深部真菌感染的實驗室診斷

1、第十篇 商品試劑和設備第三章 深部真菌感染的實驗室診斷第一節(jié)：1-3-D-葡聚糖測定1、1-3-D-葡聚糖測定（G試驗）濁度法及顯色法檢測原理分別是什么？答：濁度法檢測原理:1,3-D-葡聚糖能特異性激活鱟試劑中的G因子，活化的G因子使凝固酶原轉變成凝固酶，凝固酶作用在凝固蛋白原上，通過酶切的作用，產(chǎn)生凝固蛋白，發(fā)生凝固反應，從而引起檢測溶液透光率變化，根據(jù)檢測被測溶液透光率變化對真菌1,3-D-葡聚糖濃度進行定量。 顯色法檢測原理：1,3-D-葡聚糖能特異性激活鱟試劑中的G因子，活化的G因子使凝固酶原轉變成凝固酶，凝固酶作用在顯色底物上，通過酶切的作用，將寡肽和顯色基團（PNA）分離，顯色基

2、團的量和1,3-D-葡聚糖的量呈正比，根據(jù)檢測其溶液吸光度變化對真菌1,3-D-葡聚糖濃度進行定量。2、G試驗顯色法檢測較濁度法有哪些優(yōu)勢？答：（1）有效的排除干擾，特異性明顯提高；（2）顯色基質使其靈敏度大為提高；（3）適用于血清標本的檢測。3、為什么同一份標本在不同實驗室檢測結果不一致？答：這與檢測系統(tǒng)有關。目前G試驗沒有行業(yè)標準，只有企業(yè)標準。而不同廠家設計生產(chǎn)的檢測系統(tǒng)（包括試劑和儀器）的性能不同，這里涉及到使用的標準品、試劑來源等 ，故檢測結果不具有可比性。4、G試驗結果提示病人有真菌感染，而真菌培養(yǎng)結果為陰性，如何解釋？答：這主要與培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法檢測的原理不同和對疾病診斷的窗口期

3、不同有關。真菌進入人體后，會在較短的時間內釋放出1,3-D-葡聚糖，因此，在感染早期就可能呈現(xiàn)陽性結果。而培養(yǎng)則需要細菌在體內有一定的增殖過程，因此在感染的高峰期培養(yǎng)陽性率高。有文獻報告血漿1,3-D-葡聚糖在侵襲性真菌感染癥狀出現(xiàn)前5天就可呈檢出。 方法學上講，內毒素和1,3-D-葡聚糖檢查多采用鱟試驗方法，具有簡便、快速、定量的特點，而培養(yǎng)則需要時間，細菌和真菌的體外生長需要一定的條件，如果條件（例如培養(yǎng)基、溫度、時間等） 如掌握不好，則難于培養(yǎng)成功。根據(jù)文獻報告，對侵襲性真菌感染的診斷，血漿1,3-D-葡聚糖的診斷特異度和敏感度均高于培養(yǎng)，其ROC曲線下面積（AUC）也大于培養(yǎng)方法。5、

4、血培養(yǎng)陽性，G實驗為什么是陰性？答: （1）病人存在吞噬細胞功能缺陷，如粒細胞缺乏癥等，真菌進入血液但是沒有被吞噬細胞處理，1,3-D-葡聚糖沒有釋放出來，或釋放的很少，故G試驗陰性。（2）進入血液內的真菌數(shù)量很少，1,3-D-葡聚糖釋放的很少，沒有達到G試驗檢測最低限。（3）使用了抑制1,3-D-葡聚糖釋放的抗真菌藥物，如棘白菌素類等。6、病人甲的臨床表現(xiàn)比病人乙的輕，可病人甲的檢測值比病人乙的檢測值高？答：這里有幾方面的問題。第一，病人免疫功能有差異。真菌進入人體后，需要在吞噬細胞作用下，才能將細胞壁上的1,3-D-葡聚糖釋放到血液或其他體液中，被檢測出來。如果病人吞噬細胞功能減低，真菌不

