深部真菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

1、第十篇 商品試劑和設(shè)備第三章 深部真菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷第一節(jié)：1-3-D-葡聚糖測(cè)定1、1-3-D-葡聚糖測(cè)定（G試驗(yàn)）濁度法及顯色法檢測(cè)原理分別是什么？答：濁度法檢測(cè)原理:1,3-D-葡聚糖能特異性激活鱟試劑中的G因子，活化的G因子使凝固酶原轉(zhuǎn)變成凝固酶，凝固酶作用在凝固蛋白原上，通過(guò)酶切的作用，產(chǎn)生凝固蛋白，發(fā)生凝固反應(yīng)，從而引起檢測(cè)溶液透光率變化，根據(jù)檢測(cè)被測(cè)溶液透光率變化對(duì)真菌1,3-D-葡聚糖濃度進(jìn)行定量。 顯色法檢測(cè)原理：1,3-D-葡聚糖能特異性激活鱟試劑中的G因子，活化的G因子使凝固酶原轉(zhuǎn)變成凝固酶，凝固酶作用在顯色底物上，通過(guò)酶切的作用，將寡肽和顯色基團(tuán)（PNA）分離，顯色基

2、團(tuán)的量和1,3-D-葡聚糖的量呈正比，根據(jù)檢測(cè)其溶液吸光度變化對(duì)真菌1,3-D-葡聚糖濃度進(jìn)行定量。2、G試驗(yàn)顯色法檢測(cè)較濁度法有哪些優(yōu)勢(shì)？答：（1）有效的排除干擾，特異性明顯提高；（2）顯色基質(zhì)使其靈敏度大為提高；（3）適用于血清標(biāo)本的檢測(cè)。3、為什么同一份標(biāo)本在不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果不一致？答：這與檢測(cè)系統(tǒng)有關(guān)。目前G試驗(yàn)沒(méi)有行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，只有企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。而不同廠家設(shè)計(jì)生產(chǎn)的檢測(cè)系統(tǒng)（包括試劑和儀器）的性能不同，這里涉及到使用的標(biāo)準(zhǔn)品、試劑來(lái)源等 ，故檢測(cè)結(jié)果不具有可比性。4、G試驗(yàn)結(jié)果提示病人有真菌感染，而真菌培養(yǎng)結(jié)果為陰性，如何解釋？答：這主要與培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法檢測(cè)的原理不同和對(duì)疾病診斷的窗口期

3、不同有關(guān)。真菌進(jìn)入人體后，會(huì)在較短的時(shí)間內(nèi)釋放出1,3-D-葡聚糖，因此，在感染早期就可能呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。而培養(yǎng)則需要細(xì)菌在體內(nèi)有一定的增殖過(guò)程，因此在感染的高峰期培養(yǎng)陽(yáng)性率高。有文獻(xiàn)報(bào)告血漿1,3-D-葡聚糖在侵襲性真菌感染癥狀出現(xiàn)前5天就可呈檢出。 方法學(xué)上講，內(nèi)毒素和1,3-D-葡聚糖檢查多采用鱟試驗(yàn)方法，具有簡(jiǎn)便、快速、定量的特點(diǎn)，而培養(yǎng)則需要時(shí)間，細(xì)菌和真菌的體外生長(zhǎng)需要一定的條件，如果條件（例如培養(yǎng)基、溫度、時(shí)間等） 如掌握不好，則難于培養(yǎng)成功。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)告，對(duì)侵襲性真菌感染的診斷，血漿1,3-D-葡聚糖的診斷特異度和敏感度均高于培養(yǎng)，其ROC曲線下面積（AUC）也大于培養(yǎng)方法。5、

4、血培養(yǎng)陽(yáng)性，G實(shí)驗(yàn)為什么是陰性？答: （1）病人存在吞噬細(xì)胞功能缺陷，如粒細(xì)胞缺乏癥等，真菌進(jìn)入血液但是沒(méi)有被吞噬細(xì)胞處理，1,3-D-葡聚糖沒(méi)有釋放出來(lái)，或釋放的很少，故G試驗(yàn)陰性。（2）進(jìn)入血液內(nèi)的真菌數(shù)量很少，1,3-D-葡聚糖釋放的很少，沒(méi)有達(dá)到G試驗(yàn)檢測(cè)最低限。（3）使用了抑制1,3-D-葡聚糖釋放的抗真菌藥物，如棘白菌素類等。6、病人甲的臨床表現(xiàn)比病人乙的輕，可病人甲的檢測(cè)值比病人乙的檢測(cè)值高？答：這里有幾方面的問(wèn)題。第一，病人免疫功能有差異。真菌進(jìn)入人體后，需要在吞噬細(xì)胞作用下，才能將細(xì)胞壁上的1,3-D-葡聚糖釋放到血液或其他體液中，被檢測(cè)出來(lái)。如果病人吞噬細(xì)胞功能減低，真菌不

5、能被吞噬破壞，細(xì)胞壁上的1,3-D-葡聚糖不能釋放出來(lái)，也就無(wú)法檢測(cè)出來(lái)。這時(shí)病人病情可能更為嚴(yán)重。第二，疾病的不同階段，1,3-D-葡聚糖水平是有變化的。一般來(lái)說(shuō)，隨著抗真菌藥物的治療，感染的控制，1,3-D-葡聚糖水平也會(huì)相應(yīng)下降。因此，如果兩個(gè)病人處于疾病的不同階段，其檢測(cè)結(jié)果是不可比較的。此外，不同的真菌1,3-D-葡聚糖水平也不同。如念珠菌感染者血清1,3-D-葡聚糖平均值為755 p g/ mL ，曲霉感染者1,3-D-葡聚糖平均值為1 103 pg/ mL ，鐮刀霉感染者1,3-D-葡聚糖平均值為1 652 pg/ mL ，接合菌（毛霉、根霉） 細(xì)胞壁不產(chǎn)1,3-D-葡聚糖，感染

6、接合菌的患者血清1,3-D-葡聚糖值為0 ，隱球菌細(xì)胞壁外有莢膜包裹，因此不易檢測(cè)到細(xì)胞壁上的抗原，但是在一定條件下莢膜自身可釋放出極微量的1,3-D-葡聚糖到血清中，所以檢測(cè)值可大于0，但仍小于陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。而對(duì)于口腔和其他器官的真菌定植患者，1,3-D-葡聚糖值也較低，一般不超過(guò)20 pg/ mL（或者其他檢測(cè)熱體系的陽(yáng)性診斷值）。7、G試驗(yàn)為什么要強(qiáng)調(diào)連續(xù)檢測(cè)？答：1,3-D-葡聚糖水平是隨著疾病過(guò)程而變化的。因此，在感染的最早期，細(xì)菌或真菌剛剛進(jìn)入人體，數(shù)量較少，因此檢測(cè)不出來(lái)。或者由于病人機(jī)體免疫功能的變化，1,3-D-葡聚糖的產(chǎn)生速度和量也有變化，或者由于某些干擾因素存在造成假陽(yáng)性

