBS洗2遍。加入含015%去氧膽酸鈉和011% NP240以及蛋白酶抑制劑的pH715的T ris2HCl裂解緩沖液, 4使細胞充分裂解。將裂解液移入離心管,4,13000r/min 離心15min。收集的上清即含有病毒結構蛋白。712EL ISA夾心法檢測病毒結構蛋白動態(tài)變化培養(yǎng)上清中病毒N蛋白動態(tài)變化:鼠源抗?jié)h坦病毒核蛋

14、白抗體L13F3包被,37封閉1h,加入病毒感染Vero2E6不同天數(shù)收獲的上清,37反應1h。PBS2T清洗5遍,加入11000稀釋于5%脫脂奶的辣根過氧化物酶標記的抗?jié)h坦病毒N蛋白單克隆抗體,37反應1h。顯色10min,2mol/L H2SO4終止反應。標檢測儀波長490nm測定每孔的吸光度A值,未染毒的空白Vero2E6細胞上清為對照調零。感染細胞中病毒N 蛋白動態(tài)變化:單克隆抗體L13F3包被,加入不同天數(shù)收獲的感染細胞裂解物,檢測同上。培養(yǎng)上清中病毒糖蛋白動態(tài)變化:單克隆抗體H13211E102121包被,加入不同天數(shù)收獲的細胞培養(yǎng)上清,371h。加入1:10稀釋于5%脫脂奶的人源

15、抗?jié)h坦病毒糖蛋白單克隆抗體Y22,37反應1h,辣根過氧化物酶標記的抗人Fab特異性抗體顯色。波長490nm 測吸光度。感染細胞中病毒糖蛋白動態(tài)變化:單克隆抗體H13211E102121以1:500包被,加入不同天數(shù)收集的感染細胞裂解物,檢測同上。8微量法滴定病毒8使Vero2E6細胞在96孔板長成單層。將58d收獲的病毒上清用維持液做10-110-8稀釋,接種于上述96孔板,每稀釋度4孔,每孔011ml。置37,5%CO2培養(yǎng)8d,中間換液1次。將各孔細胞涂片,I2 FA T法檢測,計算不同樣品TCID50。結果1細胞內(nèi)抗體在細胞內(nèi)的表達細胞內(nèi)抗體在細胞內(nèi)的瞬時表達4種質粒轉染的COS27細

16、胞都能見到目的蛋白在細胞內(nèi)表達的特異性熒光,其中抗體在內(nèi)質網(wǎng)分布呈現(xiàn)類似梭狀熒光,而細胞漿內(nèi)表達的熒光則近似指環(huán)狀,與文獻報道一致9,顯示目的抗體能夠在哺乳動物細胞內(nèi)定位表達(圖1。9病毒學報22卷 圖1細胞內(nèi)抗體在COS -7細胞內(nèi)瞬時表達免疫熒光定位Figure 1Immunofluorescence localization of intracellular antibodies transientl y expressed in transfected COS 27cell1.L13F32Cyto ;2.L13F32ER ;3.H342Cyto ;4.H342ER.2穩(wěn)定表達細胞內(nèi)抗體

17、細胞系的建立四種質粒轉染的Vero 2E6細胞經(jīng)G418及有限稀釋法篩選,G418(750g/ml 維持,能見到目的蛋白在細胞內(nèi)表達的特異性熒光,其陽性率大于95%,表明建立了穩(wěn)定表達細胞內(nèi)抗體的細胞系(圖2 。圖2細胞內(nèi)抗體在Vero 2E6細胞內(nèi)穩(wěn)定表達免疫熒光定位 Figure 2Immuofluorescence localization of intracellular antibodies stably expressed in Vero 2E6cell line1.L13F32Cyto ;2.L13F32ER ;3.H342Cyto ;4.Vero 2E6control.3細胞內(nèi)

18、表達單鏈抗體對細胞活力的影響活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠使外源性的MTT 還原為難溶性的藍紫色結晶物(Formazan 并沉積在細胞中,而死細胞無此功能。二甲基亞砜DMSO 能溶解細胞中的紫色結晶物,用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm 波長測定其光吸收值,可間接反映活細胞數(shù)量。通過MTT 法檢測穩(wěn)定表達抗?jié)h坦病毒細胞內(nèi)抗體細胞系的增殖活力,Vero 2E6細胞為對照。結果顯示表達單鏈抗體的細胞系與對照細胞之間的增殖活力差別較小(結果未顯示詳細的數(shù)據(jù)。細胞內(nèi)表達抗?jié)h坦病毒細胞內(nèi)抗體不影響細胞的生長。4抗?jié)h坦病毒細胞內(nèi)抗體對病毒結構蛋白合成的影響為了檢測抗?jié)h坦病毒細胞內(nèi)抗體是否具有抗病毒感染活性,我

