多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定方案總結(jié)

1、經(jīng)過(guò)分級(jí)純化的多糖在測(cè)定結(jié)構(gòu)前須檢查其純度及測(cè)定分子量。檢查純度最常用的判斷方法：(1)用 GC、HPLC 測(cè)定組成多糖的單糖的摩爾比是否恒定。用不同的柱型測(cè)定結(jié)果更為可靠。(2)電泳只出現(xiàn)一條帶。如可用聚丙烯酰胺凝膠電泳、乙酸纖維素薄膜電泳及玻璃纖維紙電泳。對(duì)于中性多糖可采用高壓電泳，以硼酸鹽為緩沖液，可增大其遷移速度。(3)凝膠柱層析圖呈現(xiàn)對(duì)稱的單峰。若有“拖尾”現(xiàn)象，說(shuō)明其均一性不夠好。陰離子交換層析純化用 DEAJ 纖維素 52(2.6x100cm)柱層析，0.lmol/LNaCl 洗脫,流速 6ml/h,按 2ml 一管分部收集，苯酚一硫酸法逐管檢測(cè)，繪制收集體積與糖含量之間的關(guān)系曲

2、線?？词欠裼袉我粚?duì)稱峰。試管編號(hào)試管編號(hào)Niunberaftubes除 a 妥蕾 PW2 柱色詁圖按照 Ye 等報(bào)道，采用 DEAJ52 一纖維素交換柱層析法(2.6x30cm)對(duì)鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖進(jìn)行初步分離。DEAJ 纖維素凝膠預(yù)處理：稱取 DEAE-52 一纖維素凝膠干粉，加入約 10 倍體積質(zhì)量比(ml/g)的 0.5mol/LNa0H 溶液浸泡 30 分鐘， 倒出上清液， 用大量去離子水反復(fù)浸洗至pH 值近中性；再用相同體積的 0.5mol/LHCI 溶液浸泡 30 分鐘，倒出上清液，用大量去離子水反復(fù)浸洗至 pH 值近中性；最后用相同體積的 0.5mol/lNaOH 溶液再浸泡

3、 30 分鐘，用大量去離子水反復(fù)浸洗至 pH 值中性。處理完畢后，進(jìn)行濕法裝柱，用去離子水 0.5mol/LNaCl 溶 1,去離子水依次分別平衡(流速 1.0ml/min)23 個(gè)柱體積備用.糖樣 100mg 溶于 5ml 的去離子水中，離心除去不溶物，上樣于 DEAJ52 一纖維素陰離子層析柱(2.6x30cm,Cl-1型)，分別采用去離子水 0.1 和 0.3mol/LNaCI 溶液進(jìn)行分段梯度洗脫，流速 1.0ml/min,自動(dòng)收集器分部收集(10ml/管)，每梯度 20 管。用硫酸一苯酚法跟蹤檢測(cè)各管多糖含量(490nm 處吸收值),以收集的管數(shù)為橫坐標(biāo)。吸光值(490nm)為縱坐標(biāo)

4、繪制 DEAE一 52 一纖維素色譜柱洗脫曲線。依據(jù)洗脫峰型，合并相同組分，50C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，對(duì)去離子水透析 48h 以去除 NaCI 及小分子雜質(zhì)，最后將透析內(nèi)液冷凍干燥，得初步純化產(chǎn)品。初步純化多糖得率計(jì)算公式：多糖得率(尸純化多糖質(zhì)量/粗多糖質(zhì)量 x100%葡聚糖凝膠層析純化采用 SephadexG-100 凝膠層析法對(duì) DEAE-52纖維素初步純化的不同組分的多糖樣品進(jìn)一步純化。葡聚糖凝膠(sephadexG100)的預(yù)處理：稱取 sephadexG100 凝膠干粉，加入 30 倍體積質(zhì)量比(ml/g)的去離子水，沸水浴 5 小時(shí)使其溶脹。冷卻后用去離子水反復(fù)浸洗,減壓脫氣后進(jìn)行濕

5、法裝柱，用 0.1MN&SQ;溶液平衡(流速 0.25ml/min)23 個(gè)柱體積備用。分別稱取經(jīng) DEA1 纖維素一 52 初步純化的各多糖組分樣品 20mg,溶于 2ml0.1MNaSO 溶液中，上樣于 SephadexG100 層析柱(2.6x60cm)用 0.1MN&SO 溶液溶液洗脫，流速0.25ml/min,分步收集(5ml/管)。用硫酸一苯酚法跟蹤檢測(cè)各管多糖含量(490nm 處吸 U值),以收集的管數(shù)為橫坐標(biāo)。吸光值(490nm)為縱坐標(biāo)繪制 sePhadexG100 色譜柱洗脫曲線。依據(jù)洗脫峰型，合并相同組分,50C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，對(duì)去離子水透析 48h 以去