7、或假陰性結(jié)果。因此，不能只靠一次檢測(cè)結(jié)果就判定有無(wú)感染，我國(guó)許多侵襲性真菌感染診斷標(biāo)準(zhǔn)中都要求次檢測(cè)結(jié)果均大于診斷值才有診斷意義。此外，檢測(cè)應(yīng)覆蓋整個(gè)疾病過(guò)程，特別是在疾病早期更應(yīng)重視連續(xù)檢測(cè)，以免出現(xiàn)漏診或誤診。8、為什么G試驗(yàn)的重復(fù)性不理想？答：1,3-D-葡聚糖自身一些理化性質(zhì)就可以影響G試驗(yàn)。反應(yīng)易受葡聚糖的分子量、分支度，特別受到三維結(jié)構(gòu)的影響。發(fā)現(xiàn)平均分子量在之間的1,3-D-葡聚糖，隨其分子量增加和分支度減少，激活G因子的能力越強(qiáng)；分子量在6.75-27.50 kDa之間的1,3-D-葡聚糖的裂褶菌多糖對(duì)G因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)有抑制作用。Aketagawa等發(fā)現(xiàn)單股螺旋的1,3-D-葡

8、聚糖在G因子反應(yīng)中起著決定性作用；Nagi等在研究試驗(yàn)條件時(shí)發(fā)現(xiàn)三股螺旋的1,3-D-葡聚糖不與G因子反應(yīng)。故該法測(cè)定之前常用NaOH對(duì)1,3-D-葡聚糖進(jìn)行預(yù)處理，使其轉(zhuǎn)化為單股螺旋的1,3-D-葡聚糖，已減少實(shí)驗(yàn)誤差。會(huì)不會(huì)真菌釋放的1,3-D-葡聚糖發(fā)生上述變化，尚不清楚。不同批號(hào)的鱟試劑標(biāo)示值相同，但試驗(yàn)結(jié)果不盡相同，尤其是接近失效者的靈敏度有明顯下降的趨勢(shì)。所以在更換批號(hào)或者用接近失效期鱟試劑的時(shí)候，應(yīng)對(duì)靈敏度進(jìn)行復(fù)核，以確定本批鱟試劑的實(shí)際靈敏度。9、哪些抗菌藥物對(duì)G試驗(yàn)有正干擾現(xiàn)象？答：文獻(xiàn)報(bào)告磺胺類、阿莫西林/克拉維酸、頭孢類藥物藥物可造成假陽(yáng)性。頭孢菌素類中可能涉及頭孢哌酮鈉

9、、頭孢美唑鈉、頭孢米諾、頭孢西丁、頭孢噻肟鈉、頭孢噻肟和頭孢哌酮/舒巴坦鈉。此外厄他培南也可能造成假陽(yáng)性，具體機(jī)制尚不清楚。哌拉西林/他唑巴坦尚不清楚有無(wú)干擾，但對(duì)半乳甘露聚糖（GM）試驗(yàn)有正干擾。10、患者使用可引起假陽(yáng)性的血液制品，含真菌成分的抗腫瘤藥物或者透析治療及手術(shù)后多長(zhǎng)時(shí)間檢查G試驗(yàn)可避免假陽(yáng)性？答：血液制品中白蛋白和免疫球蛋白可激活 G 因子途徑，對(duì)G試驗(yàn)影響很大。文獻(xiàn)報(bào)告，靜脈輸入IgG 10g可使血漿濃度升高達(dá)300pg/mL以上，這足以誤診為侵襲性真菌感染（IFI）。血漿的平均半衰期為20（）h ，推斷在1周后復(fù)查1,3-D-葡聚糖濃度應(yīng)明顯下降或轉(zhuǎn)陰，可作為與IFI的鑒別

10、。 這與上述物質(zhì)的代謝有關(guān)，抗菌素一般48小時(shí)后上述物質(zhì)代謝完成或排出體外，但是血漿制品，包括白蛋白代謝半衰期較長(zhǎng)，一般需要停用10天左右再查合適。11、某些細(xì)菌的敗血癥也可引起G試驗(yàn)出現(xiàn)假陽(yáng)性，能具體說(shuō)明嗎?答：文獻(xiàn)報(bào)告某些細(xì)菌敗血病患者，例如鏈球菌敗血癥，綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的一些可溶性抗原可造成G試驗(yàn)假陽(yáng)性。敗血癥患者，特別合并全身炎癥反應(yīng)綜合征的病人，由于機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生許多炎癥因子，如IL-6和IL-8，這些炎癥因子可參與試驗(yàn)過(guò)程，引起假陽(yáng)性結(jié)果。文獻(xiàn)報(bào)道，在重癥監(jiān)護(hù)病房住院時(shí)間超過(guò)14天的患者多伴有不同程度血漿1,3-D-葡聚糖濃度升高，而這些患者并不一定為IFI；某些細(xì)菌感染

11、，如金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌感染以及凝固酶陰性的葡萄球菌膿毒癥時(shí)可能出現(xiàn)G試驗(yàn)假陽(yáng)性結(jié)果。甚至部分支原體、EB病毒感染患兒G試驗(yàn)亦呈陽(yáng)性，但多為輕度升高，且7天后復(fù)查多已轉(zhuǎn)陰性，考慮可能與感染本身。 12、抗真菌藥物對(duì)G試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果有什麼影響？答：抗真菌藥物治療后真菌生長(zhǎng)受到抑制，這是明確的。但是由于藥物作用機(jī)理不同，對(duì)G試驗(yàn)結(jié)果不完全一致。例如，兩性霉素B脂質(zhì)體能夠作用于真菌細(xì)胞壁成分甘露聚糖和甘露聚糖蛋白質(zhì)復(fù)合體使之結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定以致胞壁破壞，可能造成1,3-D-葡聚糖值一過(guò)性增高 。而卡泊芬靜為葡聚糖合成酶抑制劑，非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制真菌細(xì)胞壁的1,3-D-葡聚糖的合成，可以造成假陰性結(jié)果。13

12、、G試驗(yàn)質(zhì)控時(shí)，直接使用廠家提供的均值和標(biāo)準(zhǔn)差是否合適？答：不能。這是因?yàn)閺S家和用戶使用的試驗(yàn)條件不同。廠家提供的質(zhì)控品的定值不能作為質(zhì)控中的均值，必須按照質(zhì)控規(guī)范在自己的檢測(cè)系統(tǒng)和試驗(yàn)條件下重新測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)差也是如此。14、為什么質(zhì)控品必須和試劑同一批號(hào)？答：這是G試驗(yàn)的一個(gè)特點(diǎn)。因?yàn)槊颗a(chǎn)的試劑敏感度不同，取決于每批試劑中主試劑（鱟血中G因子）活性?；钚圆煌?,3-D-葡聚糖對(duì)它的反應(yīng)結(jié)果不同。而質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)是建立在具體反應(yīng)體系上的，不同批號(hào)間的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)是有差異的。15、標(biāo)準(zhǔn)曲線能不能代替質(zhì)控品？答：可以，不過(guò)每天都要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以確保當(dāng)天檢測(cè)結(jié)果正確可靠。但是，要特別提醒用戶，不能使用公司