5、能被吞噬破壞，細胞壁上的1,3-D-葡聚糖不能釋放出來，也就無法檢測出來。這時病人病情可能更為嚴重。第二，疾病的不同階段，1,3-D-葡聚糖水平是有變化的。一般來說，隨著抗真菌藥物的治療，感染的控制，1,3-D-葡聚糖水平也會相應下降。因此，如果兩個病人處于疾病的不同階段，其檢測結果是不可比較的。此外，不同的真菌1,3-D-葡聚糖水平也不同。如念珠菌感染者血清1,3-D-葡聚糖平均值為755 p g/ mL ，曲霉感染者1,3-D-葡聚糖平均值為1 103 pg/ mL ，鐮刀霉感染者1,3-D-葡聚糖平均值為1 652 pg/ mL ，接合菌（毛霉、根霉） 細胞壁不產(chǎn)1,3-D-葡聚糖，感染

6、接合菌的患者血清1,3-D-葡聚糖值為0 ，隱球菌細胞壁外有莢膜包裹，因此不易檢測到細胞壁上的抗原，但是在一定條件下莢膜自身可釋放出極微量的1,3-D-葡聚糖到血清中，所以檢測值可大于0，但仍小于陽性判斷標準。而對于口腔和其他器官的真菌定植患者，1,3-D-葡聚糖值也較低，一般不超過20 pg/ mL（或者其他檢測熱體系的陽性診斷值）。7、G試驗為什么要強調連續(xù)檢測？答：1,3-D-葡聚糖水平是隨著疾病過程而變化的。因此，在感染的最早期，細菌或真菌剛剛進入人體，數(shù)量較少，因此檢測不出來?；蛘哂捎诓∪藱C體免疫功能的變化，1,3-D-葡聚糖的產(chǎn)生速度和量也有變化，或者由于某些干擾因素存在造成假陽性

7、或假陰性結果。因此，不能只靠一次檢測結果就判定有無感染，我國許多侵襲性真菌感染診斷標準中都要求次檢測結果均大于診斷值才有診斷意義。此外，檢測應覆蓋整個疾病過程，特別是在疾病早期更應重視連續(xù)檢測，以免出現(xiàn)漏診或誤診。8、為什么G試驗的重復性不理想？答：1,3-D-葡聚糖自身一些理化性質就可以影響G試驗。反應易受葡聚糖的分子量、分支度，特別受到三維結構的影響。發(fā)現(xiàn)平均分子量在之間的1,3-D-葡聚糖，隨其分子量增加和分支度減少，激活G因子的能力越強；分子量在6.75-27.50 kDa之間的1,3-D-葡聚糖的裂褶菌多糖對G因子的級聯(lián)反應有抑制作用。Aketagawa等發(fā)現(xiàn)單股螺旋的1,3-D-葡

8、聚糖在G因子反應中起著決定性作用；Nagi等在研究試驗條件時發(fā)現(xiàn)三股螺旋的1,3-D-葡聚糖不與G因子反應。故該法測定之前常用NaOH對1,3-D-葡聚糖進行預處理，使其轉化為單股螺旋的1,3-D-葡聚糖，已減少實驗誤差。會不會真菌釋放的1,3-D-葡聚糖發(fā)生上述變化，尚不清楚。不同批號的鱟試劑標示值相同，但試驗結果不盡相同，尤其是接近失效者的靈敏度有明顯下降的趨勢。所以在更換批號或者用接近失效期鱟試劑的時候，應對靈敏度進行復核，以確定本批鱟試劑的實際靈敏度。9、哪些抗菌藥物對G試驗有正干擾現(xiàn)象？答：文獻報告磺胺類、阿莫西林/克拉維酸、頭孢類藥物藥物可造成假陽性。頭孢菌素類中可能涉及頭孢哌酮鈉

9、、頭孢美唑鈉、頭孢米諾、頭孢西丁、頭孢噻肟鈉、頭孢噻肟和頭孢哌酮/舒巴坦鈉。此外厄他培南也可能造成假陽性，具體機制尚不清楚。哌拉西林/他唑巴坦尚不清楚有無干擾，但對半乳甘露聚糖（GM）試驗有正干擾。10、患者使用可引起假陽性的血液制品，含真菌成分的抗腫瘤藥物或者透析治療及手術后多長時間檢查G試驗可避免假陽性？答：血液制品中白蛋白和免疫球蛋白可激活 G 因子途徑，對G試驗影響很大。文獻報告，靜脈輸入IgG 10g可使血漿濃度升高達300pg/mL以上，這足以誤診為侵襲性真菌感染（IFI）。血漿的平均半衰期為20（）h ，推斷在1周后復查1,3-D-葡聚糖濃度應明顯下降或轉陰，可作為與IFI的鑒別

