整理)慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株步驟

1、穩(wěn)轉(zhuǎn)慢病毒一、所需試劑1、慢病毒載體（具體信息見附錄及質(zhì)粒的擴(kuò)增提取）（大腸桿菌-80保存2-3年，質(zhì)粒-20保存2-3年，病毒液-80保存1年）（1）載體質(zhì)粒：兩端的LTR、剪切位點、包裝信號以及抗性或熒光基因、gag基因5端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶識別部分（2）包裝質(zhì)粒（psPAX2）：包含了pol、gag包裝成分（3）包膜質(zhì)粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染產(chǎn)生不具有自我復(fù)制力量的病毒載體。2、包裝細(xì)胞：293T細(xì)胞3、菌株：大腸桿菌，用于提取質(zhì)粒4、轉(zhuǎn)染試劑：XTREME-GENE（-20保存，不行分裝），一

2、種脂質(zhì)與其他組份構(gòu)成的混合物5、濃縮試劑（配好后4保存，原材料室溫保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q純水中，高壓蒸汽滅菌*也可直接從公司買來病毒液（-80封口膜封口凍存管保存，4保存3天）：滴度一般為108TU/ml6、10mg/ml polybrene（-20分裝保存）：溴化己二甲銨。是帶正電的小分子，與細(xì)胞表面的陰離子結(jié)合，提高慢病毒對細(xì)胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率210 倍。有肯定細(xì)胞毒性，需要摸索濃度（110g/ml）7、無血清培育基：optimen8、貼

3、壁細(xì)胞（復(fù)蘇后3代以上的細(xì)胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞二、具體步驟<一>病毒包裝與收集（中皿，轉(zhuǎn)染步驟類似于瞬轉(zhuǎn)）第一天1、種板，10×105個293T細(xì)胞，加入全培育基雙抗DMEM 4-5ml，過夜2、配制5X PEG8000/NaCl溶液稱取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q純水中；121攝氏度 30min 濕熱滅亡 30min；保存在4其次天1、配管試劑加樣量/l推舉量/l、g合計A管PLKO.1/pCDH3206psPAX21pMD2.G2Opti200B管XTREME-GENE6206Op

4、ti200A+B混合室溫靜置20min2、加入2ml全培育基DMEM3、將1加入2，孵育10h，換成5ml全培育基第四天第五天：1、9:00和17:00各收取一次5ml培育液，共20ml（-80保存）2、過濾：用孔徑為0.45mm的過濾器除去上清中的293T細(xì)胞3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下?lián)u勻一次4、4過夜第六天1、4，3500rpm，20min2、棄上清，倒扣紙上靜置1-2min，吸干殘余液體3、加入120-150l PBS，緩慢吹打，以防形成氣溶膠4、50l分裝，-80保存。<二>慢病毒轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞前期預(yù)試驗MOI（步驟同正式試驗）（見

5、三2,直接訂購病毒液時才需要）細(xì)胞種類DU145PC322RV1LNCaPRWPE-1MOI2422前期測病毒滴度（稀釋法，還有一種qPCR法見資料）1、第一天：預(yù)備96孔板，每孔加入10000個293T，為每個病毒預(yù)備20個孔（稀釋10個濃度，各2個副孔）。放入37，5%CO2培育箱中培育。2、其次天：在EP管中做10倍梯度稀釋，連續(xù)10個稀釋度。稀釋方法如下：每種病毒預(yù)備10個1.5ml EP管，每管加入207µl培育液，往第一個管中加入23µl病毒原液，混勻后，吸取23µl加入其次個管混勻。依此類推，做十個稀釋度（1010-8）。吸取96孔板中原有的培育基，

6、加入含稀釋好的病毒液。并做好標(biāo)記。3、第三天：換液4、第四天：觀看結(jié)果并計算滴度在熒光顯微鏡下觀看結(jié)果，并數(shù)出最終兩個有熒光的熒光細(xì)胞克隆數(shù)。假設(shè)為X和Y，則滴度（TU/ml）=（X+Y×10）/2/X孔的病毒液的含量（µl ）×1000。（前面算出的是沒l病毒量，所以乘于1000）第一天：1、種板（12/24孔板）需其次天為50%-70%，大約12孔板1×105細(xì)胞種類種板數(shù)收獲細(xì)胞數(shù)DU145PC322RV1LNCaPRWPE-1其次天1、預(yù)備病毒液（可在第一天做）：在冰上融解2、預(yù)備完全培育基和 Polybrene 混合物（1:1000-1:200

7、0稀釋，終濃度在5-10g/ml之間），加入相應(yīng)培育板中（6孔板2ml，12孔板1ml，24孔板500l）3、加入濃縮病毒液（12孔板30l-50l）（假如是直接購買病毒液需依據(jù)MOI確定病毒液量加入病毒液，自己包的病毒可以）4、培育過夜，對polybrene毒性敏感的細(xì)胞在4-6小時候換液第三天1、對細(xì)胞進(jìn)行換液第五天1、用藥物進(jìn)行穩(wěn)定株的篩選（具體篩選藥物依據(jù)載體內(nèi)的基因定，用氨芐青霉素0.5g/ml-10g/ml）2、需設(shè)置空白對比（未處理細(xì)胞加入相同濃度氨芐青霉素，黨對比全部死光為篩選周期）第六天之后（依據(jù)篩選周期）1、換液傳代2、觀看GFP報告基因確定轉(zhuǎn)染效率，或用qRT-PCR確定

8、轉(zhuǎn)染效率三、留意事項及學(xué)問點1、名詞解釋（1）病毒感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection MOI）：含義是感染時病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值，即為每個細(xì)胞被多少個有活力病毒所感染2、慢病毒摸索時加入梯度（具體見自己的說明書）3、慢病毒的儲存與稀釋:可以將病毒臨時放置于4 保存；如需長期保存請放置于-80（病毒置于凍存管，并使用封口膜封口） A病毒可以存放于-80 6個月以上；但假如病毒儲存時間超過6個月，我們建議在使用前需要重新滴定病毒滴度 B反復(fù)凍融會降低病毒滴度：每次凍融會降低病毒滴度10%；因此在病毒使用過程中依據(jù)每次的使用量進(jìn)行分裝。4、慢病毒載體示意圖1載體質(zhì)粒（PLK

9、O.1 抑制載體，PCDH-GFP+puro過表達(dá)載體）：（1）5LTR：long terminal repeat即長末端重復(fù)序列，不編碼蛋白質(zhì)，但含有啟動子，增加子等調(diào)控元件（2）包組信號：LTR-通過包裝細(xì)胞的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄為RNA，通過信號起始包裝（3）啟動子、酶切位點和抗性基因（amp氨芐青霉素puro嘌呤霉素）（4）stuffer：目的基因插入位點（慢病毒載體可插入5kbp左右）（5）GFP：green fluorescent protein綠色熒光蛋白（6）WPRE：Woodchuck Hepatitis Virus (WHP) Posttranscriptional Regulatory Element 肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。轉(zhuǎn)錄后可形成三級結(jié)構(gòu)，促進(jìn)基因的表達(dá)（7）cPPT/CTS: 逆轉(zhuǎn)錄病毒順式作用區(qū)域,其中該cPPT和CTS區(qū)域誘導(dǎo)三鏈結(jié)構(gòu)（更新于2018.11）2包裝質(zhì)粒（1