6、除 NaSO;及小分子雜質(zhì)，最后將透析內(nèi)液冷凍干燥，得不同純化產(chǎn)品。純化多糖得率計(jì)算公式：純化多糖得率(尸純化多糖質(zhì)量/粗多糖質(zhì)量 x100%(鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖)(4)紙層析法呈單一集中斑點(diǎn)。取 0.5%的多糖樣品溶液 50ul,點(diǎn)樣于新華中速濾紙(3cmx20cm)距端點(diǎn) 1cm 處的中部，以正丁醇：濃氨水： 水(4O:50:5)為展開(kāi)劑， 飽和 2 小時(shí)以上，在室溫下展開(kāi) 6h,取出吹干， 用 0.5%甲苯胺藍(lán)液染色，立即用 95 充醇漂洗至背景褪色，看是否只有一個(gè)清晰的斑點(diǎn)。(5)瓊脂糖(Agarose)凝膠電泳法在瓊脂糖板(厚度為 0.2cm)上點(diǎn)樣 35ul 采用濃度為 0.0

7、75mol/L,pH8.6 的巴比妥緩沖液，電泳1-1.5h,電壓為 64-80V,甲苯胺藍(lán)(濃度為 1%跺色，醋酸乙醇混合溶液(醋酸：乙酉 I:水=0.1:5:5)脫色。多糖純品經(jīng)電泳展開(kāi)后，看是否呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)，斑點(diǎn)是否清晰。(6)紫外分光光度法將多糖 PW 加 0.9%NaCI 溶液溶解，配成濃度為 1mg/ml 的溶液，采用 UV160A 紫外可見(jiàn)光譜儀掃描(200nm300nm 觀察 260nm280nm 處是否有吸收峰。多糖的分子量測(cè)定：過(guò)去用超速離心沉降法、光散射法、滲透壓法、粘度法等，這些方法操作復(fù)雜且誤差較大，現(xiàn)已少用。現(xiàn)在較常用的方法有凝膠過(guò)濾法和高效凝膠液相色譜法，這兩種方

8、法須先用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)多糖對(duì)照測(cè)定樣品的分子量。一般來(lái)說(shuō)，多糖結(jié)構(gòu)分析包括以下幾點(diǎn)：(1)單糖組成分析：研究確定單糖的種類及摩爾比；完全酸水解后用高效液相色譜方法(HPLC)或氣相色譜方法測(cè)定。(2)糖昔鍵類型：研究確定糖昔鍵及支鏈點(diǎn)連接位置；甲基化分析方法高碘酸氧化法與 Smith 降解法(3)糖環(huán)大小：研究確定糖甘鍵為味喃糖或口比喃糖；紅外光譜(4)異頭碳構(gòu)型：研究確定糖昔殘基的 a-或 P-構(gòu)型；2DNMR.(TwodimensionalNuclearMagneticResonance)光譜分析方法測(cè)(5)確定單糖殘基和重復(fù)單元的序列甲基化分析方法與磁共振光譜分析方法結(jié)合分析，一般會(huì)參

9、考多糖的單糖組成及摩爾比信息以利于解析多糖結(jié)構(gòu)。高碘酸氧化法薄層層析(TLc)定性，氣相色譜法(6)取代基團(tuán)位點(diǎn)：研究 0H-修飾基團(tuán)的種類和取代位點(diǎn)，如 0-磷酸化，乙醺基取代，0-硫酷化等；比色分析方法(7)多糖分子量分布的研究。紫外光譜定性與定量方法薄層層析：殘基定性氣相色譜：殘基定量氣質(zhì)聯(lián)用：殘基定量高效陰離子色譜法：殘基定量鑒定結(jié)構(gòu)常用物理化學(xué)方法：高效液相色譜：確定單糖組分和相對(duì)分子量紅外光譜分析：測(cè)定多糖的官能團(tuán)，不僅可以檢測(cè)酮糖、酵糖的恥喃糖環(huán)或味喃糖環(huán)的構(gòu)象和糖昔鍵的構(gòu)型核磁共振： a-構(gòu)型與 3-構(gòu)型殘基的比例； 判斷異頭碳構(gòu)型； 推斷主鏈和支鏈連接鍵型鑒定結(jié)構(gòu)復(fù)合方法：甲

10、基化分析：推斷出多糖樣品中糖基的連接方式及各種連接鍵型的比例高碘酸氧化法與 Smith 降解法：判斷糖昔鍵的位置、直鏈多糖的聚合度及支鏈多糖的分支數(shù)目糖睛乙酸酷衍生物的氣相色譜法：?jiǎn)翁墙M成和摩爾比各種多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定方法的具體實(shí)施方案1、酸水解(1)完全酸水解稱取20mg樣品,加入2mL2mol-L-1的H2SQ于安培管中沸水浴水解8h,水解液用BaCO中和至pH=7,離心，取上清夜置冰箱冷藏備測(cè)。(阿魏側(cè)耳子實(shí)體多糖分離純化及其化學(xué)結(jié)構(gòu)的初步研究)(2)部分酸水解稱取糖樣 70mg,80c 條件下，0.05M 三氟乙酸水解 2h。降至室溫后，離心(4000r/min,10min),將沉淀干燥

11、，留做 GC 分析。上清用無(wú)水乙醇除酸至中性(pH 為 6 夕)，蒸儲(chǔ)水透析 48h:將袋外透析液濃縮，真空干燥，留做 GC 分析；袋內(nèi)液濃縮至 5ml 左右，加 10 倍體積無(wú)水乙醇，醇沉過(guò)夜，離心(4000r/min,10min),沉淀常規(guī)干燥，作 GC 分析；上清濃縮，真空干燥，留做 GC 分析。2、高效液相色譜確定樣品的單糖組成色譜條件為：色譜柱為 ShodexKS804Sugar(300mmx7.8mm)柱溫 40 度流動(dòng)相為水-1流速 0.8mLmin檢測(cè)用 410RI 示差檢測(cè)器，數(shù)據(jù)處理用 810GP 電件進(jìn)行。同時(shí)用鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、木糖、果糖、葡萄糖、巖藻糖

