醫(yī)科大學(xué)臨床微生物檢驗(yàn)43集3571教案vsw

1、四、微生物檢驗(yàn)四、微生物檢驗(yàn) HSV HSV感染已有療效顯著的抗病毒治療方法。感染已有療效顯著的抗病毒治療方法。臨床上迫切需要快速準(zhǔn)確的診斷方法。臨床上迫切需要快速準(zhǔn)確的診斷方法。 (一一)標(biāo)本采集標(biāo)本采集 一般采集病損皮膚粘膜的拭子。新鮮水一般采集病損皮膚粘膜的拭子。新鮮水 皰液含有高濃度的病毒，可用棉簽吸取殘皰液含有高濃度的病毒，可用棉簽吸取殘 存的水皰液后，用力擦拭病損部位的基底存的水皰液后，用力擦拭病損部位的基底 部，以采集感染的上皮細(xì)胞。部，以采集感染的上皮細(xì)胞。HSVHSV能在病毒能在病毒 運(yùn)送液中存活運(yùn)送液中存活2 23 3天。不得在天。不得在-20-20凍存。凍存。 （二）標(biāo)本

2、直接檢查（二）標(biāo)本直接檢查 1. 1.直接顯微鏡檢直接顯微鏡檢 查用熒光素標(biāo)記查用熒光素標(biāo)記 或酶標(biāo)記單克隆抗體檢測(cè)或酶標(biāo)記單克隆抗體檢測(cè)HSVHSV抗原?？乖?2.2.核酸檢測(cè)核酸檢測(cè) 也可采用也可采用DNADNA雜交或者雜交或者 PCRPCR法直接檢測(cè)標(biāo)本中的法直接檢測(cè)標(biāo)本中的HSVDNAHSVDNA， 敏感性、特異性高。敏感性、特異性高。（三）病毒分離和鑒定（三）病毒分離和鑒定是最為敏感的方法，并且可對(duì)是最為敏感的方法，并且可對(duì)HSVHSV分離株分離株進(jìn)行分型，能在許多培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生進(jìn)行分型，能在許多培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生CPECPE。常用原代人胚細(xì)胞和人二倍體細(xì)胞分離常用原代人胚細(xì)胞和人二倍體細(xì)

3、胞分離HSVHSV。CPECPE的特點(diǎn)是，感染細(xì)胞腫大、變的特點(diǎn)是，感染細(xì)胞腫大、變圓，折光性強(qiáng)，有細(xì)胞融合，形成多核圓，折光性強(qiáng)，有細(xì)胞融合，形成多核巨細(xì)胞，巨細(xì)胞， CPECPE出現(xiàn)快而明顯?？稍诮臃N出現(xiàn)快而明顯。可在接種后后181824h24h出現(xiàn)出現(xiàn)CPECPE，病毒含量如在細(xì)胞，病毒含量如在細(xì)胞培養(yǎng)液中加地塞米松，可加快培養(yǎng)液中加地塞米松，可加快CPECPE的出的出現(xiàn)，增加現(xiàn)，增加CPECPE病灶的數(shù)量。病灶的數(shù)量。 通常采用特異性的通常采用特異性的MoAbMoAb進(jìn)行組化染色，進(jìn)行組化染色，可進(jìn)行鑒定和分型。也可用型特異性可進(jìn)行鑒定和分型。也可用型特異性DNADNA探針進(jìn)行的鑒定和

4、分型。探針進(jìn)行的鑒定和分型。( (四四) )抗體檢測(cè)抗體檢測(cè)雙份血清雙份血清HSVHSV抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)，可診斷抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)，可診斷為原發(fā)感染，但無(wú)法區(qū)分為原發(fā)感染，但無(wú)法區(qū)分HSVHSV型別。型別?？箍笻SVIgMHSVIgM抗體的檢測(cè)無(wú)法用于區(qū)抗體的檢測(cè)無(wú)法用于區(qū)分原發(fā)感染和復(fù)發(fā)感染。復(fù)發(fā)感分原發(fā)感染和復(fù)發(fā)感染。復(fù)發(fā)感染時(shí)抗染時(shí)抗HSVIgMHSVIgM抗體也升高，單份抗體也升高，單份血清檢出血清檢出HSVIgGHSVIgG抗體表明個(gè)體曾抗體表明個(gè)體曾感染過(guò)感染過(guò)HSVHSV。常用的檢測(cè)方法是常用的檢測(cè)方法是ELISAELISA。微生物檢驗(yàn)微生物檢驗(yàn)臨床標(biāo)本主要有皰疹病損部位的臨床標(biāo)本主要有皰疹病損部

