新生小鼠小腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究

1、新生小鼠小腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究         10-10-15 11:50:00     作者：于彬，韓鵑，梅峰    編輯：studa20【摘要】  目的探討在新生小鼠小腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cells of Cajal，ICC）的發(fā)育過(guò)程中是否出現(xiàn)增殖。方法采用新生2 d（P2d）、14 d（P14d）和24 d（P24d）的小鼠小腸，應(yīng)用BrdU腹腔注射，24 h后取材，Kit和

2、BrdU免疫熒光染色。結(jié)果P2d小鼠小腸，可見(jiàn)大量Kit/BrdU雙重標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞，這些細(xì)胞的形態(tài)與成熟ICC基本相似，這些細(xì)胞在P14d時(shí)減少，而在P24d消失。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，不同時(shí)間點(diǎn)之間Kit/BrdU雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量存在顯著差別（P0.05）。結(jié)論在小腸生后發(fā)育過(guò)程中，出現(xiàn)了ICC增殖，而這種增殖在發(fā)育過(guò)程中逐漸減弱，最后在成年前消失。 【關(guān)鍵詞】  Cajal間質(zhì)細(xì)胞；增殖；Kit蛋白；BrdUA study on interstitial cells of Cajal proliferation in murine small intestine during post

3、natal peroid    YU Bin, HAN Juan, MEI Feng (Department of Histology and Embryology, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)    Abstract: Objective To investigate the appearance of interstitial cells of Cajal proliferation during postnatal development

4、. Methods Postnatal mice aged 2 days (P2d), 14 days (P14d) and 24 days (P24d) were used, and intraperitoneally injection of BrdU was carried out 24 hours before sacrifice. Immunohistochemcal staining with either Kit or BrdU antibody was performed to reveal the proliferative ICC. Results Kit/BrdU dou

5、ble labeling cells were found out in the small intestine of 2days old mice, and these cells were similar with mature ones in features. And those cells reduced at P14d and vanished at P24d. Conclusion Our result indicated that ICC proliferate during the postnatal development, and the proliferation gr

6、adually reduced and vanished before adulthood.    Keywords: interstitial cells of Cajal; proliferation; Kit; BrdU    Cajal細(xì)胞（interstitial cells of Cajal，ICC）是100多年前Cajal應(yīng)用鍍銀技術(shù)和甲基藍(lán)染色，在豚鼠和家兔小腸描述的一種特殊的間質(zhì)細(xì)胞，現(xiàn)通常稱(chēng)為Cajal細(xì)胞或ICC。在小腸內(nèi)環(huán)行平滑肌和縱行平滑肌之間，肌間神經(jīng)叢周?chē)植贾鳬CC，這些細(xì)胞呈網(wǎng)絡(luò)狀分布，是小腸自主節(jié)律

7、性運(yùn)動(dòng)的起搏細(xì)胞和興奮傳導(dǎo)細(xì)胞13。近年研究表明ICC與一些胃腸運(yùn)動(dòng)功能障礙性疾病，如賁門(mén)失遲緩癥、糖尿病性胃輕癱以及慢性便秘等密切相關(guān)4。盡管這些疾病發(fā)生機(jī)制尚不清楚，但均可見(jiàn)ICC數(shù)量存在不同程度減少，細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)完整性被破壞等病理改變。研究發(fā)現(xiàn)新生兒先天性巨結(jié)腸、假性腸梗阻等疾病中5，都存在ICC細(xì)胞的丟失，或缺失，提示生后ICC的變化可能與胃腸道運(yùn)動(dòng)功能障礙性疾病的發(fā)生有關(guān)。目前對(duì)動(dòng)物生后ICC的發(fā)育研究發(fā)現(xiàn)，ICC在小鼠出生時(shí)出現(xiàn)，而且這些細(xì)胞在大約48 h內(nèi)發(fā)育成熟成為具有自主節(jié)律性的起搏細(xì)胞6。在生后發(fā)育過(guò)程中，小腸的直徑和長(zhǎng)度都發(fā)生了巨大的變化，成年小鼠小腸的直徑和長(zhǎng)度是新生小鼠的