13、提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線，一定要用戶自己做標(biāo)曲。16、為什么質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)在控，而病人的測(cè)定結(jié)果仍有問(wèn)題？答：這要看用戶在建立最初質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)時(shí)是否先做了標(biāo)準(zhǔn)曲線（也就是定標(biāo)）。如果用戶沒(méi)有定標(biāo)就進(jìn)行20個(gè)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)的測(cè)定，那些數(shù)據(jù)很可能不正確。無(wú)論是標(biāo)準(zhǔn)曲線，還是質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，還是病人樣本的檢測(cè)都與試劑有關(guān)。試劑有變化，其他結(jié)果也會(huì)隨之變化。所以，試劑更換批號(hào)，標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)都要重新建立。17、當(dāng)日一批試驗(yàn)結(jié)果中出現(xiàn)數(shù)個(gè)結(jié)果與臨床診斷不符合，如何解決？答：（1）觀察當(dāng)日質(zhì)控結(jié)果是否失控？（2）檢查操作過(guò)程有無(wú)差錯(cuò)？（3）檢查試劑有無(wú)過(guò)期或變質(zhì)？是否使用不同批號(hào)的試劑？（4）檢查標(biāo)準(zhǔn)曲線是否合格？（5）了解病人采樣

14、時(shí)的臨床背景，如病程、是否使用抗真菌藥物治療等。（6）找廠家工程師檢查。18、有沒(méi)有真菌1,3-D-葡聚糖檢測(cè)的免疫學(xué)方法?答:-半乳糖神經(jīng)酰胺可高親和地與1,3-D-葡聚糖結(jié)合。Donald等依次建立一種以-半乳糖神經(jīng)酰胺包被物，鼠抗1,3-D-葡聚糖單克隆抗體的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)系統(tǒng)，特異性檢測(cè)生物體液中1,3-D-葡聚糖。發(fā)現(xiàn)1,3-D-葡聚糖含量低于0.8ng/mL時(shí)線性良好，并具有良好的回收率，相對(duì)于鱟試驗(yàn)受干擾物質(zhì)影響更小，同樣具有較高的精密度和準(zhǔn)確度。但本法尚無(wú)分子量、分支度及三維構(gòu)型對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響的報(bào)告。此外，鼠抗1,3-D-葡聚糖單克隆抗體是否能廣譜識(shí)別各種真菌1,3-D-葡聚

15、糖還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。第二節(jié)：念珠菌抗原和抗體測(cè)定一、念珠菌抗原測(cè)定1. 可用于檢測(cè)的念珠菌病相關(guān)抗原有哪些？答：念珠菌病相關(guān)的血清學(xué)檢測(cè)主要通過(guò)檢測(cè)患者血液循環(huán)中的各類抗原：如甘露聚糖（mannan）、1-3-D葡聚糖、細(xì)胞質(zhì)烯醇化酶（Eno）、磷酸甘油酸酯激酶（Pgk1p）、熱休克蛋白(HSP90)以及蛋氨酸合酶（ Met6p ）等。其中，甘露聚糖是目前研究最為廣泛的一種真菌血清抗原。2. 為什么甘露聚糖可用于侵襲性念珠菌病的檢測(cè)？答：甘露糖是目前研究最為廣泛的一種真菌血清抗原,它對(duì)熱穩(wěn)定,廣泛存在于真菌胞壁中,是真菌胞壁的重要組成成分,甘露糖在不同真菌中的含量和作用不是恒定不變的,常常受周

16、圍環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和細(xì)胞形態(tài)的影響。其在真菌致病過(guò)程中參與了免疫調(diào)節(jié)、防御，而且抗甘露糖抗體具有保護(hù)性作用。酵母菌中導(dǎo)致侵襲性感染者主要為念珠菌屬，少數(shù)為新生隱球菌，當(dāng)念珠菌感染時(shí)，甘露聚糖會(huì)被釋放入血，故可進(jìn)行血液檢測(cè)。而隱球菌的厚莢膜使細(xì)胞壁上的甘露聚糖難以釋放人血而不易測(cè)得，所以血漿中甘露聚糖抗原陽(yáng)性與侵襲性念珠菌感染有高度相關(guān)性，可用于早期診斷侵襲性念珠菌感染。3. 為什么檢測(cè)甘露聚糖可用于侵襲性念珠菌病早期診斷？答：念珠菌免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)在靈敏度和特異性方面都較組織病理學(xué)、念珠菌培養(yǎng)、直接鏡檢和影像學(xué)檢查有明顯的優(yōu)勢(shì)，抗原檢測(cè)陽(yáng)性要早于念珠菌培養(yǎng)陽(yáng)性，敏感性達(dá)80%以上，正逐漸成為念珠菌

17、檢測(cè)的常用方法。在國(guó)內(nèi)外侵襲性真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)中，均認(rèn)為血清念珠菌抗原陽(yáng)性可作為微生物學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，因此測(cè)定血清中的甘露聚糖有助于侵襲性念珠菌病的早期診斷、早期治療。4. 目前，念珠菌病相關(guān)抗原檢測(cè)有商品化的試劑嗎？答：以上提到的甘露聚糖（mannan）、1-3-D葡聚糖、細(xì)胞質(zhì)烯醇化酶（Eno）、磷酸甘油酸酯激酶（Pgk1p）、熱休克蛋白(HSP90)以及蛋氨酸合酶（Met6p ）等念珠菌相關(guān)抗原中，只有1-3-D葡聚糖（G試驗(yàn)）和甘露聚糖檢測(cè)有商品化試劑提供，其它相關(guān)抗原目前僅限于科研。5. 商品化的念珠菌甘露聚糖抗原檢測(cè)試劑盒有哪些？答：目前，商品化的念珠菌甘露聚糖抗原檢測(cè)試劑盒極少，國(guó)

18、外產(chǎn)品只有伯樂(lè)（Bio-Rad）公司生產(chǎn)的PLATELIA Candida試劑盒；國(guó)內(nèi)產(chǎn)品只有天津貽諾琦（Bio-Enoche）生物工程有限公司（中美合資）生產(chǎn)的念珠菌甘露聚糖抗原檢測(cè)試劑盒。6. 念珠菌甘露聚糖檢測(cè)試劑盒原理？答：伯樂(lè)（Bio-Rad）公司Platelia Candida試劑盒原理：該試劑盒采用雙抗體夾心一步法，待檢血清（或血漿）中的甘露聚糖或標(biāo)準(zhǔn)品與包被在酶標(biāo)板上的鼠單抗（捕獲抗體）及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠單抗（檢測(cè)抗體）形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物，再加入底物顯色，在酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定吸光度值，測(cè)定值和待檢抗原的濃度呈正相關(guān)，根據(jù)甘露聚糖標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算待檢標(biāo)本