10、。 這與上述物質的代謝有關，抗菌素一般48小時后上述物質代謝完成或排出體外，但是血漿制品，包括白蛋白代謝半衰期較長，一般需要停用10天左右再查合適。11、某些細菌的敗血癥也可引起G試驗出現(xiàn)假陽性，能具體說明嗎?答：文獻報告某些細菌敗血病患者，例如鏈球菌敗血癥，綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌細胞膜的一些可溶性抗原可造成G試驗假陽性。敗血癥患者，特別合并全身炎癥反應綜合征的病人，由于機體內產(chǎn)生許多炎癥因子，如IL-6和IL-8，這些炎癥因子可參與試驗過程，引起假陽性結果。文獻報道，在重癥監(jiān)護病房住院時間超過14天的患者多伴有不同程度血漿1,3-D-葡聚糖濃度升高，而這些患者并不一定為IFI；某些細菌感染

11、，如金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌感染以及凝固酶陰性的葡萄球菌膿毒癥時可能出現(xiàn)G試驗假陽性結果。甚至部分支原體、EB病毒感染患兒G試驗亦呈陽性，但多為輕度升高，且7天后復查多已轉陰性，考慮可能與感染本身。 12、抗真菌藥物對G試驗檢測結果有什麼影響？答：抗真菌藥物治療后真菌生長受到抑制，這是明確的。但是由于藥物作用機理不同，對G試驗結果不完全一致。例如，兩性霉素B脂質體能夠作用于真菌細胞壁成分甘露聚糖和甘露聚糖蛋白質復合體使之結構不穩(wěn)定以致胞壁破壞，可能造成1,3-D-葡聚糖值一過性增高 。而卡泊芬靜為葡聚糖合成酶抑制劑，非競爭性地抑制真菌細胞壁的1,3-D-葡聚糖的合成，可以造成假陰性結果。13

12、、G試驗質控時，直接使用廠家提供的均值和標準差是否合適？答：不能。這是因為廠家和用戶使用的試驗條件不同。廠家提供的質控品的定值不能作為質控中的均值，必須按照質控規(guī)范在自己的檢測系統(tǒng)和試驗條件下重新測定。標準差也是如此。14、為什么質控品必須和試劑同一批號？答：這是G試驗的一個特點。因為每批生產(chǎn)的試劑敏感度不同，取決于每批試劑中主試劑（鱟血中G因子）活性?；钚圆煌?，1,3-D-葡聚糖對它的反應結果不同。而質控數(shù)據(jù)是建立在具體反應體系上的，不同批號間的質控數(shù)據(jù)是有差異的。15、標準曲線能不能代替質控品？答：可以，不過每天都要做標準曲線，以確保當天檢測結果正確可靠。但是，要特別提醒用戶，不能使用公司

13、提供的標準曲線，一定要用戶自己做標曲。16、為什么質控數(shù)據(jù)在控，而病人的測定結果仍有問題？答：這要看用戶在建立最初質控數(shù)據(jù)時是否先做了標準曲線（也就是定標）。如果用戶沒有定標就進行20個質控數(shù)據(jù)的測定，那些數(shù)據(jù)很可能不正確。無論是標準曲線，還是質控數(shù)據(jù)，還是病人樣本的檢測都與試劑有關。試劑有變化，其他結果也會隨之變化。所以，試劑更換批號，標準曲線和質控數(shù)據(jù)都要重新建立。17、當日一批試驗結果中出現(xiàn)數(shù)個結果與臨床診斷不符合，如何解決？答：（1）觀察當日質控結果是否失控？（2）檢查操作過程有無差錯？（3）檢查試劑有無過期或變質？是否使用不同批號的試劑？（4）檢查標準曲線是否合格？（5）了解病人采樣

14、時的臨床背景，如病程、是否使用抗真菌藥物治療等。（6）找廠家工程師檢查。18、有沒有真菌1,3-D-葡聚糖檢測的免疫學方法?答:-半乳糖神經(jīng)酰胺可高親和地與1,3-D-葡聚糖結合。Donald等依次建立一種以-半乳糖神經(jīng)酰胺包被物，鼠抗1,3-D-葡聚糖單克隆抗體的酶聯(lián)免疫吸附檢測系統(tǒng)，特異性檢測生物體液中1,3-D-葡聚糖。發(fā)現(xiàn)1,3-D-葡聚糖含量低于0.8ng/mL時線性良好，并具有良好的回收率，相對于鱟試驗受干擾物質影響更小，同樣具有較高的精密度和準確度。但本法尚無分子量、分支度及三維構型對檢測結果影響的報告。此外，鼠抗1,3-D-葡聚糖單克隆抗體是否能廣譜識別各種真菌1,3-D-葡聚

