分子生物學大試驗報告

1、分子生物學實驗專業(yè):學號:實驗一細菌培養(yǎng)實驗二質粒 DNADNA 提取實驗三瓊脂糖凝膠電泳實驗四質粒 DNADNA 酶切及瓊脂糖電泳分析鑒定實驗五聚合酶鏈式反應（PCRPCR）技術體外擴增 DNADNA實驗六地高辛標記的 SouthernSouthern 雜交實驗一細菌的培養(yǎng)一、目的學習細菌的培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基的配置。二、原理在基因工程實驗和分子生物學實驗中，細菌是不可缺少的實驗材料。質粒的保存、增殖和轉化；基因文庫的建立等都離不開細菌。特別是常用的大腸桿菌。大腸桿菌是含有長約 3000kb 的環(huán)狀染色體的棒狀細胞。它能在僅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的無機鹽的培養(yǎng)基上快速生長。當大腸桿菌

2、在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，其開始裂殖前，先進入一個滯后期。然后進入對數(shù)生長期，以 2030min 復制一代的速度增殖。 最后， 當培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和氧耗盡或當培養(yǎng)基中廢物的含量達到抑制細菌的快速生長的濃度時，菌體密度就達到一個比較恒定的值，這一時期叫做細菌生長的飽和期。此時菌體密度可達到 1M092Xl09/mL。培養(yǎng)基可以是固體的培養(yǎng)基，也可以是液體培養(yǎng)基。實驗室中最常用的是 LB 培養(yǎng)基。三、實驗材料、試劑與主要儀器（一）實驗材料大腸桿菌（二）試劑1 .胰蛋白陳2 .酵母提取物3 .氯化鈉4 .1mol/LNaOH5 .瓊脂粉6 .抗生素（氨葦青霉素、卡那霉素等）（三）儀器1 .培養(yǎng)皿2 .帶帽

3、試管3 .涂布器4 .滅菌鍋5 .無菌操作臺（含酒精燈、接種環(huán)、滅菌牙簽等）6 .恒溫搖床四、操作步驟（一）LB 培養(yǎng)基的配制配制每升培養(yǎng)基，應在 950m1 去離子水中加入：細菌培養(yǎng)用胰蛋白陳 10g細菌培養(yǎng)用酵母提取物 5gNaCl10g搖動容器直至溶質完全溶解，用 1mol/LNaOH 調節(jié) pH 位至 7.0。加入去離子水至總體積為 lL,在 15lbf/in2（1.034105Pa）高壓下蒸氣滅菌 20 分鐘。這樣得到是LB液體培養(yǎng)基。 LB固體培養(yǎng)基是在其液體培養(yǎng)基的基礎上另加瓊脂粉15g/L0（二）細菌的培養(yǎng)（1）在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1.過夜培養(yǎng)(1)先在 LA 液體培養(yǎng)基中加入氨

4、葦青霉素，50叱l/50ml。(2)取 34ml 液體培養(yǎng)基加入一只無菌的試管中。(3)用接種環(huán)或滅菌牙簽挑一個單菌落，接種于培養(yǎng)液中。(4)蓋好試管，在搖床上以 60r/min 速度，于 37c 過夜培養(yǎng)。2.大體積培養(yǎng)(1)按 1：100(V/V)的比例將過夜培養(yǎng)物加入到一無菌燒瓶中，燒瓶的體積應該是培養(yǎng)液體積的 5 倍以上。(2)于 37C,約 200r/min 劇烈搖動培養(yǎng)。(2)在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)主要是為了獲得單菌落和短期保存。平板劃線法分離單菌落(1)采用無菌技術，用接種環(huán)將接種物從平板的一側開始劃線。(2)重新消毒接種環(huán)， 從第一劃線處將樣品劃線至平板的其余