19、中甘露聚糖的濃度（pg/ml）。該試劑盒可進(jìn)行定性或定量分析。貽諾琦（Bio-Enoche）公司試劑盒原理：該試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)法， 先將甘露聚糖包被在酶標(biāo)板上，再加入待檢血清（或血漿）和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的甘露聚糖抗體，此時(shí)，待檢標(biāo)本中的甘露聚糖及甘露聚糖標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)板上的甘露聚糖競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合有限的抗體結(jié)合位點(diǎn)，再加入底物顯色，在酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定吸光度值，測(cè)定值和待檢抗原的濃度呈負(fù)相關(guān)，可根據(jù)甘露聚糖標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算待檢標(biāo)本中甘露聚糖的濃度（pg/ml）。該試劑盒可進(jìn)行定性或定量分析。7. 念珠菌甘露聚糖檢測(cè)試劑盒可檢測(cè)什么標(biāo)本？答：可檢測(cè)血清或血漿標(biāo)本。8. 待檢標(biāo)本為什么需要預(yù)處

20、理？答：血清或血漿標(biāo)本均需要預(yù)處理。標(biāo)本與處理液混合后加熱，可以：（1）將標(biāo)本中的抗原-抗體復(fù)合物解離，有利于抗原檢測(cè)。（2）將標(biāo)本中的蛋白質(zhì)變性并沉淀，減少其對(duì)免疫測(cè)定的干擾。9. 標(biāo)本如何進(jìn)行預(yù)處理？答：在離心管中加300µL待檢血清或血漿，再加入100µL樣本處理液，漩渦震蕩10秒混勻，將離心管放入水浴鍋內(nèi)100加熱90秒后10000g離心10分鐘，取上清即可進(jìn)行檢測(cè)。10. 如何保證甘露聚糖試劑盒檢測(cè)的可靠性？答：為保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性、可靠性和減少系統(tǒng)誤差，每次實(shí)驗(yàn)都必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控品，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線r>0.98以上和質(zhì)控品不失控的前提下才能進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。11

21、. 開(kāi)展甘露聚糖檢測(cè)需用什么儀器設(shè)備？答：需要使用的儀器包括：酶標(biāo)儀（450nm）、恒溫箱（37）、離心機(jī)、水浴鍋、混旋器等。二、念珠菌抗體測(cè)定1. 念珠菌抗體檢測(cè)有什么臨床意義？答：過(guò)去人們并不看好真菌抗體檢測(cè)在診斷中的作用，但是近年來(lái)的研究表明，抗體檢測(cè)在以下方面具有重要臨床意義：（1）區(qū)分真菌感染與定植。（2）免疫缺陷的患者仍可以產(chǎn)生達(dá)到診斷水平的抗體濃度。（3）真菌感染有一個(gè)相對(duì)較長(zhǎng)的潛伏期，抗體的檢測(cè)能滿足臨床對(duì)診斷時(shí)間窗的要求。（4）抗原和抗體聯(lián)合檢測(cè)可提高臨床診斷的敏感性和特異性。2. 為什么檢測(cè)抗體可以區(qū)分念珠菌感染與定植？答：定植者抗體水平很低，而感染者抗體水平明顯增高，完全

22、可以通過(guò)臨界值加以區(qū)分。特別是選擇那些只有在侵襲性感染時(shí)才釋放出來(lái)的優(yōu)勢(shì)抗原，就可以避免定植所引起的假陽(yáng)性。Fasahat F Alam等分別對(duì)32例念珠菌培養(yǎng)陽(yáng)性患者、51例臨床疑似念珠菌感染患者、10例念珠菌定植者和16例健康人進(jìn)行念珠菌甘露聚糖抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示念珠菌培養(yǎng)陽(yáng)性和臨床疑似念珠菌感染者抗體陽(yáng)性率和抗體效價(jià)均較高，而念珠菌定植者抗體陽(yáng)性率和抗體效價(jià)均較低，健康人抗體均陰性。該研究提示，可以建立適當(dāng)?shù)目贵w臨界值將念珠菌感染和定植加以區(qū)分。3. 免疫缺陷的患者能檢測(cè)到念珠菌抗體嗎？答：抗體產(chǎn)生依賴于正常的免疫機(jī)能，而IFI患者多處于免疫缺陷狀態(tài)，無(wú)法正常產(chǎn)生抗體，或產(chǎn)生遲緩。200

23、6 年P(guān)itarch 等將白念珠菌細(xì)胞壁成分用二維電泳技術(shù)分離，進(jìn)行免疫蛋白質(zhì)組學(xué)研究，用侵襲性念珠菌病人血清和對(duì)照血清分別與之反應(yīng)，篩選出與患者血清發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)的免疫優(yōu)勢(shì)抗原。這些抗原主要有: 烯醇化酶（ Eno）、磷酸甘油酸酯激酶（Pgk1p）、蛋氨酸合酶（ Met6p ）、-1，3葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（ Bgl2p）和果糖二磷酸醛縮酶（ Fba1）。IC 患者可能產(chǎn)生針對(duì)這些抗原的抗體，甚至是嚴(yán)重的免疫抑制患者如肝移植、干細(xì)胞移植和HIV 患者也可產(chǎn)生這些抗體。 4. 念珠菌抗體檢測(cè)適用于侵襲性念珠菌病早期診斷嗎？答：Yera等的研究表明，有73%的侵襲性念珠菌?。╥nvasive candi

24、diasis，IC）患者至少可以早于血培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果2天檢出抗體，最多可早于15天，平均為7天。 近年來(lái)的研究顯示: 念珠菌在黏膜定植時(shí)可能已有部分細(xì)胞壁抗原暴露于宿主免疫系統(tǒng)。當(dāng)發(fā)生IC 時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生免疫記憶反應(yīng)，表現(xiàn)出相對(duì)早期IgG的反應(yīng)，并優(yōu)于IgM。而IgM 升高的血清抗體其抗原是念珠菌胞漿內(nèi)抗原，在定植共生狀態(tài)下，可能極少暴露于機(jī)體體液免疫系統(tǒng)。當(dāng)發(fā)生IC時(shí)，免疫受損患者表現(xiàn)出與免疫正?；颊哳愃频难鍖W(xué)反應(yīng)，IgG 早期升高，說(shuō)明血清抗體檢測(cè)同樣也適用于免疫受損患者早期診斷念珠菌病。并且隨著抗真菌藥物治療，IgG水平下降。所以，檢測(cè)IgG也不失為一種療效觀察的方法。 5. 為什么念珠菌