15、糖還需要進一步驗證。第二節(jié)：念珠菌抗原和抗體測定一、念珠菌抗原測定1. 可用于檢測的念珠菌病相關抗原有哪些？答：念珠菌病相關的血清學檢測主要通過檢測患者血液循環(huán)中的各類抗原：如甘露聚糖（mannan）、1-3-D葡聚糖、細胞質烯醇化酶（Eno）、磷酸甘油酸酯激酶（Pgk1p）、熱休克蛋白(HSP90)以及蛋氨酸合酶（ Met6p ）等。其中，甘露聚糖是目前研究最為廣泛的一種真菌血清抗原。2. 為什么甘露聚糖可用于侵襲性念珠菌病的檢測？答：甘露糖是目前研究最為廣泛的一種真菌血清抗原,它對熱穩(wěn)定,廣泛存在于真菌胞壁中,是真菌胞壁的重要組成成分,甘露糖在不同真菌中的含量和作用不是恒定不變的,常常受周

16、圍環(huán)境的營養(yǎng)狀態(tài)和細胞形態(tài)的影響。其在真菌致病過程中參與了免疫調節(jié)、防御，而且抗甘露糖抗體具有保護性作用。酵母菌中導致侵襲性感染者主要為念珠菌屬，少數(shù)為新生隱球菌，當念珠菌感染時，甘露聚糖會被釋放入血，故可進行血液檢測。而隱球菌的厚莢膜使細胞壁上的甘露聚糖難以釋放人血而不易測得，所以血漿中甘露聚糖抗原陽性與侵襲性念珠菌感染有高度相關性，可用于早期診斷侵襲性念珠菌感染。3. 為什么檢測甘露聚糖可用于侵襲性念珠菌病早期診斷？答：念珠菌免疫學檢測技術在靈敏度和特異性方面都較組織病理學、念珠菌培養(yǎng)、直接鏡檢和影像學檢查有明顯的優(yōu)勢，抗原檢測陽性要早于念珠菌培養(yǎng)陽性，敏感性達80%以上，正逐漸成為念珠菌

17、檢測的常用方法。在國內外侵襲性真菌感染的診斷標準中，均認為血清念珠菌抗原陽性可作為微生物學診斷標準，因此測定血清中的甘露聚糖有助于侵襲性念珠菌病的早期診斷、早期治療。4. 目前，念珠菌病相關抗原檢測有商品化的試劑嗎？答：以上提到的甘露聚糖（mannan）、1-3-D葡聚糖、細胞質烯醇化酶（Eno）、磷酸甘油酸酯激酶（Pgk1p）、熱休克蛋白(HSP90)以及蛋氨酸合酶（Met6p ）等念珠菌相關抗原中，只有1-3-D葡聚糖（G試驗）和甘露聚糖檢測有商品化試劑提供，其它相關抗原目前僅限于科研。5. 商品化的念珠菌甘露聚糖抗原檢測試劑盒有哪些？答：目前，商品化的念珠菌甘露聚糖抗原檢測試劑盒極少，國

18、外產(chǎn)品只有伯樂（Bio-Rad）公司生產(chǎn)的PLATELIA Candida試劑盒；國內產(chǎn)品只有天津貽諾琦（Bio-Enoche）生物工程有限公司（中美合資）生產(chǎn)的念珠菌甘露聚糖抗原檢測試劑盒。6. 念珠菌甘露聚糖檢測試劑盒原理？答：伯樂（Bio-Rad）公司Platelia Candida試劑盒原理：該試劑盒采用雙抗體夾心一步法，待檢血清（或血漿）中的甘露聚糖或標準品與包被在酶標板上的鼠單抗（捕獲抗體）及辣根過氧化物酶標記的鼠單抗（檢測抗體）形成抗體-抗原-抗體復合物，再加入底物顯色，在酶標儀450nm處測定吸光度值，測定值和待檢抗原的濃度呈正相關，根據(jù)甘露聚糖標準品繪制標準曲線并計算待檢標本