5、部分， 重復劃線直至覆蓋整個平板。(見下圖)(3)于 37c 培養(yǎng)直至長出單菌落。五、實驗結果與討論LB 液體培養(yǎng)基是淡黃色清液，接種大腸桿菌過夜培養(yǎng)后，若有細菌生長，則培養(yǎng)基變渾濁(說明菌體復生長)。本次實驗成功得到大腸桿菌培養(yǎng)液。實驗二質粒DNA的提取一、目的學習堿裂解法提取質粒的原理二、原理質粒是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子， 具有雙鏈閉環(huán)結構的 DNA 分子。 它具有自主復制能力，能使子代細胞保持它們恒定的拷貝數(shù)，可表達它攜帶的遺傳信息。目前，經(jīng)人工改造的質粒已廣泛用作基因工程中目的基因的運載工具一一載體。質粒 DNA 的提取是依據(jù)質粒 DNA 分子較染色體 DNA 分子小，且具有超螺旋

6、共價閉合環(huán)狀的特點，從而將質粒 DNA 與大腸桿菌染色體 DNA 分離?，F(xiàn)在常用的方法有：堿裂解法、密度梯度離心法、煮沸裂解法等。實驗室普遍采用的堿裂解法具有操作簡便、快速、得率高的優(yōu)點。其主要原理：利用染色體 DNA 與質粒 DNA 的變性與復性的差異而達到分離的目的。在堿變性條件下，染色體 DNA 的氫鍵斷裂，雙螺旋解開而變性，質粒DNA 氫鍵也大部分斷裂，雙螺旋也有部分解開，但共價閉合環(huán)狀結構的兩條互補鏈不會完全分離，當 pH=4.8 的乙酸鈉將其 pH 調到中性時，變性的質粒 DNA 又恢復到原來的構型，而染色體 DNA 不能復性，形成纏繞的致密網(wǎng)狀結構，離心后，由于浮力密度不同，染色

7、體 DNA 與大分子 RNA、蛋白質-SDS 復合物等一起沉淀下來而被除去。三、實驗材料、試劑與主要儀器（一）實驗材料含質粒的大腸桿菌 DH5x（二）試劑1. LB 液體培養(yǎng)基：胰蛋白凍 10g,酵母提取物 5g,NaCl10g,溶解于 1000mL 蒸儲水中，用NaOH 調 pH 至 7.0。高壓滅菌 20 分鐘。2. LB 平板培養(yǎng)基：在每 1000mLLB 液體培養(yǎng)基中中加入 15g 瓊脂，高壓滅菌 20 分鐘。（三）儀器1 .Eppendorf 管、離心管架2 .10,100,1000 小微量加樣器3 .臺式高速離心機4 .搖床、高壓滅菌鍋四、操作步驟（一）培養(yǎng)細菌將帶有質粒的大腸桿菌

8、接種于 LB 平板培養(yǎng)基上， 37c 培養(yǎng) 24 小時， 然后從平板上挑取單菌落，接種于 5ml 液體培養(yǎng)基中，37c 培養(yǎng) 12 小時。（二）提取步驟1、 柱平衡步驟： 向吸附柱 CP3 中 （吸附柱放入收集管中） 加入 500NL 的平衡液 BL,12,000rpm（13,400Xg）離心 1min,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（請使用當天處理過的柱子）2、取 1-5mL 過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，使用常規(guī)臺式離心機，10000rpm（13,400 xg）離心 1min,盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。3、向留有菌體沉淀的離心管

9、中加入 250 仙 L 溶液 P1（請先檢查是否已加入 RNaseA）,使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌沉淀。【現(xiàn)象：均勻振蕩，直至看不見菌塊，菌液變?yōu)槿榘咨Ｗ⒁猓喝绻形磸氐谆靹虻木鷫K，會影響裂解，導致提取量和純度偏低】4、向離心管中加入 250NL 溶液 P2,溫和地上下翻轉 6-8 次使菌體充分裂解?！粳F(xiàn)象：此時菌體裂解，菌液變得清亮粘稠。注意：溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免打斷基因組 DNA,造成提取的質粒中混有基因組 DNA 斷裂片段。 該步驟操作應快， 所用時間不超過5 分鐘，以免質粒受到破壞。如果未變得清亮，可能是由于菌體過多，裂解不徹底，應減少菌體量?！?、向離心管中加入