12、 8 種單糖進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)峰值確定樣品的單糖組成。分子量的測(cè)定以標(biāo)準(zhǔn)分子量的葡聚糖 Pulluan 作分子量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。讓其通過(guò)高壓液相色譜柱，條件同上，先以分子量對(duì)數(shù)與對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖Pulluan 的工作曲線上可以求得該成分分子量。例如：（阿魏側(cè)耳子實(shí)體多糖分離純化及其化學(xué)結(jié)構(gòu)的初步研究）將水解后的多糖樣品 PW 斜彳 THPLC 分析，結(jié)果如表所示：阿魏側(cè)耳子實(shí)體多糖 PW2g 過(guò)酸水解后，得到 2 種單糖：葡萄糖和半乳糖，摩爾比例 1.77：1。例如：經(jīng) HPLC1 定后對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得多糖 PW2 勺分子量為 3.18X104。（阿魏側(cè)耳子實(shí)體多糖分離純化及其化學(xué)結(jié)

13、構(gòu)的初步研究）4、甲基化分析（1）基本原理先將多糖中各種單糖殘基中的游離羥基全部甲基化，然后將多糖中的糖昔鍵進(jìn)行完全酸水解，水解后得到的化合物，其羥基所在的位置，即為原來(lái)單糖殘基的連接點(diǎn)。同時(shí)根據(jù)不同甲基化單糖的比例，可以推測(cè)出此種連接鍵型在多糖重復(fù)結(jié)構(gòu)中所占的比例。用此種方法得到的羥基及 NaBH 還原醛基后產(chǎn)生的羥基，經(jīng)乙?；傻玫郊谆奶谴家宜狨ィù水a(chǎn)物易揮發(fā)，可進(jìn)行 GC 分析），再經(jīng) GCWGC-M 吩析，通過(guò)氣相色譜的出峰順序和對(duì)質(zhì)譜譜圖的主要離子碎片的分析便可以較準(zhǔn)確地確定糖的連接鍵型。反應(yīng)通式如下：0OH3C-SCH3+NaOHjCS-CH（二（二甲喝亞冊(cè)甲喝亞冊(cè). .（二甲

14、塔亞破橫雛俄離廣）（二甲塔亞破橫雛俄離廣）。0|yH3cSCHa父+ROHR-0Na+4.H3cs-CHsR-ONk+HjC-l*R-O-CHa+Nai城甲烷）（甲，甲一化糖）城甲烷）（甲，甲一化糖）（2）甲基化反應(yīng)取充分干燥的多糖樣品 10mg,溶解在 2.0ml 的二甲基亞磯（DMSO）中。在 N2 保護(hù)下快速加入干燥的 NaOH 粉 50mg,用 N2 排出空氣，加蓋密封，室溫反應(yīng) 1.0h 并間歇振蕩。在 N2 保護(hù)下緩慢滴加碘甲烷 1.0ml,用 N2 排出空氣，加蓋密封，室溫繼續(xù)反應(yīng) 1.0h 并間歇振蕩，反應(yīng)完成后加 0.5ml 水終止反應(yīng)。反應(yīng)液先用自來(lái)水流水透析 48h,再用

15、蒸儲(chǔ)水透析 24h,透析液冷凍干燥得第一次甲基化樣品。第一次甲基化樣品繼續(xù)甲基化，反應(yīng)步驟同上， 得第二次甲基化樣品。 如此重復(fù)甲基化三次。 甲基化后的樣品用紅外光譜檢測(cè)， 3700cm-1-3100cm1,附近無(wú)羥基的特征吸收峰，表明甲基化反應(yīng)完全。(3)甲基化樣品的衍生化上述完全甲基化多糖樣品加入 2mol/1 的三氟乙酸(TFA)3.0ml,120c 密閉水解 2.0h。冷卻后 50c 減壓蒸發(fā)干，加 2.0ml 甲醇再蒸發(fā)干，重復(fù)三次，最后蒸發(fā)干得完全甲基化多糖的水解產(chǎn)物。加蒸儲(chǔ)水 2.0ml 使其溶解，再加硼氫化鈉 25mg,振蕩后室溫還原反應(yīng) 2.0h。反應(yīng)完后滴加 0.1mol/

16、1 醋酸分解過(guò)量的硼氫化鈉并調(diào) pH 值至 5.57.0 弱酸性。反應(yīng)液 50C減壓蒸發(fā)蒸干，加 2.0ml 甲醇再蒸干，重復(fù)三次，最后蒸發(fā)干。上述蒸發(fā)干樣品加入 1.0ml 醋酸酊和 1.0ml 口比咤，封管后在沸水浴中反應(yīng) 1.0ho 反應(yīng)液 50c 減壓蒸發(fā)干，加 2.0ml 甲醇再蒸發(fā)干，重復(fù)三次，最后蒸發(fā)干。加入丙酮 1.0ml,用 0.45ul 尼龍微孔濾膜過(guò)濾，取樣進(jìn)行 GC/MS 分析。(4)衍生化木品的 GC/MS 分析多糖樣品經(jīng)甲基化、水解、還原、乙?；蟮玫郊谆谴家宜狨?，進(jìn)行 GC/MS 聯(lián)機(jī)分析，根據(jù)文獻(xiàn)的相對(duì)保留時(shí)間和不同單糖的主要離子碎片(m/e),推斷出多糖樣