25、抗原和抗體聯(lián)合檢測(cè)可提高臨床診斷敏感性和特異性？答：甘露聚糖在機(jī)體內(nèi)能被降解，因此抗甘露聚糖抗體的檢測(cè)可以彌補(bǔ)甘露聚糖檢測(cè)的局限性，尤其是抗體和甘露聚糖聯(lián)合檢測(cè)，可以大大提高診斷的敏感性和特異性。Fasahat F Alam等對(duì)31例感染念珠菌的患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)念珠菌甘露聚糖敏感性為41%；甘露聚糖抗體敏感性為47%；甘露聚糖和甘露聚糖抗體聯(lián)合檢測(cè)，敏感性可顯著提高至75%。國(guó)外另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)念珠菌甘露聚糖敏感性為58%，特異性為93%；甘露聚糖抗體敏感性為59%，特異性為83%；甘露聚糖和甘露聚糖抗體聯(lián)合檢測(cè)，敏感性可達(dá)83%，特異性為86%。6. 抗原和抗體聯(lián)合檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)是什么

26、？答：鑒于侵襲性真菌感染的隱蔽性和發(fā)病的特點(diǎn)，建議在使用實(shí)驗(yàn)室手段進(jìn)行侵襲性真菌感染診斷時(shí)應(yīng)采取多種方法的聯(lián)合檢驗(yàn)，強(qiáng)調(diào)真菌培養(yǎng)和非培養(yǎng)技術(shù)的結(jié)合，各種非培養(yǎng)技術(shù)之間的聯(lián)合。例如，抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)?？乖涂贵w的聯(lián)合檢驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)：（1）優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，提高檢測(cè)的敏感性和特異性。（2）能更準(zhǔn)確地反映感染程度及階段。（3）用藥前后抗原抗體的檢測(cè)值變化可為臨床用藥的評(píng)價(jià)提供依據(jù)，有利于疾病的預(yù)后。7. 怎樣設(shè)計(jì)念珠菌抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)方案？答：可參考如下方案8. 怎樣分析真菌抗原和抗體聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果？答：真菌抗原和抗體聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果分析見(jiàn)表3-1，僅供參考。表3-1 抗原、抗體聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果判定 抗原 抗體 臨床分析

27、 + + 侵襲性真菌感染 + - 早期感染/未產(chǎn)生抗體或免疫力低下/無(wú)抗體產(chǎn)生 - + 感染一段時(shí)間/抗原可能分解/抗原被抗體中和 - - 無(wú)侵襲性真菌感染9. 商品化的念珠菌抗體檢測(cè)試劑盒有哪些？答：商品化的念珠菌抗體檢測(cè)試劑盒，國(guó)外產(chǎn)品有伯樂(lè)（Bio-Rad）公司生產(chǎn)的Platelia Candida Ab-Ac-Ak抗體檢測(cè)試劑盒，德國(guó)Virion Serion公司生產(chǎn)的IgA、IgM、IgG抗體檢測(cè)試劑盒，美國(guó)IBL公司生產(chǎn)的IgA、IgM、IgG抗體檢測(cè)試劑盒；國(guó)內(nèi)產(chǎn)品有天津貽諾琦（Bio-Enoche）生物工程有限公司（中美合資）生產(chǎn)的念珠菌IgM、IgG抗體檢測(cè)試劑盒（ELISA

28、）。10. 念珠菌抗體檢測(cè)試劑盒原理？答：念珠菌IgM、IgG抗體檢測(cè)試劑盒（ELISA）原理相同，均采用ELISA間接法。將預(yù)處理后的患者血清（或血漿）樣本加到包被有念珠菌抗原的酶標(biāo)板中，血清（或血漿）中的念珠菌IgM或IgG抗體與固相抗原結(jié)合，再加入抗人IgM酶標(biāo)抗體或抗人IgG酶標(biāo)抗體，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，最后加四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，吸光度值與待測(cè)物濃度成正比，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣本中念珠菌IgM或IgG抗體濃度進(jìn)行定量分析。11. 國(guó)產(chǎn)念珠菌IgM、IgG抗體檢測(cè)試劑盒性能指標(biāo)？答：上述國(guó)產(chǎn)念珠菌IgM、IgG抗體檢測(cè)試

29、劑盒分析靈敏度為31.25AU/mL；特異性均大于90%；測(cè)范圍均為31.25500AU/mL；與德國(guó)Virion Serion公司IgM、IgG抗體檢測(cè)試劑盒總體符合率分別為80.9%（36例對(duì)比）和71.4%（35例對(duì)比）。12. 念珠菌IgM抗體檢測(cè)為什么樣本需要預(yù)處理？答：樣本處理的目的是去除類風(fēng)濕因子的干擾。類風(fēng)濕因子是一種以變性IgG為抗原的自身抗體，主要為IgM型。進(jìn)行IgM抗體檢測(cè)時(shí)，它的存在會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。此外，結(jié)合力強(qiáng)的病原體特異性IgG抗體也可能取代結(jié)合力弱的病原體特異性IgM抗體與抗原結(jié)合，造成IgM檢測(cè)假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。因此，進(jìn)行白色念珠菌IgM抗體檢測(cè)前需用類風(fēng)濕

30、因子吸附劑吸附掉血清中可能存在的類風(fēng)濕因子。13. 為什么念珠菌IgM、IgG抗體檢測(cè)濃度單位是AU/ml？答：目前，尚無(wú)念珠菌IgM和IgG的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)1995年國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）和國(guó)際臨床化學(xué)和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)聯(lián)盟（IFCC）推薦的“臨床實(shí)驗(yàn)室物質(zhì)特性和單位命名規(guī)則”（PROPERTIES AND UNITS IN THE CLINIC LABORATORY SCIENCES I. SYNTAX AND SEMANTIC RULES），使用AU/ml（arbitrary unit）作為濃度單位（該單位不是國(guó)際統(tǒng)一單位）。14. 開(kāi)展念珠菌抗體檢測(cè)需用什么儀器

31、設(shè)備？答：需要使用的儀器包括：酶標(biāo)儀（450nm）、恒溫箱（37）、離心機(jī)、混旋器等。第三節(jié) 曲霉菌抗原和抗體測(cè)定一、曲霉菌抗原測(cè)定1. 為什么檢測(cè)半乳甘露聚糖可用于侵襲性曲霉菌?。↖A）的早期診斷？答：半乳甘露聚糖（galacto-mannan，GM）是曲霉細(xì)胞壁上的一種多聚抗原，其中具有免疫反應(yīng)性的是呋喃半乳糖，菌絲生長(zhǎng)時(shí)能從薄弱的菌絲頂端釋放，是最早釋放的真菌抗原。GM釋放量與菌量成正比，可以反映感染程度。GM在感染后24小時(shí)（感染早期）即可檢測(cè)到，與病情嚴(yán)重程度一致。有2/3的患者在臨床癥狀和影像學(xué)出現(xiàn)異?；蚱渌\斷方法陽(yáng)性之前6-14天即可檢測(cè)到GM，對(duì)高?；颊哌B續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)（每周2次