10、350NL 溶液 P3,立即溫和地上下翻轉 6-8 次，充分混勻，此時將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12,000rpm(13,400 xg)離心 10min,此時在離心管底部形成沉淀?！粳F(xiàn)象：產(chǎn)生白色絮狀物。注意：P3 加入后應立刻混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。16、將上一步收集的上清液(只轉移 800 仙 L 上清液)用移液器轉移到吸附柱 CP3 中(吸附柱放入收集管中)，注意盡量不要吸出沉淀。12,000rpm(13,400Xg)離心 30-60sec,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CP3 放入收集管中。7、向吸附柱 CP3 中力口入 600 仙 L 漂洗液

11、 PW(請先檢查是否已加入無水乙醇)，12,000rpm(13,400Xg)離心 30-60sec,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CP3 放入收集管中。8、重復操作步驟 7。9、將吸附柱 CP3 放入收集管中，12,000rpm(13,400Xg)離心 2min,目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。【漂洗液中的乙醇殘余會影響后續(xù)的酶反應(酶切、PCR 等)實驗。為確保下游實驗不受殘留乙醇的影響，將吸附柱 CP3 開蓋，置于超凈工作臺上風干五分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。】10、將吸附柱 CP3 置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加 50-100 仙 L 洗脫緩沖液 EB,室溫

12、放置 2min,12,000rpm(13,400Xg)離心 2min 將質粒溶液收集到離心管中。(三)瓊脂糖凝膠電泳法檢測提取的質粒 DNA五、實驗結果與分析注：泳道 5 為 Ladder,最上方條帶為 2kb分析：由結果與 Ladder 比對可知，成功提取出 3.5kb 的質粒。六、討論（一）P1,P2,P3 的成分P1：葡萄糖（提供滲透壓，避免細胞破裂），RNA 酶，鹽酸，EDTA（螯合出核酸酶的金屬離子，避免 DNA 被降解）P2:SDS（一種去污劑，易起泡，溶解細胞膜），NaOH（堿性物質，促進肽聚糖水解，幫助裂解細胞膜）P3:醋酸和酉 t 酸鉀，PH=4.85.2（二）P1,P2,P

13、3 的作用P1:起著懸浮細菌的作用，PH 值為中性。P2:起著裂解細菌的作用，為堿性，這一步又稱為堿裂解。P3 為酸性，中合 P3.P2 加了一倍,P3 也加一倍，同樣起到中和的作用.當然，如果你用試劑盒提，最后離心上柱的液體量會多一些，一次加不完可兩次加入.電泳時在樣品中加入澳酚藍的目的，以及在澳酚藍中加入甘油和蔗糖的原因1、加入澳酚藍的目的：（1）澳酚藍呈藍色，而蛋白質是白色，在凝膠中不明顯。（2）澳酚藍的相對分子量比蛋白質（絕大部分）小，電泳時速度比蛋白質稍快，因此可用作指示。（3）可以根據(jù)澳酚藍電泳產(chǎn)生的藍色條帶位置判斷電泳結束時間（一般當澳酚藍跑到末端時停止電泳）。若無澳酚藍，不好把

14、握蛋白質電泳到槽底的時間。如果所有的蛋白質都電泳到了底部，就不能區(qū)別出具移動速度對應于相對分子質量的關系。2、加入蔗糖和甘油的目的：跑膠前都會在 Buffer（緩沖器）里的，并要和樣品充分混合，只是因為蔗糖和甘油比重大，可以使樣品沉到點樣孔中，在點樣孔底部鋪成一線，避免樣品漂逸，從而可以最大限度地跑到膠里去，得到更好的實驗結果。實驗三瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA一.目的學習瓊脂糖凝膠電泳，檢測 DNA 的純度，DNA 的構型，含量以及分子量的大小。二.原理瓊脂糖凝膠電泳是基因工程操作中最常規(guī)的實驗方法，它簡單易行，只需少量的 DNA 就能檢測。其原理是澳化乙噬在紫外光照射下能發(fā)射熒光，當 DNA

15、 樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時，瓊脂糖凝膠中的 EB 就插入 DNA 分子中形成熒光絡合物；使得 DNA 發(fā)射的熒光，增強幾十倍。而熒光的強度正比于 DNA 的含量，如將已知濃度的標準樣品做瓊脂糖凝膠電泳的對照， 就可比較出待測樣品的濃度。 電泳后的瓊脂糖凝膠塊直接在紫外光下照射拍照， 只需 510ngDNA,就可以從照片上比較鑒別。 如肉眼觀察， 可檢測至 U0.010.1ng的 DNA。在凝膠電泳中，DNA 分子的遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比。DNA 分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應與分子篩效應，前者由分子所帶凈電荷的多少而定，后者則主要與分子大小及構型有關。DNA 分子在高于其等電點的