17、品中糖基的連接方式及各種連接鍵型的比例。本實(shí)驗(yàn)采用的條件為：GC(VarianCP3800 型)和 MS(VarianSatum2200 型)氣相一質(zhì)譜聯(lián)用儀，DB-5MS 石英毛細(xì)管柱(30mX0.25mmX0.25um);程序升溫，初溫 80C,保持 1min,以 8C/min 升至 210C,保持 1min,再以 20C/min 升至 260C,保持 1min;氨氣作載氣，進(jìn)樣口溫度 250C,分流比 1:50,柱流速1.0ml/min;電子電離源(EI源)70eV,倍增器電壓350V,燈絲電流250uA,接口溫度260C,離子源溫度180C,質(zhì)荷比(m/z)掃描范圍 30450,掃描速

18、率 2.5scan/sec=(胞式層孔菌菌絲體多糖分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其生物活性研究)流程圖如下：(MAEP-2a-2b 是安絡(luò)小皮傘菌絲體多糖的某個(gè)過(guò)程中第某個(gè)樣品)NaOH-DMSO 泡懸液制備NaOHlg加 IniL水溶解1；JIIlinL脫水 DMSO（分子篩 240c13h,加 DMSO 密封過(guò)夜）V攪拌，離心，一重復(fù)此操作 10.15 次J沉淀加 1mL 脫水 DMSO,充氨氣密封攪拌過(guò)夜NaOH-DMSO 泡懸液甲基化MAEP-2b-2a 樣品 20mg真空燥 24%加脫水 DMSQQSmL,充氮?dú)鉁Y封攪拌過(guò)夜環(huán)加 0.5mLNaOH-DMSO 混懸液,充氮?dú)饷芊鈹嚢?6h加 0

19、.3inL碘甲烷，光敏氣攪拌密封 101】f攪拌下空溫吹盡剩余的碘甲烷，加 2mL 水終止反應(yīng)加 3mL 氯仿,攪拌離心,棄去水層I 氯仿層川水洗脫 2次，吹|京仿層甲基化產(chǎn)物水解還原乙?；椎诨瘶悠芳?2mol/L 三氟乙酸 lull，密封,置 121。水解 1.5小時(shí)，吹下；加 Imol/L 氨水 0，叫硼氫化鈉 20mg室溫反應(yīng) L5 小時(shí)，吹干|殘?jiān)?10%醋酸甲醇溶液 1ml,吹 r-I 加 0.5ml 叱%1ml：險(xiǎn)酊榔封|置 121c烘箱中 3小時(shí)，吹干T殘?jiān)?3血水溶解，加 1ml 就仿萃取,氯仿層吹干部分 M 基化部分乙?；菇庋苌锊糠旨谆糠忠阴；谴佳苌锏?GC

20、-MS 分析由 23 過(guò)程得到的衍生物加入 02ml 丙酮溶解，進(jìn)行 GC-MS 分析。色譜條件：色譜柱：DB 1 石英毛細(xì)管柱（30m他 32mml進(jìn)樣口溫度：2502；柱溫：120C；升溫程疔:1207?保持 5nlim5C/mm 升溫到 220C：進(jìn)樣量:02 卜 L例如：經(jīng)過(guò)甲基化反應(yīng)的 MAEP-2b-2a 通過(guò) GC-MS 分析，結(jié)合其各峰位保留時(shí)間和質(zhì)譜碎片峰，判斷樣品的結(jié)構(gòu)并計(jì)算摩爾百分比。表13MAEP-2bfl中精昔鍵連接方式GlycosylrtsidusFtagmsntConfiguremolarratioAra取一172.66Fuc?F4-Me3If一$0.31Man2

21、J,4b6-Mq求端19SSL220.S32J,4-MC3J625D63,6Me：TT2.317】T1：DGal木泓1E21.4,9-UejUTlSIIL26hi未端3.662P3/-MC37.52從表 14 中，可以看出 MAEP-2b-2a 中糖部分是以（12,1-6）連接的 Man（甘露糖）為主鏈。（12）連接的 Man（甘露糖）在其 4 位上有分枝點(diǎn),（1 一 6）連接的 Man 在其 2位上有分枝點(diǎn)。在這些分枝點(diǎn)上，連接著由 Gal 和 Glu 為主組成的側(cè)鏈。MAEP-2b-2a 的非還原末端是由 Gal,Man,Glu 組成。從甲基化結(jié)果的摩爾百分比計(jì)算，各分枝點(diǎn)摩爾百分比之和低