8、數(shù)十倍。我們?cè)谇捌诘难芯窟^(guò)程中觀察到，成年動(dòng)物ICC沒(méi)有增殖現(xiàn)象，而ICC在生后發(fā)育過(guò)程中，是否出現(xiàn)細(xì)胞增殖，尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究采用BrdU腹腔注射，觀察24 h后，通過(guò)標(biāo)記ICC的特異性標(biāo)志物Kit蛋白，同時(shí)觀察BrdU是否摻入Kit陽(yáng)性細(xì)胞，期望了解動(dòng)物生后ICC是否出現(xiàn)了增殖。    1材料與方法    1.1材料新生2、14、24 d小鼠（第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），雌雄不限，分為三組，新生2 d為P2d組，14 d為P14d組，24 d為P24d組，每組3只動(dòng)物，共9只小鼠。Kit單克隆抗體購(gòu)自eBIOSCIENC

9、E公司，Cy3標(biāo)記的兔抗大鼠IgG抗體、BrdU單克隆抗體和FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體均購(gòu)自DAKO公司。    1.2方法    1.3半定量分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理選各組鋪片5張，熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)Kit陽(yáng)性和Kit/BrdU雙標(biāo)記陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用SPSS11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P0.05具有顯著性差異。    2結(jié)果Kit免疫熒光顯示，Kit陽(yáng)性的ICC在肌間神經(jīng)叢周?chē)示W(wǎng)絡(luò)狀分布，P2d組ICC網(wǎng)絡(luò)基本形成，但是細(xì)胞數(shù)量較少，而且細(xì)胞的突起較少（圖1a），說(shuō)明此時(shí)

10、的ICC多為幼稚細(xì)胞。P14d組小鼠小腸ICC細(xì)胞密度較高，形成較完整的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)（圖1b）。P24d組小腸ICC具有粗大的初級(jí)突起和多個(gè)次級(jí)突起，這些突起相互之間連接成細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)（圖1c）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示生后不同時(shí)期ICC的細(xì)胞密度存在明顯差別（P0.05）。    a：生后2 d，ICC細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞突起較細(xì)而稀疏；b：生后14 d可見(jiàn)ICC的突起較粗大并有多級(jí)分支，形成細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)；c：生后24 d，ICC細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)完整，可見(jiàn)細(xì)胞突起相互連接    圖1Kit免疫熒光染色顯示生后不同時(shí)期小鼠小腸ICC的變化  

11、60; BrdU染色標(biāo)記在細(xì)胞核，Kit/BrdU雙重免疫熒光染色顯示，在P2d組小腸存在較多雙標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞，這些細(xì)胞的外形與成熟ICC略有不同，細(xì)胞的突起較細(xì)而稀少（圖2ac），計(jì)數(shù)顯示雙標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞密度約為178個(gè)/mm2。P14d組雙標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞減少，大約為100個(gè)/mm2，此時(shí)雙標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)與成熟ICC基本相似（圖2df）。而在P24d組未見(jiàn)雙標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)（圖2gi），說(shuō)明接近成年時(shí)ICC增殖已停止。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組Kit/BrdU雙標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量存在顯著差異（P0.05）。對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性。3討論本研究組最近研究發(fā)現(xiàn)，胎兒小腸壁內(nèi)ICC在妊娠912周出現(xiàn)后，數(shù)量隨胎齡

12、增加而增多，突起逐漸延長(zhǎng)，至胚胎中晚期ICC彼此間形成完整的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。Kluppel等報(bào)道在小鼠胚胎期1214 d可見(jiàn)ICC出現(xiàn)7，隨后ICC逐漸增多，構(gòu)成肌間神經(jīng)叢周?chē)腎CC細(xì)胞群，出生后數(shù)日內(nèi)ICC的數(shù)量可迅速增加到出生時(shí)的3倍以上。體外培養(yǎng)研究也表明，在干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）存在下，小鼠胚胎期18 d和出生后2 d的ICC具有增殖能力8，且在一定范圍內(nèi)與SCF的濃度呈正相關(guān)。以上結(jié)果提示在胚胎發(fā)育階段，ICC具有一定的增殖能力，細(xì)胞突起亦能生長(zhǎng)延長(zhǎng)。成年動(dòng)物注射BrdU，標(biāo)記分裂、增殖的細(xì)胞，但未能發(fā)現(xiàn)ICC呈BrdU陽(yáng)性，推測(cè)可能與ICC的存活時(shí)間較長(zhǎng)、更替慢、正常情況下難以捕捉有關(guān)9。出生后ICC是否仍然具有增殖能