16、溶液中帶負電荷。在電場中向著正極移動，在用電泳法檢測 DNA 分子時，應當盡量減少電荷效應。增加凝膠的濃度可以在一定程度上降低電荷效應，使得分子的遷移速度主要由分子受凝膠阻滯程度差異所決定，提高分辨率。同時適當降低電泳時的電壓，也可以使分子篩效應相應增強而提高分辨率。當然也可以用同樣的方法檢測 RNA。三、試劑與主要儀器（一）試劑1 .DNA 樣品2 .TBE 緩沖液（5 的：用時需稀釋 10 倍（配制見附錄）3 .點樣緩沖液 Loadingbuffer（10R：0.25%澳酚藍，40%甘油4 .澳乙噬（EB）:10mg/ml 澳乙呢（注意：該試劑具致癌作用，用時要小心）5 .瓊脂糖（二）儀器

17、1 .電泳儀系統(tǒng)2 .紫外燈3 .恒溫水浴箱四、操作步驟1 .選擇合適的水平式電泳儀，調節(jié)電泳槽平面至水平，檢測穩(wěn)壓電源與正負極的線路。2.選擇孔徑大小適宜的點樣梳，垂直架在電泳槽負極的一端，使得點樣梳的底部與電泳槽水平面的距離為 0.51.0mm。3 .制備瓊脂糖凝膠：按照被分離的 DAN 分子的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量。一般情況下可參考下表：瓊脂糖的含量（%）分離線裝 DNA 分子的有限圍（kb）0.360-50.620-10.7100.80.97-0.51.26-0.41.54-0.22.03-0.1稱取瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中，一般配制約 40ml 凝膠液，置微波爐中或水浴加熱

18、，至瓊脂糖融化均勻?！颈敬未髮嶒灜傊呛恐饕獮?0.70.9%。】4 .將凝膠槽洗凈擦干，兩端用膠布封好，并在一端插好梳子。待凝膠溶液冷卻至 60C 左右時，在凝膠溶液中加 EB（EB 最終濃度為 0.5 微克/毫升），搖勻，輕輕倒入電泳槽水平板上，除掉氣泡。待凝膠完全凝固后，去掉兩端封條，將凝膠槽移至電泳槽（槽中已加入 TBE緩沖液），然后小心地拔掉梳子保持點樣孔完整。注意：緩沖液要高出凝膠面 2mm05 .待測的 DNA 樣品中，加入 1/5 體積的點樣緩沖液，混勻后小心的進行點樣，記錄樣品點樣順序和點樣量。6.開啟電源開關，最高電壓不超過 5V/cmo7 .泳時間看實驗的具體要求而異，

19、在電泳中途可用紫外燈直接觀察，DNA 各條區(qū)帶分開后電泳結束。一般 20 分鐘至 3 小時，取出電泳凝膠塊直接檢測拍照?！咀⒁馐马棧褐颇z過程中如果出現(xiàn)氣泡，應及時挑破，以免影響后續(xù)的跑膠過程】實驗四質粒DNA酶切及瓊脂糖電泳分析鑒定一、目的學習質粒的酶切及電泳分析。二、原理限制性切酶可以識別雙鏈 DNA 特定位點，并產(chǎn)生特異的切割，形成粘性末端或平末端，這樣有利于 DNA 片段再連接。限制性切酶對環(huán)狀質粒 DNA 有多少切點，酶切后就能產(chǎn)生多少個片段。因此，鑒定酶切后的片段在電泳凝膠的區(qū)帶數(shù)，就可以推斷切點的數(shù)目；從片段遷移率的大小可以判斷酶切片段大小的差別。用已知相對分子量 DNA 為對照，