32、）具有早期診斷價(jià)值。GM試驗(yàn)可用于曲霉菌感染早期診斷的篩查指標(biāo)。歐洲癌癥研究和治療組織和美國(guó)真菌病研究組(EORTC/MSG)已經(jīng)把半乳甘露聚糖（GM）作為診斷曲霉病的標(biāo)準(zhǔn)之一。中國(guó)侵襲性真菌感染工作組經(jīng)反復(fù)討論，并參照歐洲癌癥研究和治療組織和美國(guó)真菌病研究組(EORTC/MSG)有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，同樣把血清中半乳甘露聚糖（GM）陽(yáng)性作為診斷曲霉病的標(biāo)準(zhǔn)。2. 半乳甘露聚糖檢測(cè)還有什么臨床意義？ 答：國(guó)內(nèi)外的薈萃分析結(jié)果表明，其診斷的靈敏度和特異性均高達(dá)90%左右?；颊哐逯蠫M含量與感染程度相關(guān)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血清GM水平的變化可作為病情轉(zhuǎn)歸和療效評(píng)價(jià)指標(biāo)。在治療期間，病人GM持續(xù)陽(yáng)性或保持較高水平則預(yù)后

33、差，GM抗原清除早的病人預(yù)后好。但是對(duì)非粒缺患者的診斷價(jià)值尚有爭(zhēng)議。3. G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)聯(lián)合檢測(cè)可提高IA診斷準(zhǔn)確率？答： GM試驗(yàn)和G試驗(yàn)發(fā)生假陽(yáng)性的人群不同。GM 試驗(yàn)在巨細(xì)胞病毒血癥、銅綠假單胞菌和化療后金葡菌和表葡菌感染者血清中會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，但這些患者G試驗(yàn)則為陰性；而出現(xiàn)G試驗(yàn)假陽(yáng)性的白念珠菌定植者GM 試驗(yàn)則為陰性。因此，當(dāng)兩者都出現(xiàn)陽(yáng)性時(shí)可以基本診斷IA，兩者聯(lián)合使用可最大程度地降低假陽(yáng)性率。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)GM試驗(yàn)靈敏度為70%，特異性為84%；單獨(dú)G試驗(yàn)靈敏度為50%，特異性為92%。GM試驗(yàn)和G試驗(yàn)二者聯(lián)合試驗(yàn)時(shí)，其靈敏度和特異性分別為93%和78%。GM試驗(yàn)和G試驗(yàn)

34、均對(duì)侵襲性真菌病具有診斷價(jià)值，二者聯(lián)合應(yīng)用使其應(yīng)用價(jià)值進(jìn)一步提高。4. 商品化的半乳甘露聚糖抗原檢測(cè)試劑盒有哪些？ 答：目前，商品化的曲霉菌半乳甘露聚糖抗原檢測(cè)試劑盒較少，國(guó)外產(chǎn)品有伯樂(lè)（Bio-Rad）公司生產(chǎn)的PLATELIA ASPERGILLUS EIA試劑盒；國(guó)內(nèi)產(chǎn)品只有天津貽諾琦（Bio-Enoche）生物工程有限公司（中美合資）生產(chǎn)的曲霉菌半乳甘露聚糖抗原檢測(cè)試劑盒。5. 曲霉菌半乳甘露聚糖檢測(cè)試劑盒原理？答：伯樂(lè)（Bio-Rad）公司PLATELIA ASPERGILLUS EIA試劑盒原理：該試劑盒采用一步夾心法，待檢血清（或血漿）中的半乳甘露聚糖與包被在酶標(biāo)板上的鼠單抗（捕

35、獲抗體）及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠單抗（檢測(cè)抗體）形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物，再加入底物顯色，在酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定吸光度值，測(cè)定值和待檢抗原的濃度呈正相關(guān)，以臨界值（Cutoff）對(duì)待檢標(biāo)本中是否含有半乳甘露聚糖進(jìn)行定性分析。貽諾琦（Bio-Enoche）公司試劑盒原理：該試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)法， 先將半乳甘露聚糖包被在酶標(biāo)板上，再加入待檢血清（或血漿）和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的半乳甘露聚糖抗體，此時(shí)，待檢標(biāo)本中的半乳甘露聚糖及半乳甘露聚糖標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)板上的半乳甘露聚糖競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合有限的抗體結(jié)合位點(diǎn)，再加入底物顯色，在酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定吸光度值，測(cè)定值和待檢抗原的濃度呈負(fù)相關(guān)，可根據(jù)半乳甘露聚糖標(biāo)準(zhǔn)

36、品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算待檢標(biāo)本中半乳甘露聚糖的濃度。該試劑盒可進(jìn)行定量或定性分析。 6. 半乳甘露聚糖定量檢測(cè)有什么臨床意義？答：半乳甘露聚糖定量檢測(cè)試劑盒與定性試劑盒相比不但可以進(jìn)行定性分析，還可對(duì)半乳甘露聚糖精確定量，有利于判斷患者侵襲性曲霉感染的嚴(yán)重程度。此外，半乳甘露聚糖含量的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)在抗真菌藥物療效觀察、停藥時(shí)機(jī)的選擇及預(yù)后等方面有重要臨床意義。7. 國(guó)產(chǎn)半乳甘露聚糖ELISA試劑盒性能指標(biāo)如何？答：上述國(guó)產(chǎn)半乳甘露聚糖ELISA試劑盒分析靈敏度0.1ng/ml；特異性達(dá)89%；測(cè)范圍為0.1-10ng/ml；與Bio-Rad公司PLATELIA ASPERGILLUS EIA檢測(cè)試劑

37、盒進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)（109例樣本），陽(yáng)性符合率91.4%，陰性符合率85.2%。8. 哪些標(biāo)本可用于半乳甘露聚糖檢測(cè)？答：標(biāo)本可以是血清、尿液、腦脊液及肺泡灌洗液（BAL）等，但敏感性和特異性有所不同。9. 待檢標(biāo)本為什么需要預(yù)處理？答：血清或血漿標(biāo)本均需要預(yù)處理。標(biāo)本與處理液混合后加熱，可以：（1）將標(biāo)本中的抗原-抗體復(fù)合物解離，有利于抗原檢測(cè)。（2）將標(biāo)本中的蛋白質(zhì)變性并沉淀，減少其對(duì)免疫測(cè)定的干擾。10. 標(biāo)本如何進(jìn)行預(yù)處理？答：在離心管中加300µL待檢血清或血漿，再加入100µL樣本處理液，漩渦震蕩10秒混勻，將離心管放入水浴鍋內(nèi)100加熱90秒后10000g離心10