5、位的涂片、皮膚刮取物、水皰液、活涂片、皮膚刮取物、水皰液、活檢組織和血清。主要通過(guò)病毒分檢組織和血清。主要通過(guò)病毒分離、免疫熒光和原位雜交或者離、免疫熒光和原位雜交或者PCRPCR等檢測(cè)技術(shù)，在患者的組織或者等檢測(cè)技術(shù)，在患者的組織或者體液中證實(shí)體液中證實(shí)VZVVZV或者其成分的存在?；蛘咂涑煞值拇嬖?。 微生物檢驗(yàn)微生物檢驗(yàn) 病原學(xué)診斷方法包括直接檢查、病原學(xué)診斷方法包括直接檢查、 病毒分離和鑒定以及血清學(xué)診斷。病毒分離和鑒定以及血清學(xué)診斷。 （一）直接檢查（一）直接檢查 包括檢測(cè)病毒顆粒、病毒包涵體包括檢測(cè)病毒顆粒、病毒包涵體 或者抗原或者核酸。或者抗原或者核酸。 1 1檢測(cè)病毒顆粒檢測(cè)病毒

6、顆粒 可采用假?gòu)?fù)制方法可采用假?gòu)?fù)制方法 對(duì)對(duì)HCMVHCMV先天性感染患兒的尿液和先天性感染患兒的尿液和 口腔標(biāo)本進(jìn)行電鏡檢查，敏感性口腔標(biāo)本進(jìn)行電鏡檢查，敏感性 為噬斑形成單位為噬斑形成單位/ml/ml，優(yōu)點(diǎn)是快速，優(yōu)點(diǎn)是快速 缺點(diǎn)是不敏感。缺點(diǎn)是不敏感。2 2檢測(cè)病毒包涵體檢測(cè)病毒包涵體 活檢組織標(biāo)活檢組織標(biāo) 本切片或者脫落細(xì)胞涂片，以本切片或者脫落細(xì)胞涂片，以 HEHE等常規(guī)染色，觀察巨細(xì)胞以等常規(guī)染色，觀察巨細(xì)胞以 及細(xì)胞核內(nèi)嗜堿性包涵體。可及細(xì)胞核內(nèi)嗜堿性包涵體?？?用于快速診斷，但敏感性較低。用于快速診斷，但敏感性較低。3 3檢測(cè)病毒抗原檢測(cè)病毒抗原 活檢組織標(biāo)本活檢組織標(biāo)本 切片

7、、脫落細(xì)胞或者周?chē)浊衅?、脫落?xì)胞或者周?chē)?細(xì)胞涂片、接種標(biāo)本并培養(yǎng)數(shù)細(xì)胞涂片、接種標(biāo)本并培養(yǎng)數(shù) 日的蓋玻片細(xì)胞培養(yǎng)物。進(jìn)行日的蓋玻片細(xì)胞培養(yǎng)物。進(jìn)行 免疫熒光染色，檢測(cè)特異性抗免疫熒光染色，檢測(cè)特異性抗 原。該法敏感特異快速，可用原。該法敏感特異快速，可用 于快速診斷。于快速診斷。4 4檢測(cè)病毒核酸檢測(cè)病毒核酸 用用PCRPCR法檢測(cè)法檢測(cè) 核酸。敏感性高，能檢出活核酸。敏感性高，能檢出活 動(dòng)性感染和潛伏感染。動(dòng)性感染和潛伏感染。( (二二) )病毒分離和鑒定病毒分離和鑒定是診斷最可靠的金標(biāo)準(zhǔn)。將標(biāo)本接種人胚是診斷最可靠的金標(biāo)準(zhǔn)。將標(biāo)本接種人胚成纖維細(xì)胞，觀察成纖維細(xì)胞，觀察4 46

8、6周，期間盲傳周，期間盲傳2 2次。次。產(chǎn)生特征性的產(chǎn)生特征性的CPECPE，細(xì)胞腫脹變圓，形成巨，細(xì)胞腫脹變圓，形成巨大細(xì)胞，可作出初步診斷。經(jīng)過(guò)大細(xì)胞，可作出初步診斷。經(jīng)過(guò)MoAbMoAb免疫免疫染色作出最終鑒定。改良快速診斷法是培染色作出最終鑒定。改良快速診斷法是培養(yǎng)養(yǎng)24h24h后用熒光素標(biāo)記的后用熒光素標(biāo)記的MoAbMoAb直接檢測(cè)表達(dá)直接檢測(cè)表達(dá)的早期抗原，在接種后的早期抗原，在接種后24h24h即可檢出。即可檢出。 ( (三三) )抗體檢測(cè)抗體檢測(cè) 常用常用ELISAELISA檢測(cè)特異性檢測(cè)特異性IgGIgG和和IgMIgM抗體?？贵w。( (四四) )結(jié)果分析結(jié)果分析1 1先天性