20、通過電泳遷移率的比較，可以粗略地測出分子形狀相同的未知 DNA 的相對分子質量。質粒 DNA 在細胞有三種構象：共價閉環(huán) DNA,常以超螺旋形式存在；如果兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉而消除鏈的力，形成開環(huán) DNA;線狀 DNA,雙鏈 DNA 斷開成線狀。電泳時，三種構象中，共價閉環(huán) DNA 遷移率最大，其次是線狀 DNA 和開環(huán) DNA。因此在本實驗中，質粒在電泳中呈現(xiàn) 23 條區(qū)帶。三、試劑與主要儀器（一）試劑1 .EcoRI 酶2 .入 DNA3 .TBE 緩沖 7夜（5X）:用時需稀釋 10 倍4 .點樣緩沖液 Loadingbuffer（10 的：0.25%!酚藍，

21、40%甘油5 .澳乙噬（EB）:10mg/ml 澳乙呢（注意：該試劑具致癌作用，用時要小心）6 .瓊脂糖（二）儀器1 .電泳儀系統(tǒng)2 .紫外燈3 .恒溫水浴箱四、操作步驟（一）質粒 DNA 酶切1 .按下表將各種試劑分別加入每個 Eppendorf 管中：質粒 DNA15EcoRI/03酶切 Buffer(10X)/jl2ddH2O/pl102 .加樣后混勻，置于 37c 水浴中，保溫 2 小時。然后每個管中加入 2dLoadingbuffero（二）瓊脂糖凝膠電泳1 .瓊脂糖凝膠的制備稱取 0.4g 瓊脂糖加入 40ml0.5kBE 緩沖液中， 加熱熔解。 冷卻至 65c 時加入 2MEB,

22、混勻。2 .膠板制備將凝膠槽洗凈擦干，兩端用膠布封好，并在一端插好梳子。然后倒入熔好的瓊脂糖，待凝膠完全凝固后，去掉兩端封條，將凝膠槽移至電泳槽（槽中已加入 0.5XTBE 緩沖液），拔掉梳子。注意：緩沖液要高出膠面 2 毫米。3 .加樣每個樣品中加入 1/10 體積點樣緩沖液，混勻后小心地加入樣品槽中，要避免相互污染。4 .電泳觀察接通電源，電壓為 80V,電泳 1 小時左右，當澳酚藍到達下沿 1-2cm 處時，停止電5 .觀察及照相將膠板拿出，用自來水小心地沖洗一下。在紫外燈下觀察結果，如果有條件也可用凝膠成像系統(tǒng)照相。五、實驗結果與討論分析注：泳道 2 為 Marker,其余泳道為小組成

23、員樣品，泳道 6 為我加的樣品。由電泳結果 Ladder 比較可知，500bp 處有一條較淺的條帶，含量十分少，是酶切得到的片段。上方較亮的的條帶是 3kb,這是酶切后剩余的質粒。 由于酶切后產(chǎn)生的相同粘性末端， 因此也可以發(fā)生互補連接，形成環(huán)狀。電泳結果說明成功得到酶切片段。2go出f產(chǎn)N/-MJUp250bo實驗五聚合酶鏈反應（PCR）技術體外擴增DNA一、目的1 .學習 PCR 反應的基本原理和實驗技術。2 .了解引物設計的一般要求。二、原理聚合酶鏈反應（polymerasechainreactionPCR）是體外酶促合成 DNA 片段的一種技術。利用 PCR 技術可在數(shù)小時之大量擴增目

24、的基因或 DNA 片段，以用于基因工程操作。PCR 進行的基本條件：DNA 模板（在 RT-PCR 中模板是 RNA）引物dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）TaqDNA 聚合酶反應緩沖體系PCR 循環(huán)由三個步驟組成：變性使模板 DNA 解離成單鏈；退火使引物與模板 DNA 所需擴增序列結合；延伸 DNA 聚合酶利用 dNTP 合成與模板堿基序列互補的 DNA 鏈。每一個循環(huán)的產(chǎn)物可作為下一個循環(huán)的模板，通過 30 個左右循環(huán)后，目的片段的擴增可達 106倍。引物設計：要保證 PCR 反應能準確，特異，有效的對引物 DNA 進行擴增，通常引物設計要遵循以下原則：引物長度：1525