19、們用漢灘病毒(HTN 762118感染上述所建立的細胞系,通過夾心E L ISA 檢測感染細胞內(nèi)上清病毒結構蛋白的動態(tài)變化。用011感染復數(shù)(MOI 漢灘病毒762118感染表達抗?jié)h坦病毒細胞內(nèi)抗體細胞系,在第1天就能夠在上清中檢測到病毒核蛋白。感染后第3天換液,從第4天開始收集上清并檢測。結果顯示圖3:作為對照的感染漢坦病毒762118株Vero 2E6細胞上清中的漢坦病毒762118N 蛋白在第6d 達到高峰,其后2d ,N 蛋白的變化基本維持在同一水平。所建立的穩(wěn)定表達抗?jié)h坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體細胞系都能抑制上清中漢灘病毒N 蛋白的產(chǎn)生,其中內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)表達的抗N 蛋白組特異性抗體L13F3

20、2ER 的抑制效果最好,而內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)表達的抗N 蛋白HTN 型特異性抗體H342ER 效果較差。這種抑制是否為特異性作用,即細胞內(nèi)表達的抗?jié)h灘病毒抗體是否直接與抗原作用產(chǎn)生上述抑制;或細胞內(nèi)表達的抗體影響細胞生長或狀態(tài)導致病毒的復制受到影響,從而產(chǎn)生上述抑制。我們用漢城型(SEO 病毒L99以011MO I 感染抗?jié)h坦病毒核蛋白抗體細胞系,檢測收集的病毒培養(yǎng)上清。如圖4所示,型特異性抗體H342scFv 無論在內(nèi)質網(wǎng)(ER 還是在胞質(Cyto 中表達都不能影響上清中N 蛋白的產(chǎn)生;而組特異性抗體L13F3在內(nèi)質網(wǎng)和胞質中都能抑制病毒培養(yǎng)液中N 蛋白的含量。第9d N 蛋白含量的下降應歸因于培養(yǎng)

21、細胞的脫落。證明細胞內(nèi)抗體與相應抗原特異性結合。192期王濤等:抗?jié)h坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體抗病毒作用的研究 圖3EL ISA 夾心法檢測抗?jié)h坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體細胞系上清中漢坦病毒762118核蛋白的動態(tài)變化Figure 3Dynamic changes of the N protein of HTN virus strain 762118in infected cell line culture stablyexpressing anti 2Hantavirus nucleocapsid protein intracellular antibodies (by EL ISA 圖4EL IS

22、A 夾心法檢測抗?jié)h坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體細胞系上清中漢坦病毒L99核蛋白的動態(tài)變化Figure 4Dynamic changes of the N protein of HTN virus strain L99in infected cell line culture stablyexpressing anti 2Hantavirus nucleocapsid protein intracellular antibodies (by EL ISA 用011MO I 762118病毒感染所建立的細胞系,細胞內(nèi)病毒核蛋白變化結果如圖5所示:在作為對照的Vero 2E6細胞中,N 蛋白含量依然在第四

23、天達到高峰,并維持在幾乎同一水平 ?？?jié)h坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體細胞系中L13F32ER ,H342ER 對N 蛋白復制的抑制作用很弱,而L13F32Cyto 和H342Cy 2to 幾乎不能抑制N 蛋白在細胞內(nèi)的產(chǎn)生和積累。圖5EL ISA 檢測抗?jié)h坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體細胞系細胞裂解液中漢坦病毒762118核蛋白的動態(tài)變化Figure 5Dynamic changes of the N protein of HTN virus strain 762118in infected cell line lysates stablyexpressing anti 2Hantavirus nucleo

24、capsid protein intracellular antibodies (0.1MOI ,by EL ISA 病毒培養(yǎng)液中糖蛋白含量較低,上清中幾乎無法檢測。而細胞內(nèi)糖蛋白含量顯著高于病毒培養(yǎng)液中的含量,在細胞裂解液中可檢測出糖蛋白的積聚。作為對照,糖蛋白在Vero 2E6細胞中的含量基本處于上升趨勢,結果如圖6,表達漢坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體的細胞系對病毒糖蛋白在細胞內(nèi)的復制抑制29病毒學報22卷不明顯 。圖6EL ISA 檢測抗?jié)h坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體細胞系細胞裂解液中漢坦病毒762118糖蛋白的動態(tài)變化Figure 6Dynamic changes of the glycoprot

25、ein of HTN virusstrain 762118in infected cell lysates stably expressing anti 2Hantavirus nucleocapsid proteinintracellular antibodies (0.1MOI ,by EL ISA 5抗?jié)h坦病毒細胞內(nèi)抗體抗病毒活性的檢測為進一步明證明病毒增殖與細胞內(nèi)抗體之間的關系,對病毒培養(yǎng)液中的病毒含量用免疫熒光法(IFA 進行了滴定。如圖7所示,作為對照的Vero 2圖7熒光微量分析法滴定表達抗?jié)h坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體的細胞系培養(yǎng)上清中病毒滴度Figure 7Detection of