9、感染的診斷先天性感染的診斷 在出生最初在出生最初 3 3周內(nèi)從新生兒尿液、呼吸道分泌周內(nèi)從新生兒尿液、呼吸道分泌 物或者其他體液分離出物或者其他體液分離出HCMVHCMV是最是最 敏感和特異的確診依據(jù)。敏感和特異的確診依據(jù)。2 2血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果的分析血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果的分析 6 6個(gè)月個(gè)月 以上的患兒，母體抗體已經(jīng)消失，以上的患兒，母體抗體已經(jīng)消失， 如果出現(xiàn)雙份血清抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)，可如果出現(xiàn)雙份血清抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)，可 作出原發(fā)感染的診斷，可診斷為作出原發(fā)感染的診斷，可診斷為 近期感染。近期感染。 3 3免疫功能缺損個(gè)體免疫功能缺損個(gè)體HCMVHCMV感染檢感染檢 測(cè)結(jié)果的分析測(cè)結(jié)果的分析 檢出檢出HCMVH

10、CMV提示提示 存在活動(dòng)性感染，但不能確定存在活動(dòng)性感染，但不能確定 HCMVHCMV感染與疾病的相關(guān)性。感染與疾病的相關(guān)性。（五）評(píng)價(jià)（五）評(píng)價(jià)HCMVHCMV檢測(cè)結(jié)果分析必須結(jié)合患者的臨檢測(cè)結(jié)果分析必須結(jié)合患者的臨床評(píng)價(jià)，才能對(duì)床評(píng)價(jià)，才能對(duì)HCMVHCMV感染和疾病提供感染和疾病提供準(zhǔn)確的診斷，及時(shí)進(jìn)行對(duì)應(yīng)的抗病毒準(zhǔn)確的診斷，及時(shí)進(jìn)行對(duì)應(yīng)的抗病毒治療。治療?？乖诸?lèi)抗原分類(lèi)潛伏期抗原，為潛伏感染細(xì)胞所潛伏期抗原，為潛伏感染細(xì)胞所 合成，包括合成，包括EBVEBV核抗原核抗原(EBNA)(EBNA)和潛和潛 伏期膜蛋白伏期膜蛋白(LMP)(LMP)。這類(lèi)抗原的表。這類(lèi)抗原的表 達(dá)表明存在達(dá)

11、表明存在EBVEBV基因組?；蚪M。早期抗原早期抗原(EA)(EA)，屬于病毒非結(jié)構(gòu)蛋，屬于病毒非結(jié)構(gòu)蛋 白，其合成不依賴(lài)于病毒白，其合成不依賴(lài)于病毒DNADNA的復(fù)制。的復(fù)制。 EAEA的表達(dá)顯示開(kāi)始病毒復(fù)制，是增的表達(dá)顯示開(kāi)始病毒復(fù)制，是增 殖標(biāo)志。殖標(biāo)志。晚期抗原晚期抗原(LA)(LA)，包括衣殼抗原，包括衣殼抗原(VCA)(VCA) 和包膜抗原和包膜抗原(MA)(MA)。微生物檢驗(yàn)微生物檢驗(yàn) 病原學(xué)診斷方法包括直接檢測(cè)病病原學(xué)診斷方法包括直接檢測(cè)病 毒抗原或者核酸、病毒分離和鑒毒抗原或者核酸、病毒分離和鑒 定以及抗體檢測(cè)。定以及抗體檢測(cè)。 ( (一一) )直接檢查直接檢查 在病變組織中

12、檢測(cè)在病變組織中檢測(cè)EBVEBV抗原或者抗原或者 核酸是核酸是EBVEBV感染診斷的重要方法。感染診斷的重要方法。 大部分病變組織中存在大部分病變組織中存在EBVEBV的核蛋的核蛋 白和膜蛋白等病毒產(chǎn)物以及白和膜蛋白等病毒產(chǎn)物以及EBVEBV基基 因組核酸。用核酸雜交和因組核酸。用核酸雜交和PCRPCR或者或者 RT-PCRRT-PCR可檢出基因組核酸及其轉(zhuǎn)錄可檢出基因組核酸及其轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)物。產(chǎn)物。（二）病毒分離和鑒定（二）病毒分離和鑒定分離分離EBVEBV的標(biāo)本可以是唾液、咽漱液的標(biāo)本可以是唾液、咽漱液及血細(xì)胞等，咽漱液中分離率最高，及血細(xì)胞等，咽漱液中分離率最高，可達(dá)可達(dá)8080以上。將咽漱