22、于非還原末端摩爾百分比之和，由 PMP 衍生化組成糖分析結(jié)果可知，MAEP-2b-2a尚含約 9%勺 GalA,糖醛酸在復(fù)雜多糖中可能以分枝點(diǎn)的形式存在，故推測(cè)在 MAEP-2b-2a中還有大量的 GalA 作為分枝點(diǎn)而存在。（絡(luò)小皮傘菌絲體多糖）次 21 附彩的俄力中阻比高曰 1 倒乙枝瞰在氣和層析上的和 H 荒用時(shí)間和希甘使的選情 U式型摩爾口價(jià)比tntn)Linkagenol%1,3,5,S-Ofc-2,4-0hfe-Min25.63-*-3(6-口 Micp1 一9.291,5-0A:-2,3,4,5-0 岫-岫 n2727T-D-kfenp1 一11,011r4,SHOAC-S,3-

23、OhA-Aa26.37&L 向前 1-a441p2.5-0A:-3.4-OI-A-a2S_29-2-片叩 1112BtS-Oflc-23,*6-0lfe-Qu27SOT。Gup1-4.341.4,0u2314-4,G-0Qup1-5.631,5,6-0-2,3,4-QI-Gu2942fgGup126.901,5-0A:-2,3,4,3Q*國(guó)2336T-D-CWp1-11681,5,6-OAl-2,3,4-OLb-Cil26.518-0廟 l 戶 I3.771,3.5。2246 QM02736一都口 011pL74Bk2-2百 TPS2 的二甲基但 flidill 乙些隔在飛林反折上的川

24、帶留忖間利酒仆鉞的注也方式及席爾門(mén)*比tRftinLinkagefflj%1,2,4,5-OA:-3-OMJRia2B.25-2,4-L-Fhap1一9.331,2,5-0-3.4-QI-Fnc2973-*2-L-Fiwp1一4.551,4,5-0-2,3。廿：fira.緋 51-5-L-AEifL10.761,5.&口配-23,4-ar*-Qu國(guó) 427-6-D-Gup-18.001,OAi-2,3,4,2339T-。p1-比 231,3,5-0A:-2,4,6*0MJ61563fW.。Qijp1-*1.741.5,&QAC23,4-Qr-QJ2fl.37Y-D-lp113.

25、821,4,5-0A:-2,3,6-Oh*-Oil(0,ff30L34-4-0-Q&1pA14&.10（茶源多糖結(jié)構(gòu)鑒定）5、紅外光譜分析取干燥樣品微量，壓片，全波段掃描。例如：阿魏側(cè)耳子實(shí)體多糖分離純化及其化學(xué)結(jié)構(gòu)的初步研究圖1中卜環(huán)格精對(duì)照?qǐng)D圖2紡卜葡萄糖對(duì)照凰圖中顯示在 4000cm“650cm-1區(qū)內(nèi)的是具有多糖類物質(zhì)的一般特征。3372cm1的吸收峰是 O-H 和 N-H 的伸縮振動(dòng)峰,2931cm-1為 C-H 的吸收峰，即為-CH 和-CH2 的共振吸收鋒。這兩類是糖類的特征吸收峰。848cm1吸收峰表明在 PW2（文中提純的第二種成分）多糖純品結(jié)構(gòu)中存在a型（即

26、a端基差向異構(gòu)體）,1026cm1、1081cm1和1152cm-1的吸收峰表明 PW2 中的糖環(huán)為口比喃糖環(huán)，這是由醒鍵 C-O-C 振動(dòng)而產(chǎn)生的吸收峰；而吠喃糖環(huán)在此區(qū)間上只有兩個(gè)強(qiáng)吸收峰。在 890cm1處有微弱吸收，表明樣品中含有少量3型糖昔鍵，而在 810cm1處沒(méi)有振動(dòng)吸收峰表明沒(méi)有甘露糖的存在。928cm-1為糖類分子振動(dòng)吸收峰，即 D-口比喃糖的非對(duì)稱環(huán)伸縮振動(dòng)產(chǎn)生。而 1725cm1的存在，表明多糖含有糖醛酸基團(tuán)，即 PW2為酸性多糖?；每莆?H1）官能團(tuán)結(jié)構(gòu)特征3372OHOH伸縮振動(dòng)2931CJkCH伸縮振動(dòng)1725CHO非對(duì)林伸縮報(bào)動(dòng)1647多帔的本合振動(dòng)峰CO141

27、7匚-m陵抽）13681152/1081/1026t：ncC0脂肪醮）CObiiKHe9.1471.2733713邢1加X(jué)ylose9.833143imLOOMUIDOSC11.6131S82.0013640.98GRacto9c12J鞠192LIO15.301.10Glucose12,6381.的0.09J5J3uo注LRSDReLativestandarddevgoton圖11標(biāo)準(zhǔn)穗樣中單糖的氣相色諳圖Figure3.1GasdtrouiatognmofthemQii0弱KhwridusLDsiandurdsampleLAUnuioc;2.Fucose；3Arabinose;4Mamwsc

28、;足 OajAooit；7rGlumseaa.2 樣品的氣相色譜分析結(jié)果ble3.2ResultsofcumponentHEPFlfiromGCMonosaccharideSaicpleContent*MolarratioRhamnosefl.3423.5190.278Fucose也44515,5491.000Galactose12.195曉3304.029Glucose12.6B715.B181.036注：*面積歸一法CarennomalizfitionMethod)圖 4 才山妁中性與鼬的 GC-MSI9斡如 3Th?GC-MgfnmE川燈船事,小日彳12 山西中性知箭的 CC-MS 牙析