19、中甘露聚糖的濃度（pg/ml）。該試劑盒可進行定性或定量分析。貽諾琦（Bio-Enoche）公司試劑盒原理：該試劑盒采用競爭法， 先將甘露聚糖包被在酶標板上，再加入待檢血清（或血漿）和辣根過氧化物酶標記的甘露聚糖抗體，此時，待檢標本中的甘露聚糖及甘露聚糖標準品與酶標板上的甘露聚糖競爭性結合有限的抗體結合位點，再加入底物顯色，在酶標儀450nm處測定吸光度值，測定值和待檢抗原的濃度呈負相關，可根據(jù)甘露聚糖標準品繪制標準曲線并計算待檢標本中甘露聚糖的濃度（pg/ml）。該試劑盒可進行定性或定量分析。7. 念珠菌甘露聚糖檢測試劑盒可檢測什么標本？答：可檢測血清或血漿標本。8. 待檢標本為什么需要預處

20、理？答：血清或血漿標本均需要預處理。標本與處理液混合后加熱，可以：（1）將標本中的抗原-抗體復合物解離，有利于抗原檢測。（2）將標本中的蛋白質變性并沉淀，減少其對免疫測定的干擾。9. 標本如何進行預處理？答：在離心管中加300µL待檢血清或血漿，再加入100µL樣本處理液，漩渦震蕩10秒混勻，將離心管放入水浴鍋內100加熱90秒后10000g離心10分鐘，取上清即可進行檢測。10. 如何保證甘露聚糖試劑盒檢測的可靠性？答：為保證實驗的準確性、可靠性和減少系統(tǒng)誤差，每次實驗都必須做標準曲線和質控品，并在標準曲線r>0.98以上和質控品不失控的前提下才能進行數(shù)據(jù)分析。11

21、. 開展甘露聚糖檢測需用什么儀器設備？答：需要使用的儀器包括：酶標儀（450nm）、恒溫箱（37）、離心機、水浴鍋、混旋器等。二、念珠菌抗體測定1. 念珠菌抗體檢測有什么臨床意義？答：過去人們并不看好真菌抗體檢測在診斷中的作用，但是近年來的研究表明，抗體檢測在以下方面具有重要臨床意義：（1）區(qū)分真菌感染與定植。（2）免疫缺陷的患者仍可以產(chǎn)生達到診斷水平的抗體濃度。（3）真菌感染有一個相對較長的潛伏期，抗體的檢測能滿足臨床對診斷時間窗的要求。（4）抗原和抗體聯(lián)合檢測可提高臨床診斷的敏感性和特異性。2. 為什么檢測抗體可以區(qū)分念珠菌感染與定植？答：定植者抗體水平很低，而感染者抗體水平明顯增高，完全

22、可以通過臨界值加以區(qū)分。特別是選擇那些只有在侵襲性感染時才釋放出來的優(yōu)勢抗原，就可以避免定植所引起的假陽性。Fasahat F Alam等分別對32例念珠菌培養(yǎng)陽性患者、51例臨床疑似念珠菌感染患者、10例念珠菌定植者和16例健康人進行念珠菌甘露聚糖抗體檢測，結果顯示念珠菌培養(yǎng)陽性和臨床疑似念珠菌感染者抗體陽性率和抗體效價均較高，而念珠菌定植者抗體陽性率和抗體效價均較低，健康人抗體均陰性。該研究提示，可以建立適當?shù)目贵w臨界值將念珠菌感染和定植加以區(qū)分。3. 免疫缺陷的患者能檢測到念珠菌抗體嗎？答：抗體產(chǎn)生依賴于正常的免疫機能，而IFI患者多處于免疫缺陷狀態(tài)，無法正常產(chǎn)生抗體，或產(chǎn)生遲緩。200

23、6 年Pitarch 等將白念珠菌細胞壁成分用二維電泳技術分離，進行免疫蛋白質組學研究，用侵襲性念珠菌病人血清和對照血清分別與之反應，篩選出與患者血清發(fā)生強烈反應的免疫優(yōu)勢抗原。這些抗原主要有: 烯醇化酶（ Eno）、磷酸甘油酸酯激酶（Pgk1p）、蛋氨酸合酶（ Met6p ）、-1，3葡萄糖基轉移酶（ Bgl2p）和果糖二磷酸醛縮酶（ Fba1）。IC 患者可能產(chǎn)生針對這些抗原的抗體，甚至是嚴重的免疫抑制患者如肝移植、干細胞移植和HIV 患者也可產(chǎn)生這些抗體。 4. 念珠菌抗體檢測適用于侵襲性念珠菌病早期診斷嗎？答：Yera等的研究表明，有73%的侵襲性念珠菌?。╥nvasive candi