26、 the titers of HTN virus strain 762118in infected cell line culture su pernatant stably expressing anti 2Hantavirus nucleocapsid proteinintracellular antibodies (by IFA E6細胞,其病毒感染后第1d 收獲的上清即具有感染力,表明已有病毒包裝、成熟、釋放。而此時從4種細胞內(nèi)抗體細胞系收獲的上清都不具有感染性,沒有成熟的病毒產(chǎn)生。病毒滴度在實驗時間內(nèi)隨時間的延長而呈上升趨勢,至第8d ,TCID 50可達到106-7/011ml 。

27、與上述糖蛋白產(chǎn)生高峰相吻合。所有表達抗?jié)h坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體細胞系在第5d 和第8d ,其上清中病毒滴度都顯著低于Vero 2E6細胞,表明抗?jié)h坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體能夠部分抑制病毒的復制,具有抗病毒作用。其中,定位于內(nèi)質網(wǎng)的組特異性抗體L13F32ER 抗病毒活性最強。討論細胞內(nèi)抗體是一類在細胞內(nèi)定位表達,并發(fā)揮作用的新型基因治療抗體。通過研究細胞內(nèi)抗體對HIV -1結構蛋白、調節(jié)蛋白和酶蛋白的作用,證實它能抑制HIV 早期和晚期復制10,11。為了研究漢坦病毒細胞內(nèi)抗體的抗病毒作用,漢坦病毒的結構蛋白被選擇為細胞內(nèi)抗體作用的靶分子。本實驗選擇鼠源抗?jié)h坦病毒組特異性抗體L13F3和人源抗?jié)h

28、坦病毒型特異性抗體H34,作為細胞內(nèi)抗體的源抗體,研究抗體與病毒蛋白的相互作用和細胞內(nèi)的抗病毒活性。通過M TT 法檢測細胞內(nèi)表達抗?jié)h坦病毒單鏈抗體對細胞增殖的影響。結果表明,細胞內(nèi)抗體對細胞產(chǎn)生的毒性極小,并未表現(xiàn)出對細胞的生長和表型的損害。這意味著,此文的實驗結果的產(chǎn)生是因為細胞內(nèi)表達的抗體直接與漢坦病毒相應結構蛋白作用的結果,而不是通過影響細胞的生長而對病毒在細胞中的生命過程產(chǎn)生的間接影響。實驗結果顯示,相比于Vero 2E6細胞,所建立的在胞質和內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)穩(wěn)定表達抗?jié)h坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體的細胞系都能抑制上清中漢坦病毒N 蛋白的產(chǎn)生。上清中的N 蛋白與病毒的成熟、釋放密切相關,是上清中病

29、毒量的標志之一。穩(wěn)定表達抗?jié)h坦病毒細胞內(nèi)抗體的細胞系培養(yǎng)上清中的N 蛋白的產(chǎn)生受到抑制,說明成熟、釋放的病毒量少于正常Vero 2E6細胞。經(jīng)典理論認為N 蛋白是胞質蛋白,在病毒的裝配過程中N 蛋白的首要功能是與病毒基因組RNA 結合形成核酸核蛋白,保護病毒RNA 免受核酸酶的降解12vRNA 和cRNA 在通過RdRp 復制過程中都需與N 蛋白衣殼化才能完成13,同時N 蛋白還可能調控病毒的復制周期14,在病毒的裝配過程中也發(fā)揮著重要作用15。定位于胞質的L13F32Cyto ,H342Cyto 在胞質與N 蛋白結合,干擾N 蛋白與vRNA 的結合及普馬拉病毒N 蛋白的羧基端93個氨基酸16

30、,H34為型特異性抗體,其作用位點位于C 2端50aa ,可能抑制N 蛋白與RNA 結合。N 蛋白可能直接和G1的細胞漿尾直接作用,起始病毒裝配的發(fā)生17,L13F32Cyto ,H342Cyto 也可能干擾N 蛋白與G1間的相互作用,阻止病毒的裝配。型特異性抗體H342scFv 無論在內(nèi)質網(wǎng)(ER 還是在胞質(Cyto 中表達都不能影響上清中漢城病毒392期王濤等:抗?jié)h坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體抗病毒作用的研究94 病 毒 學 報 22 卷 2 Jones S D , Marasco W A. Antibodies for targeted gene t herapy : extracellul

31、ar gene targeting and intracellular expression J . Ad2 vanced Drug Delivery Review , 1998 , 31 : 153 - 170. 3 Lecerf J M , Shirley T L , Zhu Q. Human single2chain Fv intrabod2 ies counteract i n sit u huntington aggregation in cellular models of Huntington s disease J . Proc Natl Acad Sci USA , 2001