29、T?b42Th?葡切丫到$of 山噂口同由水 pMyHicdhanMbyGC-MStilfdWf甘保一時(shí)閩min）104115.66埠瑞比0.560.44山的木諦中竹窖鼬水解的的乙?；?4.物的色譜圖見(jiàn)圖 43中融定性來(lái)川10、高效陰離子色譜法（猴頭菌體多糖）-di 中 H的-層層析一，Tab4JTheTLC 周 valuecftheneutralpulytaw 山 anrik樣板sdAfghsX172172n.i17J1727.217.117217.2ti6.654J9.37.S7217.037.2百 70 打 903B704910570419MdCM30J5色氏0我以日色陶色褐色現(xiàn)綠戰(zhàn)然

30、恥似一生43.12山藥中性多糖的GC-MS分析結(jié)果Figure3.2Gaschromatogran)of由已monosaccharidesinHEPFiTnrmlnl取 2mg 多糖樣品放入薄壁長(zhǎng)試管中，加入 2mol/L 三氟乙酸(TFA)4mL,在 110c 下水解，中性多糖樣品水解 2h,用超純水溶解定容至 100mL 容量瓶，稀釋 100 倍后上樣測(cè)定。色譜條件：分離柱采用 Dionex 公司 CarboPacPAZ。預(yù)處理、CarboPacTMPA20 檢測(cè)柱；脈沖安培檢測(cè)器工作參數(shù)：E1 為 100mv,400ms;E2 為-2000mv,20ms;E3 為 600mV,10ms;

31、E4 為-100mV,70ms。流動(dòng)相：分別采用濃度為 2.5mmol/L 的 NaOH 作淋洗液；淋洗方法采用單一濃度淋洗。流速:0.45mL/min;上樣量：25uL;溫度 30C。K3.3 標(biāo)漉轉(zhuǎn)樣中的高蚊隔離子色謂圖Figure33HR/kEC。隔93 口口媼 cch 打 1 皿 in41mdiirdSample1.FWCOM;2.RhaffinOM;3Arabinose；才曲際6.Xylose;7.M血iwse；8aFructoie圖3.4HEPF1的高效陰圈子色諼圖Figure3.4HPAECofthenwunaccharideinHEPFl11、氣質(zhì)聯(lián)用(猴頭菌體多糖)取處理的乙

32、酰化產(chǎn)物，上 GC-MS,色譜條件：氣相一質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)配備 DB-5MS 石英毛細(xì)管柱，30mX0.25mmX0.25um。程序升溫：柱初溫 80C,保持 1min,以 50C/min 至 2000C,再以 20C/min 至215C,最后以20C/min至270C氨氣作載氣， 進(jìn)樣口溫度250C,分流比1:50,柱流速為1mL/min。 EI(70eV),倍增器電壓 350v,燈絲電流 250uA,接口溫度 200C,離子源溫度 250C,質(zhì)量數(shù)掃描范圍 42-462amu,掃描速率 2.5scan 脛。根據(jù) HEPF1 的總離子流圖(圖 3.6),通過(guò)各峰的保留時(shí)間和質(zhì)譜可以確定

33、其含有巖藻糖、葡萄糖和半乳糖，但是在保留時(shí)間 22.58min 處有一未知物峰。根據(jù) 22.58min 處的質(zhì)譜圖(圖 3.7)可知，該組分在 m/z43,87,101,117,129,143,189 和 203 處有碎片離子峰。其中 m/z203 和189 是 3-0-甲基一甲基戊糖糖醇乙酸醋衍生物的一級(jí)片段，而耐 z129 和 143 是由一級(jí)片段 m/z189 和203 部分裂解產(chǎn)生乙酸根(-AcOH,-60)而產(chǎn)生的二級(jí)片段，與文獻(xiàn)完全一致。由此可以斷定此峰是 3-0-甲基一甲基戊糖的糖醇乙酸酷衍生物。由于 3-0-甲基一甲基戊糖有兩種存在形式，3-0-甲基一鼠李糖或 3-0-甲基一巖

34、藻糖，判斷具體的哪一種，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。12、苯酚硫酸法總糖含量測(cè)定(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在 105c 烘箱條件下干燥至衡重，取 20mg 于 500mL 容量瓶中定容。分別吸取0.4mL,0.6mL,0.8mL,1.0mL,1.2mL,1.4mL,1.6mL,1.8mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于試管中， 并加水補(bǔ)至 2.0mL。 加入配制好的 6%苯酚溶液 1.0mL,用移液管吸取 5.0mL 濃硫酸，彳 f 靜止 10min 后搖勻，再在室溫下放置20min,待反應(yīng)完全。于 490nm 下測(cè)吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)樣品含量測(cè)定配制 1mg/mL 的粗多糖溶液。稀釋后，測(cè)定吸光值，根