38、分鐘，取上清即可進(jìn)行檢測(cè)。11. 半乳甘露聚糖檢測(cè)試劑盒需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控嗎？答：為消除系統(tǒng)誤差和保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性、可靠性，每次實(shí)驗(yàn)都必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線和陰性、陽(yáng)性質(zhì)控，并在質(zhì)控品不失控的前提下才能進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。12. 哪些因素可造成半乳甘露聚糖檢測(cè)假陽(yáng)性？答：抗菌藥物如哌拉西林、他唑巴坦、阿莫西林、克拉維酸等與GM有交叉反應(yīng)，因此在接受這些藥物治療的患者中試驗(yàn)的特異性可能會(huì)下降。GM試驗(yàn)的假陽(yáng)性率為10%-15%，一般在以乳制品為主食的嬰幼兒、異體骨髓移植患者、菌血癥患者、自身抗體陽(yáng)性及使用半合成青霉素的患者中較易出現(xiàn)。13. 半乳甘露聚糖檢測(cè)的局限性？ 答：GM檢測(cè)對(duì)中性粒細(xì)胞減少患者感染曲

39、霉的診斷價(jià)值較高，但對(duì)兒童、腫瘤及ICU 危重患者、中性粒細(xì)胞不減少或減少不嚴(yán)重的其他IA 高危人群診斷價(jià)值有限。對(duì)此現(xiàn)象的解釋是由于中性粒細(xì)胞能吞噬并快速殺傷菌絲，使體內(nèi)真菌載量降低，從而使釋放入血液的GM 減少而難以檢出。14. 開(kāi)展GM檢測(cè)需用什么儀器設(shè)備？答：需要使用的儀器包括：酶標(biāo)儀（450nm）、恒溫箱（37）、離心機(jī)、水浴鍋、混旋器等。二、曲霉菌抗體測(cè)定1. 曲霉菌抗體檢測(cè)臨床意義？答：曲霉抗體的研究沒(méi)有念珠菌抗體那么廣泛和深入。Latgé 等研究小組報(bào)道，約1/2的IA 患者產(chǎn)生曲霉特異性抗體。Sambatakou 等進(jìn)一步證明，抗體測(cè)定對(duì)非中性粒細(xì)胞減少的亞急性侵襲

40、性曲霉?。╥nvasive aspergillosis，IA）患者是最好的無(wú)創(chuàng)診斷方法。Kappe R等研究發(fā)現(xiàn)，總體大約23%的侵襲性曲霉感染患者曲霉抗體檢測(cè)呈陽(yáng)性，免疫力低下的病人在用藥有效后10.8天左右能檢測(cè)到抗體產(chǎn)生?？贵w檢測(cè)尤其是ELISA法IgG抗體檢測(cè)對(duì)臨床診斷的確認(rèn)和臨床用藥的評(píng)價(jià)有著十分重要的意義。2. 商品化的曲霉菌抗體檢測(cè)試劑盒有哪些？答：商品化的曲霉菌抗體檢測(cè)試劑盒，國(guó)外產(chǎn)品有伯樂(lè)（Bio-Rad）公司生產(chǎn)的Platelia Aspergullus IgG抗體檢測(cè)試劑盒，德國(guó)Virion Serion公司生產(chǎn)的IgA、IgM、IgG抗體檢測(cè)試劑盒，美國(guó)IBL公司生產(chǎn)的

41、IgA、IgM、IgG抗體檢測(cè)試劑盒；國(guó)內(nèi)產(chǎn)品有天津貽諾琦（Bio-Enoche）生物工程有限公司（中美合資）生產(chǎn)的曲霉菌IgM、IgG抗體檢測(cè)試劑盒（ELISA）。3. 曲霉菌抗體檢測(cè)試劑盒原理？答：曲霉菌IgM、IgG抗體檢測(cè)試劑盒（ELISA）原理相同，均采用ELISA間接法。將預(yù)處理后的患者血清（或血漿）樣本加到包被有曲霉菌抗原的酶標(biāo)板中，血清（或血漿）中的曲霉菌IgM或IgG抗體與固相抗原結(jié)合，再加入抗人IgM酶標(biāo)抗體或抗人IgG酶標(biāo)抗體，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，最后加四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，吸光度值與待測(cè)物濃度成正比，

42、通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣本中曲霉菌IgM或IgG抗體濃度進(jìn)行定量分析。4. 國(guó)產(chǎn)曲霉菌IgM、IgG抗體檢測(cè)試劑盒性能指標(biāo)？答：上述國(guó)產(chǎn)曲霉菌IgM、IgG抗體檢測(cè)試劑盒分析靈敏度分別為8 AU/mL、31.25AU/mL；特異性均大于90%；測(cè)范圍分別為864AU/mL、 31.25500AU/mL；與德國(guó)Virion Serion公司IgM抗體檢測(cè)試劑盒總體符合率為96.8%（31例對(duì)比）。5. 曲霉菌IgM抗體檢測(cè)為什么樣本需要預(yù)處理？答：樣本處理的目的是去除類風(fēng)濕因子的干擾。類風(fēng)濕因子是一種以變性IgG為抗原的自身抗體，主要為IgM型。進(jìn)行IgM抗體檢測(cè)時(shí)，它的存在會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。此外，結(jié)合

43、力強(qiáng)的病原體特異性IgG抗體也可能取代結(jié)合力弱的病原體特異性IgM抗體與抗原結(jié)合，造成IgM檢測(cè)假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。因此，進(jìn)行曲霉菌IgM抗體檢測(cè)前需用類風(fēng)濕因子吸附劑吸附掉血清中可能存在的類風(fēng)濕因子。6. 為什么曲霉菌IgM、IgG抗體檢測(cè)濃度單位是AU/ml？答：目前，尚無(wú)曲霉菌IgM和IgG的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)1995年國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）和國(guó)際臨床化學(xué)和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)聯(lián)盟（IFCC）推薦的“臨床實(shí)驗(yàn)室物質(zhì)特性和單位命名規(guī)則”（PROPERTIES AND UNITS IN THE CLINIC LABORATORY SCIENCES I. SYNTAX AND S

44、EMANTIC RULES），使用AU/ml（arbitrary unit）作為濃度單位（該單位不是國(guó)際統(tǒng)一單位）。7. 開(kāi)展曲霉抗體檢測(cè)需用什么儀器設(shè)備？答：需要使用的儀器包括：酶標(biāo)儀（450nm）、恒溫箱（37）、離心機(jī)、混旋器等。8. 曲霉菌抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)方案是什么？答：可參考如下方案第四節(jié) 新型隱球菌抗原測(cè)定1. 莢膜多糖抗原檢測(cè)用于診斷隱球菌感染的優(yōu)勢(shì)？ 答：新型隱球菌臨床表現(xiàn)、腦脊液常規(guī)、生化檢測(cè)及頭顱影像學(xué)檢查均缺乏特異性，與其它顱內(nèi)感染性疾病尤其是結(jié)核性腦膜炎難以鑒別，誤診率高，確診只能依賴于病原菌的檢出。診斷新型隱球菌感染常用有三種方法，即墨汁染色顯微鏡鏡檢法、培養(yǎng)法和抗原