32、 , 98 : 4764 - 4769. 4 李建東 , 王濤 , 梁米芳 , 等 . 抗?jié)h坦病毒核蛋白單鏈抗體的構建 ( SEOV L99 株 N 蛋白的產(chǎn)生 ; 而組特異性抗體 L13 F3 在內(nèi)質網(wǎng)和胞質中都能抑制病毒培養(yǎng)液中 L99 株 N 蛋白的含量 。證明抗病毒效果是由細胞 內(nèi)抗體與相應抗原特異性相互作用所導致 。由于傳 統(tǒng)理論認為漢坦病毒 N 蛋白不進入內(nèi)質網(wǎng) ,則定位 在內(nèi)質網(wǎng)的 L13 F32ER , H342ER 抗病毒效果明顯 ,N 蛋白能夠與在內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)定位表達的 scFv 共定位 ,實 驗結果證實這不是由于細胞固定和染色所造成的假 象 ,這是傳統(tǒng)理論無法解釋 ( 另文發(fā)

33、表 。布尼亞病 毒科中 Uukuniemi ( U U K 病毒已明確是在高爾基 體內(nèi)成熟 , 其 N 蛋白也在高爾基體聚集 18 , H TNV 是否也有類似機制 ,尚未明了 ,我們將在今后對其現(xiàn) 象和機理進行探討 。 病毒糖蛋白在上清中無法檢測 , 表明在病毒培 養(yǎng)液中糖蛋白含量較低 ; 而細胞內(nèi)糖蛋白含量顯著 高于病毒培養(yǎng)液中的含量 , 在細胞裂解液中可檢測 出糖蛋白的積聚 , 這與文獻報道一致 8 。作為對 照 ,糖蛋白在 Vero2E6 中的含量基本處于上升趨勢 , 表達漢坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體的細胞系不能抑制 病毒糖蛋白在細胞內(nèi)的復制 。 所有表達抗?jié)h坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體的細胞

34、系在第 5d 和第 8d , 其上清中病毒滴度都顯著低于 Vero2E6 細胞 , 表明抗?jié)h坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體 同樣能夠部分抑制病毒的復制 , 具有抗病毒作用 。 其中 ,組特異性抗體在內(nèi)質網(wǎng)中表達的 L13 F32scFv2 ER 抗病毒活性最強 。 綜上所述 , 該文構建的穩(wěn)定表達抗?jié)h坦病毒 N 蛋白細胞內(nèi)抗體的細胞系具有抗病毒活性 , 證實細 胞內(nèi)抗體在亞細胞結構與病毒蛋白結合 ?？?N 蛋 白細胞內(nèi)抗體對 N 蛋白在細胞內(nèi)的合成作用明顯 , 其抗病毒效應可能通過抑制病毒的包裝和釋放而實 現(xiàn) 。研究結果同時表明內(nèi)質網(wǎng)定位的抗?jié)h坦病毒細 胞內(nèi)抗體具有明顯的抗病毒功能 , 對目前公認的核

35、 蛋白在胞漿合成極其相應病毒組裝機理提出挑戰(zhàn) , 病毒核蛋白有可能同時在內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)合成或通過某種 機制進入內(nèi)質網(wǎng) 。 參考文獻 : 1 Deshane J , Cabrera C , Curiel D T , et al. Targeted eradication of ovarian cancer mediated by intracellular expression of anti2etbB22 single2chain antibodyJ . Gynecol Oncol , 1995 , 59 : 8 - 14. 與表達 J . 病毒學報 , 2003 , 19 : 118 - 122.

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42、ti J , Hilden P , Ronka H , et al. Immunocytochemical analysis of Uukuniemi virus budding compart ments :role of t he intermediate compart ment and t he Golgi stack in virus maturation J . J Virol , 1997 , 71 :1162 - 1172. 2 期 王濤等 : 抗?jié)h坦病毒核蛋白細胞內(nèi)抗體抗病毒作用的研究 9 5 Antiviral Functions of Intracellular Anti

43、bodies to Nucleocapsid Protein of H an2 tavirus WAN G Tao , L I Jian2dong , ZHAN G Quan2f u , L I Chuan , L IU Qing2zhi , L I De2xin , L IAN G Mi2fang ( S tate Key L aboratory f or I nf ectious Disease Prevention and Cont rol N ational I nstit ute f or V i ral Disease Cont rol and Prevention , Chi n

44、ese Center f or Disease Cont rol and Prevention , Beiji ng 100052 , Chi na Abstract :In t his st udy , we have investigated t he potential f unctions of Hantavirus nuclecapsid ( N protein in Hantavirus replication , assembly and mat uration by expression of t he int racellular antibodies to Hantavirus nu2 cleocaps