24、diasis，IC）患者至少可以早于血培養(yǎng)陽性結果2天檢出抗體，最多可早于15天，平均為7天。 近年來的研究顯示: 念珠菌在黏膜定植時可能已有部分細胞壁抗原暴露于宿主免疫系統(tǒng)。當發(fā)生IC 時，機體產(chǎn)生免疫記憶反應，表現(xiàn)出相對早期IgG的反應，并優(yōu)于IgM。而IgM 升高的血清抗體其抗原是念珠菌胞漿內抗原，在定植共生狀態(tài)下，可能極少暴露于機體體液免疫系統(tǒng)。當發(fā)生IC時，免疫受損患者表現(xiàn)出與免疫正常患者類似的血清學反應，IgG 早期升高，說明血清抗體檢測同樣也適用于免疫受損患者早期診斷念珠菌病。并且隨著抗真菌藥物治療，IgG水平下降。所以，檢測IgG也不失為一種療效觀察的方法。 5. 為什么念珠菌

25、抗原和抗體聯(lián)合檢測可提高臨床診斷敏感性和特異性？答：甘露聚糖在機體內能被降解，因此抗甘露聚糖抗體的檢測可以彌補甘露聚糖檢測的局限性，尤其是抗體和甘露聚糖聯(lián)合檢測，可以大大提高診斷的敏感性和特異性。Fasahat F Alam等對31例感染念珠菌的患者進行研究發(fā)現(xiàn)，檢測念珠菌甘露聚糖敏感性為41%；甘露聚糖抗體敏感性為47%；甘露聚糖和甘露聚糖抗體聯(lián)合檢測，敏感性可顯著提高至75%。國外另一項研究發(fā)現(xiàn)，檢測念珠菌甘露聚糖敏感性為58%，特異性為93%；甘露聚糖抗體敏感性為59%，特異性為83%；甘露聚糖和甘露聚糖抗體聯(lián)合檢測，敏感性可達83%，特異性為86%。6. 抗原和抗體聯(lián)合檢測的優(yōu)勢是什么

26、？答：鑒于侵襲性真菌感染的隱蔽性和發(fā)病的特點，建議在使用實驗室手段進行侵襲性真菌感染診斷時應采取多種方法的聯(lián)合檢驗，強調真菌培養(yǎng)和非培養(yǎng)技術的結合，各種非培養(yǎng)技術之間的聯(lián)合。例如，抗原抗體聯(lián)合檢測。抗原和抗體的聯(lián)合檢驗的優(yōu)勢：（1）優(yōu)勢互補，提高檢測的敏感性和特異性。（2）能更準確地反映感染程度及階段。（3）用藥前后抗原抗體的檢測值變化可為臨床用藥的評價提供依據(jù)，有利于疾病的預后。7. 怎樣設計念珠菌抗原抗體聯(lián)合檢測方案？答：可參考如下方案8. 怎樣分析真菌抗原和抗體聯(lián)合檢測結果？答：真菌抗原和抗體聯(lián)合檢測結果分析見表3-1，僅供參考。表3-1 抗原、抗體聯(lián)合檢測結果判定 抗原 抗體 臨床分析

27、 + + 侵襲性真菌感染 + - 早期感染/未產(chǎn)生抗體或免疫力低下/無抗體產(chǎn)生 - + 感染一段時間/抗原可能分解/抗原被抗體中和 - - 無侵襲性真菌感染9. 商品化的念珠菌抗體檢測試劑盒有哪些？答：商品化的念珠菌抗體檢測試劑盒，國外產(chǎn)品有伯樂（Bio-Rad）公司生產(chǎn)的Platelia Candida Ab-Ac-Ak抗體檢測試劑盒，德國Virion Serion公司生產(chǎn)的IgA、IgM、IgG抗體檢測試劑盒，美國IBL公司生產(chǎn)的IgA、IgM、IgG抗體檢測試劑盒；國內產(chǎn)品有天津貽諾琦（Bio-Enoche）生物工程有限公司（中美合資）生產(chǎn)的念珠菌IgM、IgG抗體檢測試劑盒（ELISA