45、檢測(cè)法。印度墨汁染色鏡檢法敏感性差，陽(yáng)性檢出率約80%；腦脊液或血液培養(yǎng)法雖然屬于診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但陽(yáng)性檢出率約75%，培養(yǎng)（2-10天）及鑒定時(shí)間長(zhǎng)。莢膜多糖是新型隱球菌特有的分泌物，其分子組成與結(jié)構(gòu)區(qū)別于其他真菌和細(xì)菌，是隱球菌存在的直接證據(jù)。在感染的初期，莢膜多糖就能夠在血清、腦脊液、肺泡灌洗液和尿液中被檢測(cè)到，可作為隱球菌病早期診斷的標(biāo)志物。隨著病情的發(fā)展，莢膜多糖的含量會(huì)隨之發(fā)生變化，可作為病情監(jiān)測(cè)的指標(biāo)。莢膜多糖抗原檢測(cè)快速、簡(jiǎn)便，腦脊液和血清樣本抗原檢測(cè)的敏感性可達(dá)到97%和87%，能實(shí)現(xiàn)早期快速診斷。2. 莢膜多糖抗原陽(yáng)性能作為隱球菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)嗎？答：歐洲癌癥研究和治療組織和美國(guó)

46、真菌病研究組(EORTC/MSG)已經(jīng)把莢膜多糖作為診斷隱球菌病的標(biāo)準(zhǔn)之一。中國(guó)侵襲性真菌感染工作組經(jīng)反復(fù)討論，并參照歐洲癌癥研究和治療組織和美國(guó)真菌病研究組(EORTC/MSG)有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，同樣把血清/腦脊液中莢膜多糖陽(yáng)性作為診斷隱球菌病的標(biāo)準(zhǔn)。3. 莢膜多糖定量檢測(cè)有什么臨床意義？ 答：莢膜多糖定量測(cè)定具有診斷和預(yù)測(cè)價(jià)值?？乖男r(jià)往往與疾病的程度密切相關(guān)，定量檢測(cè)莢膜多糖濃度有助于判斷感染的嚴(yán)重程度或疾病的活動(dòng)程度。莢膜多糖含量的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)可作為病情轉(zhuǎn)歸、預(yù)后和療效評(píng)價(jià)指標(biāo)。患者莢膜多糖濃度降低表明治療有效，不降低說(shuō)明治療不充分。4. 哪些標(biāo)本可檢出莢膜多糖？答：血清、腦脊液、肺泡灌洗液和尿

47、液均可檢出莢膜多糖，但腦脊液敏感性高于血清和其它體液。5. 商品化的莢膜多糖抗原檢測(cè)試劑盒有哪些？ 答：目前，商品化的新型隱球菌莢膜多糖抗原檢測(cè)試劑盒國(guó)外產(chǎn)品有美國(guó)IMMY公司生產(chǎn)的LATEX-CRYPTOCOCCUS ANTIGEN DETECTION SYSTEM（乳膠凝集法）和CrAg Lateral Flow Assay（膠體金法）；伯樂(lè)（Bio-Rad）公司生產(chǎn)的PASTOREX® CRYPTO PLUS（乳膠凝集法）；國(guó)內(nèi)產(chǎn)品有天津貽諾琦（Bio-Enoche）生物工程有限公司（中美合資）生產(chǎn)的新型隱球菌莢膜多糖抗原檢測(cè)試劑盒（ELISA法）。6. 隱球菌莢膜多糖檢測(cè)試劑

48、盒原理？答：國(guó)外產(chǎn)品乳膠凝集法試劑盒原理：該檢測(cè)系統(tǒng)利用包被在乳膠顆粒中的抗隱球菌抗體與含有隱球菌莢膜多糖抗原的樣本發(fā)生凝集反應(yīng)，通過(guò)凝集顆粒的大小進(jìn)行定性分析。貽諾琦（Bio-Enoche）公司試劑盒（ELISA）原理：該試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)法， 先將莢膜多糖包被在酶標(biāo)板上，再加入待檢血清（或腦脊液）和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的莢膜多糖抗體，此時(shí)，待檢標(biāo)本中的莢膜多糖及莢膜多糖標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)板上的莢膜多糖競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合有限的抗體結(jié)合位點(diǎn)，再加入底物顯色，在酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定吸光度值，測(cè)定值和待檢抗原的濃度呈負(fù)相關(guān)，可根據(jù)莢膜多糖標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算待檢標(biāo)本中莢膜多糖的濃度。該試劑盒可進(jìn)行定量或定性分析

49、。 7. 各種莢膜多糖檢測(cè)技術(shù)敏感性如何？答：由于方法學(xué)不同，各種檢測(cè)技術(shù)的靈敏度不同，依次為ELISA法>膠體金法>乳膠凝集法，ELISA法檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.5ng/ml，腦脊液和血清樣本莢膜多糖抗原檢測(cè)的敏感性可達(dá)到97%和87%。莢膜多糖抗原檢出的敏感性與菌株的血清型有關(guān)，血清型A/B/D可在0.5ng/ml時(shí)就可檢出，而血清型C在25ng/ml時(shí)才能被檢測(cè)到。 8. 國(guó)產(chǎn)莢膜多糖ELISA試劑盒性能怎樣？答：上述國(guó)產(chǎn)莢膜多糖ELISA試劑盒分析靈敏度<0.5ng/ml；特異性達(dá)99%；測(cè)范圍為0.32-32 ng/ml；與美國(guó)IMMY公司新型隱球菌抗原檢測(cè)試劑盒（乳膠

50、凝集法）進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)（166例樣本），陽(yáng)性符合率86.67%，陰性符合率100%。9. 開(kāi)展甘露聚糖檢測(cè)需用什么儀器設(shè)備？答：需要使用的儀器包括：酶標(biāo)儀（450nm）、恒溫箱（37）、離心機(jī)、混旋器等。參考文獻(xiàn)1、Sulahian A，Touratier S，Ribaud PFalse positive test for aspergillus antigenemia related to concom itant adm inistration of piperacillinand tazobactamN Engl J Med，2003，349(24)：236623672、M. Machet

51、ti, M. J. Majabo, E. Furfaro,et al. Kinetics of galactomannan in surgical patients receiving perioperative piperacillin/tazobactam prophylaxis. Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2006) 58, 8068103、Tyler Warkentien, MD. An Update on Cryptococcosis Among HIV-Infected Persons. Int J STD AIDS. 2010 October ; 21(10): 679684.4、Clancy C J，Nguyen M L，Cheng S，et al.Immunoglobulin G responses