25、 個核甘酸；GC 含量為 40%60%;Tm 值為 55c（Tm=4（C+G）+2（A+T）計算；引物與非特異配對位點的配對率小于 70%;引物自身配對形成的莖環(huán)結構，莖的堿基對小于 3,兩條引物間配對堿基數(shù)小于 5 個。由于影響引物的設計的因素比較多，所以常常利用計算機來輔助設計。本實驗以實驗二中提取的質粒 DNA 為模板，進行 PCR 擴增，大量得到目的 DNA 片段。三、試劑與儀器（一）試劑1.TaqDNA 聚合酶2.10 汶應緩沖液（含 25mmolMgC03 .dNTP4 .引物（P1、P2）5 .澳乙噬（EB）:10mg/ml 澳乙%注意：該試劑具致癌作用，用時要小心。6 .點樣緩

26、沖液 Loadingbuffer（10R：0.25%!酚藍，40%甘油。（二）儀器1 .PCR 擴增儀2 .電泳儀3 .臺式離心機4 .紫外分析儀5 .恒溫水浴6 .凝膠成像系統(tǒng)四、操作步驟（一）PCR 擴增1 .按下表加入試劑，并小心混勻。模板為實驗一中提取的質粒 DNA試齊體積(301)ddH2O9.5|xPrimerM13F(10pM)1dPrimerM13R(10pM)1d模板1M2xTaqMix12.50【2xTaqMix:Taq,TrisKel,dNTP（濃度為 2.5mmol）,Mg2+/Mn2+【Mg2+濃度上升，擴增增多但易出雜帶；濃度低擴增慢但特異性高】2 .設置 PCR

27、程序：94C180s994C45s33cycles:55c45sL72C45s72C600s3 .運行 PCR 程序（二）PCR 產(chǎn)物鑒定反應結束后，取 20/PCFT 物進行 1.2%瓊脂糖電泳分析。五、實驗結果分析：與 Ladder 比較可知，主條帶位于 500bp 與 750bp 之間，大約為 600bp,這是由于目標DNA為500bp,擴增后的產(chǎn)物為目標DNA500bp和其兩端的引物片段長度， 因此大于目標DNA的長度。由實驗結果可知，通過 PCR 擴增成功得到了目標 DNA 片段。實驗六地高辛標記的Southern雜交一、目的學習 Southern 雜交的原理及操作方法。二、原理19

28、75 年 Southern 發(fā)明了 Southernblot 分子雜交方法。 這項技術包括在瓊脂糖凝膠上按片段大小電泳分離待檢的 DNA;用 NaOH 對凝膠中的 DNA 進行變性處理；通過毛細管作用將單鏈 DNA 吸附到硝酸纖維素膜上；然后用標記好的探針進行雜交，洗掉沒有雜交的游離探針；經(jīng)放射性自顯影（放射性標記探針）或生化檢測（非放射性標記）就可以證明基因片段與已知探針是否具有同源性，達到檢測樣品基因的目的。因此，Southern 印跡雜交包括兩個步驟把電泳分級的 DNA 轉移到固定支持膜上。與標記的 DNA 探針雜交。地高辛隨機引物法標記的原理：在隨機引物法標記的反應液中，有隨機合成的六

29、聚核甘酸作為引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP 和 D1G-11-dUTP 作為合成底物，以單鏈 DNA 作為模板， 在 Klenow 酶的作用下， 合成插入地高辛的 DNA 鏈。 以地高辛標記的探針與靶基因 DNA鏈雜交后，再通過免疫反應進行檢測。一般通過酶標記地高辛抗體檢測，就可以肯定雜交反應的存在。免疫檢驗一般用堿性磷酸酶系統(tǒng)，BClP/NBT 顯色,敏感性很高。所用的雜交膜可以選擇硝酸纖維素和尼龍膜。硝酸纖維素膜的優(yōu)點在于本底較低，但只能用于顯色性檢測，且不能用于重復雜交。尼龍膜分為帶正電的膜和不帶電的膜兩種。帶正電的膜對核酸結合力強，敏感性也高。不帶電的結合力低。敏感性差。