35、據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總糖含量。13、糖醛酸含量測(cè)定FriiiMrriaiH*l*圖 3,5 單播混合標(biāo)準(zhǔn)品的總圖子潦凰Figure35Total所fbrMUI&grtdi屯fctHnplcxstandardiriGibDSHjcchiandejiL混窣(-rlunuiQ5C,2320)面時(shí)2.E節(jié)滿及伍而EK,4巾wn)3,口朝及伯糖(D-皿訥皿.23J1皿琲4.小；Mf(D-jylofa,2例min)配 d 甘苜赭( (D-BJUIMSC,2BM0mu)工仄1嘴箭(D-UEHM!,理朝min)7.D-拿孔糖(D-galKlosc.2A.S2)Fi33*PartafBgtaJioqdim 面

36、 al叩皿 EromaoeUriederia.lpEDElOiFFTS3.7保留時(shí)尚為鷲.5Pin處的廈遒圖Figure3.7MjaBjcetftiniof3-O-flirthj-JmclhylptitiDsc1C岷南出西疝lime(22.5Smin)(1)試劑配制間輕基聯(lián)苯(m-hydroxydiphenyl)試劑:0.15%間輕基聯(lián)苯， 以 0.5%氫氧化鈉配制， 置于冰箱中保存，1 月內(nèi)穩(wěn)定。四硼酸鈉一硫酸試液：配制 0.0125mol/L 四硼酸鈉的濃硫酸溶液。半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取半乳糖醛酸 60mg,置于 100mL 容量瓶中，加水溶解，定容。稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液至 60ug/mL,

37、定容后備用。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作分別精確量取 0uL,5uL,100uL,150uL,200uL,250uL,300uL,350uL 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色管中，補(bǔ)加水至 0.25mL,在冰水浴中預(yù)冷，加入 1.5mL 四硼酸鈉硫酸試液。振搖混合后，在沸水浴中加熱5min。冰水浴冷卻至室溫后，加 25uL 間經(jīng)基聯(lián)苯試液。搖勻后，在 520nm 處測(cè)定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)樣品測(cè)定取 0.1mg/mL 多糖水溶液 0.1mL,加水補(bǔ)足至 1mL,余操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線，平行測(cè)定三次，根據(jù)吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得糖醛酸含量。14、分子質(zhì)量測(cè)定示差折光指數(shù)增量(dn/dc)通過(guò) OPTILAB 折光

38、儀在 633nm 和 25c 下測(cè)定，dn/dc 值為 0.14。dn/dc描述的是大分子溶液折光指數(shù)相對(duì)于溶質(zhì)濃度的變化，它的值得大小有其自身性質(zhì)決定的，受溶劑、溫度、測(cè)量波長(zhǎng)等因素的影響，也是用光散射測(cè)定聚合物分子量不可少的常數(shù)。光散射(LS)測(cè)定角度為 900,TFP1 的流出體積為 28mL。根據(jù)方程 6-1 和 6-2,通過(guò) Kc/Re。XSsin2(9/2)+Kc 作圖得到 Zimm 曲線(圖 15(b),在縱坐標(biāo)的交點(diǎn)為重均分子量 Mw 的倒數(shù)。K=4 汗。/源/de)2,(6-1)(6-2)公式中字母的意義：K 為光學(xué)常數(shù),為溶劑的折光指數(shù)，入0為入射光波長(zhǎng),c 為多糖溶液的濃

39、度(mg/mL),R0為瑞利因子，iz1/2均方根旋轉(zhuǎn)半徑，NA為 Avogadro 常數(shù)，I和 Ie分別為入射光強(qiáng)和散射光強(qiáng)，代表光源到測(cè)量點(diǎn)得距離。圖圖15TFP1光散射信弓和示卡折光信號(hào)及光散射信弓和示卡折光信號(hào)及Zimm國(guó)國(guó)I條件均為條件均為90*25七七, ,0.1mol/L的的NaCl溶液溶液) )Fig.l工工(3)IightingScaEteringChrotiialdgramandChTuirwtogniiiiDeteelvdbyRIDetecior(b!StaticJightingScatteringDataIllustratedinXimmPlotforTFP1(Data

40、Aqwiredat000in0.1mol/LNaCISolutional25V)根據(jù) Zimm 圖計(jì)算得到 TFPl 在 NaCl 溶液中各個(gè)參數(shù)見(jiàn)表 1,TFPl 的重均分子量(Mw)大小為5.832xl06Da;Z 均方根旋轉(zhuǎn)半徑(z1/2)是用來(lái)描述大分子的尺寸，它的大小可以用來(lái)判斷聚合物的伸展范圍和剛性，該值比較大時(shí)說(shuō)明多糖是伸展的剛性鏈，值比較小則代表緊密纏繞的線團(tuán)，TFP1的z1/2為191.3nm說(shuō)明TFP1是伸展的剛性鏈；多分散系數(shù)(Mw/Mn)為1.005，說(shuō)明 TFP1 分子量分布均勾。所以用本研究中的提取純化方法得到的銀耳多糖 TFP1是分子量較大的均一多糖，糖鏈?zhǔn)巧煺沟?/p>