13、液接種人臍以上。將咽漱液接種人臍帶血淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)帶血淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)4 4周，如果出現(xiàn)周，如果出現(xiàn)大量的轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞，則提示病毒大量的轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞，則提示病毒培養(yǎng)陽(yáng)性，鑒定通過(guò)免疫熒光技術(shù)培養(yǎng)陽(yáng)性，鑒定通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)檢測(cè)EBVEBV核抗原。核抗原。 ( (三三) )抗體檢測(cè)抗體檢測(cè)是最常用的診斷方法。由于不同病人是最常用的診斷方法。由于不同病人體內(nèi)針對(duì)體內(nèi)針對(duì)EBVEBV不同的抗原成分所產(chǎn)生的不同的抗原成分所產(chǎn)生的抗體的組成及水平均有一定的特征性，抗體的組成及水平均有一定的特征性，為疾病診斷提供了參考指標(biāo)。為疾病診斷提供了參考指標(biāo)。 （四）結(jié)果分析與評(píng)價(jià)（四）結(jié)果分析與評(píng)價(jià)根據(jù)抗體模式和

14、滴度，可歸為根據(jù)抗體模式和滴度，可歸為3 3大類(lèi)：大類(lèi)：易感：抗易感：抗VCAVCA抗體陰性；抗體陰性；原發(fā)感染：抗原發(fā)感染：抗VCAVCA抗體陽(yáng)性，抗體陽(yáng)性，EBNAEBNA 抗體陰性；抗體陰性；既往感染且具有免疫力：抗既往感染且具有免疫力：抗VCAVCA抗抗 體和抗體和抗EBNAEBNA抗體均陽(yáng)性?？贵w均陽(yáng)性。8080的的 EBVEBV活動(dòng)性感染的患者產(chǎn)生抗活動(dòng)性感染的患者產(chǎn)生抗EAEA D D抗體。抗體。 第五節(jié)人皰疹病毒第五節(jié)人皰疹病毒6 6、7 7、8 8型型 一、人皰疹病毒一、人皰疹病毒6 6型型 感染在人群中十分普遍。少數(shù)發(fā)生感染在人群中十分普遍。少數(shù)發(fā)生 幼兒急疹或嬰兒玫瑰疹。

15、在器官移幼兒急疹或嬰兒玫瑰疹。在器官移 植等患者，可發(fā)生重癥感染，如腦植等患者，可發(fā)生重癥感染，如腦 炎和肺炎等。炎和肺炎等。 為皰疹病毒科中的一個(gè)獨(dú)特成員。為皰疹病毒科中的一個(gè)獨(dú)特成員。 基因組基因組DNADNA為為160160170kb170kb，G+C molG+C mol 為為43434444。在。在CD4CD4+ +T T細(xì)胞中增殖細(xì)胞中增殖 良好。良好。 微生物學(xué)檢驗(yàn)微生物學(xué)檢驗(yàn)包括病毒分離和鑒定、病毒核酸檢測(cè)包括病毒分離和鑒定、病毒核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)。和抗體檢測(cè)。采集患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，與經(jīng)過(guò)采集患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，與經(jīng)過(guò)PHAPHA刺激的臍帶血淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)。刺激的臍帶血

16、淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)。出現(xiàn)腫大的氣球樣細(xì)胞提示存在病毒，出現(xiàn)腫大的氣球樣細(xì)胞提示存在病毒，可用免疫熒光法鑒定。可用免疫熒光法鑒定。是是HHV-6HHV-6活動(dòng)性感染的強(qiáng)有力的診斷活動(dòng)性感染的強(qiáng)有力的診斷依據(jù)。依據(jù)。采用核酸雜交技術(shù)檢出采用核酸雜交技術(shù)檢出HHV-6HHV-6核酸。核酸。用血清學(xué)方法檢出患者血清中的特用血清學(xué)方法檢出患者血清中的特異性異性IgMIgM和和IgGIgG抗體。抗體。從患者外周血中檢出病毒或者病毒從患者外周血中檢出病毒或者病毒DNADNA是是HHV-6HHV-6活動(dòng)性感染的強(qiáng)有力的活動(dòng)性感染的強(qiáng)有力的診斷依據(jù)。診斷依據(jù)。二、人皰疹病毒二、人皰疹病毒7 7型型從慢性疲勞綜合征患者的外周血單個(gè)從慢性疲勞綜合征患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞、幼兒急疹患者、腎移植患者核細(xì)胞、幼兒急疹患者、腎移植患者以及各種免疫抑制治療病人中分離出以及各種免疫抑制治療病人中分離出HHV-7HHV-7。在健康人的唾液中大量存在。在健康人的唾液中大量存在HHV-7HHV-7。目前認(rèn)為。目前認(rèn)為HHV-7HHV-7是一種普遍存是一種普遍存在的人類(lèi)皰疹病毒，但除了幼兒急疹在的人類(lèi)皰疹病毒，但除了幼兒急疹外，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其他任何疾病和外，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其他任何疾病和HHV-7HHV-7存在著必然的聯(lián)系。存在著必然的聯(lián)系。 三、人皰疹病毒三、人皰疹病毒8 8型型是從伴發(fā)卡波濟(jì)肉瘤