30、尼龍膜的優(yōu)點在于雜交用過的膜，用洗脫液（0.1 冶 SC,0.1%SDS）煮沸 5-10 分鐘后去探針，可用于新的探針雜交。如果對雜交結果不滿意，如背景太高或顯色不強，也可洗去探針之后重新雜交。三、試劑與器材（一）試劑1. DIGRandomLabelingMix（高效）2. Anti-DIG-APConjugate3. BCIP/NBTStockSolution4. BlockingReagent5. 20SSC:0.3M 檸檬酸鈉，3MNaCl6. 2SSC:0.03M 檸檬酸鈉，0.3MNaCl7. 0.2MEDTA8. 變性液：0.5NNaOH,1.5MNaCl9. 中和度：0.5MT

31、ris-HCl,pH7.4,3MNaCl10. Standardbuffer5SSC,0.1%（w/v）N-Lauroylsarcosine,0.02%（w/v）SDS,1%BlockingReagent11. Standardbuffer+50%formamide12. Anti-DIG-AP 堿性磷酸酶標記抗地高辛單抗體13. BCIP/NBT 儲備液：14. 沖洗液：0.1MTris-HCl,0.15MNaCl.pH=7.5.15. 封閉液：1%BlockingReagent/0.1MTris-HCl,0.15MNaCl.16. 顯色緩沖液：0.1mMTris-HCl,0.1MNaCl,

32、pH=9.5【堿性磷酸酶要在堿性條件下反應】.17. TE 緩沖液:10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.018.WashSolutionI:2xSSC,0.1%SDS19. WashSolutionII:0.5xSSC,0.1%SDS（二）儀器1 .臺式離心機2 .恒溫水浴3 .白磁盤4 .雜交爐5 .電泳系統(tǒng)6 .硝酸纖維素膜或尼龍膜7 .封口機四、操作步驟（一）探針的標記1 .用滅菌去離子蒸儲水稀釋 1 仙 gDNA總體積 16 仙 J2 .DNA 熱變性：把 DNA 置于沸水中，水浴 10 分鐘。然后，迅速地插入碎冰中 3 分鐘以上。3 .加 4 卜 lDIGRandomL

33、abelingMix（S 效）,混勻后再 2000RPM 離心 5 分鐘。4 .置于 37c 反應至少 120 分鐘。時間越長，產(chǎn)量越高。延長反應時間至 20 小時可明顯增加地高辛標記 DNA 的產(chǎn)量。應根據(jù)需要控制反應時間。5 .加入 2 卜 lEDTA 以終止反應，對于原位雜交和膜反應雜交來說，標記反應可告結束，上述反應液置于-20C 保存至少一年以上。且可反復使用。可根據(jù)下表估計標記產(chǎn)量：單位（ng）DNA 模標記一小時標記二十小時10456003013010501002701500300450200010008502300300013502650（二）Southern 轉移1 .將目的

34、基因經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳的膠板從電泳槽中取出， 凝膠浸入 0.25MHCl 中 10 分鐘。HCl 處理的作用主要是通過喋吟使 DNA 分子斷裂，因而有利于高分子量 DNA 的轉移，但不能處理時間過長。要轉移全部小于 10kb 的 DNA 片段時可省略此步驟。2.進入變性液之前，用蒸儲水漂洗 20-30 分鐘。3.把凝膠浸入變性液中，室溫浸泡 15 分鐘 X2 次。4.蒸儲水漂洗凝膠 2 次。5.把凝膠浸入中和液中，室溫浸泡 15 分鐘 X2 次。6 .處理凝膠的同時，切一同樣大小的尼龍膜或者硝酸纖維素膜。硝酸纖維素膜用 2XSSC浸泡。剪兩 Whatman3#8 紙和吸水用的粗濾紙。（注意不要用手直接觸及膜面）7.準備轉移用平器和支架，平器中放 20 代 SC。支架上搭濾紙橋使得溶液能夠虹吸上來。8 .依次放：處理好的凝膠，硝酸纖維素膜，吸水紙，玻璃板，適量重物（500-1000g）o注意：檢查 pH 值，用硝酸膜時 pH2 次。（四）BCIP/NBT 顯色檢測法1 .經(jīng)過雜交及雜交后的沖洗之后，膜置于沖洗液中平衡 1 分鐘。2 .封閉液室溫封閉至少 60 分鐘?！驹陔s交管中做效率會更高】3 .用封閉液 1:2500-5000 稀釋 Anti-DIG-AP,例如 20 仙 lAnti-DIG-AP 加至 20ml 封閉液中（根據(jù)染況而調整）【加