41、剛性鏈。表 1TFP1 分子翼和均方根旋轉(zhuǎn)半徑liibleI.MakrMassantiAverageMeanSquareRadiusforTFPlMwxIO6Mnx|()b2Mw/Mn(Da)(Da)(nm)TFPl5,832士0.15.8O5O.t191,309L00514、碘-碘化鉀反應(yīng)銀耳多糖 TFP1 溶液與碘試劑(含 0.02%12 的 0.2%KI 溶液)混勻， 測(cè)定 300-700nm 范圍內(nèi)的吸收光譜， 若在565nm處有最大吸收則說(shuō)明多糖有較少的分支和較短的側(cè)鏈161。 如圖16所示,TFP1與I2-KI的反應(yīng)物最大吸收峰在 351nm,而 565nm 處并沒(méi)有最大吸收， 說(shuō)

42、明 TFP1 可能存在較長(zhǎng)的側(cè)鏈和較多的分支。另外,TFP1 與 I2-KI 反應(yīng)呈陰性，說(shuō)明不含淀粉。40id3押心弱。躺&ThWiffirml0*0204t15、剛果紅實(shí)驗(yàn)剛果紅是一種酸性染料，分子式 C32H22N6Na2O6S2,分子量 696.66，能溶于水和乙醇，可與具有三股螺旋構(gòu)象的多糖形成絡(luò)合物，絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)同剛果紅相比發(fā)生相對(duì)位移，在一定的 NaOH 濃度范圍內(nèi)，表現(xiàn)為最大吸收波長(zhǎng)特征性變化(變成紫紅色)，當(dāng) NaOH 濃度大于 0.3mol/L后最大吸收波長(zhǎng)急劇下降。若隨著 NaOH 的濃度升高，多糖最大吸收波長(zhǎng)相應(yīng)減小，但相對(duì)于剛果紅本身最大吸收波長(zhǎng)減少明

43、顯緩慢，則說(shuō)明多糖未表現(xiàn)出三股螺旋結(jié)構(gòu)。如圖 17,隨著 NaOH 的濃度升高，剛果紅與銀耳多糖形成的絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)相應(yīng)減小，但相對(duì)于剛果紅本身最大吸收波長(zhǎng)減小的緩慢，說(shuō)明銀耳多糖 TFP1 可能不具有三螺旋結(jié)構(gòu)。圖17TFPI與剛果紅反應(yīng)曲鰻曲Fig.CurvefarTFPIReactedwithCongo16、粘度檢測(cè)高分子的粘度是流體力學(xué)性質(zhì)的內(nèi)容，反映高分子之間的摩擦力，特性粘度值反映的是單個(gè)高分子在特定濃度下對(duì)溶液粘度的貢獻(xiàn)，其值的大小并不隨濃度改變而改變，多糖溶液特性粘度(?)與分子量大小有關(guān)。一剛果紅.T-剛果紅 11 丁叫誠(chéng)長(zhǎng)，nE圖16銀耳彩電TFPI。1”KI反腐物城

44、外-可見(jiàn)光潘圖Fig.16.TheScanningSpectraofTfl11Reactedwithl-KJtidingUhraviolet-VisibleLi皆hlSpEctnsphotcimelET4州QD10.203Q40.50.6NaOH浪煙4 42 2。86428642。4444444 44 44-444-44C向J國(guó)相TF用特性料度Fix-1-InIrinsitViscosityofTFPlHuggins方程：/JC=p?十K訂淄CKraemer方程:(lru/r)/C=川Kh 和 Kk 分別為高分子在特定條件下某溶劑中的常數(shù)；?,特性粘度；？sp增比粘度；？r相對(duì)粘度;C,高分子

45、溶液濃度。由Huggins方程(y=1146547.14x+1508.83)和Kraemer方程(y=-189179x+1507.8)計(jì)算的 TFPl的特性粘度?=1508.3mL/g(如圖 18)。表 2 中是一些生物多糖在 25C 并以 0.1mol/LNaCl 作為溶劑的條件下測(cè)定的特性粘度，銀耳多糖與其它一些樣品相比占有相對(duì)較大的流體力學(xué)體積，一定條件下特性粘度與分子量大小成正比，進(jìn)一步說(shuō)明 TFP1 具有較大的分子質(zhì)量與激光光散射測(cè)得的大的重均分子量吻合。?值比較大時(shí)說(shuō)明多糖是伸展的剛性鏈，?值比較小則表示大分子是緊密纏繞的線團(tuán)。所以銀耳多糖 TFP1 在 250.01C 的 0.1

46、mol/LNaCl溶液中具有較高的剛性，分子鏈較為伸展。銀耳多糖由于其高粘度大大影響其在工業(yè)生產(chǎn)方面的利用，而反過(guò)來(lái)如果能好好利用它的這個(gè)特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)它作為化妝品和食品的增稠劑，不僅可以達(dá)到使產(chǎn)品增加粘度的效果，同時(shí)由于其本身就是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的成分而能起到保健的作用。睡2兒種蕓骷的特慨秸也對(duì)比f(wàn)fl.Lmfll/LNaC,2S口Inbe2.IttirtrisicVisjcosiiyofSeveralPilTID.Iinokl.Na|253MwfirnoJ)ReferenceTeaFlowerFolj-sacchairide-Tragaeaiith-15*(Asiragakts0.767.0,20715LII。，HanQ,elal.(201/3S44”1960.181.610sMohamniaditarMA,etalKX產(chǎn)Chitosans-1.2*840,1003LI2IO6,1.26x1SigniniRnelaL(1099),71CyGtheamedidlarixpialysa-cdhajideS4S3