28、）。10. 念珠菌抗體檢測試劑盒原理？答：念珠菌IgM、IgG抗體檢測試劑盒（ELISA）原理相同，均采用ELISA間接法。將預處理后的患者血清（或血漿）樣本加到包被有念珠菌抗原的酶標板中，血清（或血漿）中的念珠菌IgM或IgG抗體與固相抗原結合，再加入抗人IgM酶標抗體或抗人IgG酶標抗體，形成抗原-抗體-酶標抗體復合物，最后加四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物產(chǎn)生顯色反應，用酶標儀在450nm波長下測定其吸光度，吸光度值與待測物濃度成正比，通過標準曲線對樣本中念珠菌IgM或IgG抗體濃度進行定量分析。11. 國產(chǎn)念珠菌IgM、IgG抗體檢測試劑盒性能指標？答：上述國產(chǎn)念珠菌IgM、IgG抗體檢測試

29、劑盒分析靈敏度為31.25AU/mL；特異性均大于90%；測范圍均為31.25500AU/mL；與德國Virion Serion公司IgM、IgG抗體檢測試劑盒總體符合率分別為80.9%（36例對比）和71.4%（35例對比）。12. 念珠菌IgM抗體檢測為什么樣本需要預處理？答：樣本處理的目的是去除類風濕因子的干擾。類風濕因子是一種以變性IgG為抗原的自身抗體，主要為IgM型。進行IgM抗體檢測時，它的存在會導致假陽性結果。此外，結合力強的病原體特異性IgG抗體也可能取代結合力弱的病原體特異性IgM抗體與抗原結合，造成IgM檢測假陰性結果的出現(xiàn)。因此，進行白色念珠菌IgM抗體檢測前需用類風濕

30、因子吸附劑吸附掉血清中可能存在的類風濕因子。13. 為什么念珠菌IgM、IgG抗體檢測濃度單位是AU/ml？答：目前，尚無念珠菌IgM和IgG的國際標準品和國家標準品，根據(jù)1995年國際純粹與應用化學聯(lián)合會（IUPAC）和國際臨床化學和實驗室醫(yī)學聯(lián)盟（IFCC）推薦的“臨床實驗室物質特性和單位命名規(guī)則”（PROPERTIES AND UNITS IN THE CLINIC LABORATORY SCIENCES I. SYNTAX AND SEMANTIC RULES），使用AU/ml（arbitrary unit）作為濃度單位（該單位不是國際統(tǒng)一單位）。14. 開展念珠菌抗體檢測需用什么儀器

31、設備？答：需要使用的儀器包括：酶標儀（450nm）、恒溫箱（37）、離心機、混旋器等。第三節(jié) 曲霉菌抗原和抗體測定一、曲霉菌抗原測定1. 為什么檢測半乳甘露聚糖可用于侵襲性曲霉菌?。↖A）的早期診斷？答：半乳甘露聚糖（galacto-mannan，GM）是曲霉細胞壁上的一種多聚抗原，其中具有免疫反應性的是呋喃半乳糖，菌絲生長時能從薄弱的菌絲頂端釋放，是最早釋放的真菌抗原。GM釋放量與菌量成正比，可以反映感染程度。GM在感染后24小時（感染早期）即可檢測到，與病情嚴重程度一致。有2/3的患者在臨床癥狀和影像學出現(xiàn)異?；蚱渌\斷方法陽性之前6-14天即可檢測到GM，對高?；颊哌B續(xù)動態(tài)監(jiān)測（每周2次

32、）具有早期診斷價值。GM試驗可用于曲霉菌感染早期診斷的篩查指標。歐洲癌癥研究和治療組織和美國真菌病研究組(EORTC/MSG)已經(jīng)把半乳甘露聚糖（GM）作為診斷曲霉病的標準之一。中國侵襲性真菌感染工作組經(jīng)反復討論，并參照歐洲癌癥研究和治療組織和美國真菌病研究組(EORTC/MSG)有關標準，同樣把血清中半乳甘露聚糖（GM）陽性作為診斷曲霉病的標準。2. 半乳甘露聚糖檢測還有什么臨床意義？ 答：國內外的薈萃分析結果表明，其診斷的靈敏度和特異性均高達90%左右?；颊哐逯蠫M含量與感染程度相關，動態(tài)監(jiān)測血清GM水平的變化可作為病情轉歸和療效評價指標。在治療期間，病人GM持續(xù)陽性或保持較高水平則預后

33、差，GM抗原清除早的病人預后好。但是對非粒缺患者的診斷價值尚有爭議。3. G試驗和GM試驗聯(lián)合檢測可提高IA診斷準確率？答： GM試驗和G試驗發(fā)生假陽性的人群不同。GM 試驗在巨細胞病毒血癥、銅綠假單胞菌和化療后金葡菌和表葡菌感染者血清中會出現(xiàn)假陽性，但這些患者G試驗則為陰性；而出現(xiàn)G試驗假陽性的白念珠菌定植者GM 試驗則為陰性。因此，當兩者都出現(xiàn)陽性時可以基本診斷IA，兩者聯(lián)合使用可最大程度地降低假陽性率。另有學者研究發(fā)現(xiàn)單獨GM試驗靈敏度為70%，特異性為84%；單獨G試驗靈敏度為50%，特異性為92%。GM試驗和G試驗二者聯(lián)合試驗時，其靈敏度和特異性分別為93%和78%。GM試驗和G試驗

34、均對侵襲性真菌病具有診斷價值，二者聯(lián)合應用使其應用價值進一步提高。4. 商品化的半乳甘露聚糖抗原檢測試劑盒有哪些？ 答：目前，商品化的曲霉菌半乳甘露聚糖抗原檢測試劑盒較少，國外產(chǎn)品有伯樂（Bio-Rad）公司生產(chǎn)的PLATELIA ASPERGILLUS EIA試劑盒；國內產(chǎn)品只有天津貽諾琦（Bio-Enoche）生物工程有限公司（中美合資）生產(chǎn)的曲霉菌半乳甘露聚糖抗原檢測試劑盒。5. 曲霉菌半乳甘露聚糖檢測試劑盒原理？答：伯樂（Bio-Rad）公司PLATELIA ASPERGILLUS EIA試劑盒原理：該試劑盒采用一步夾心法，待檢血清（或血漿）中的半乳甘露聚糖與包被在酶標板上的鼠單抗（捕

35、獲抗體）及辣根過氧化物酶標記的鼠單抗（檢測抗體）形成抗體-抗原-抗體復合物，再加入底物顯色，在酶標儀450nm處測定吸光度值，測定值和待檢抗原的濃度呈正相關，以臨界值（Cutoff）對待檢標本中是否含有半乳甘露聚糖進行定性分析。貽諾琦（Bio-Enoche）公司試劑盒原理：該試劑盒采用競爭法， 先將半乳甘露聚糖包被在酶標板上，再加入待檢血清（或血漿）和辣根過氧化物酶標記的半乳甘露聚糖抗體，此時，待檢標本中的半乳甘露聚糖及半乳甘露聚糖標準品與酶標板上的半乳甘露聚糖競爭性結合有限的抗體結合位點，再加入底物顯色，在酶標儀450nm處測定吸光度值，測定值和待檢抗原的濃度呈負相關，可根據(jù)半乳甘露聚糖標準

36、品繪制標準曲線并計算待檢標本中半乳甘露聚糖的濃度。該試劑盒可進行定量或定性分析。 6. 半乳甘露聚糖定量檢測有什么臨床意義？答：半乳甘露聚糖定量檢測試劑盒與定性試劑盒相比不但可以進行定性分析，還可對半乳甘露聚糖精確定量，有利于判斷患者侵襲性曲霉感染的嚴重程度。此外，半乳甘露聚糖含量的動態(tài)監(jiān)測在抗真菌藥物療效觀察、停藥時機的選擇及預后等方面有重要臨床意義。7. 國產(chǎn)半乳甘露聚糖ELISA試劑盒性能指標如何？答：上述國產(chǎn)半乳甘露聚糖ELISA試劑盒分析靈敏度0.1ng/ml；特異性達89%；測范圍為0.1-10ng/ml；與Bio-Rad公司PLATELIA ASPERGILLUS EIA檢測試劑

37、盒進行對比試驗（109例樣本），陽性符合率91.4%，陰性符合率85.2%。8. 哪些標本可用于半乳甘露聚糖檢測？答：標本可以是血清、尿液、腦脊液及肺泡灌洗液（BAL）等，但敏感性和特異性有所不同。9. 待檢標本為什么需要預處理？答：血清或血漿標本均需要預處理。標本與處理液混合后加熱，可以：（1）將標本中的抗原-抗體復合物解離，有利于抗原檢測。（2）將標本中的蛋白質變性并沉淀，減少其對免疫測定的干擾。10. 標本如何進行預處理？答：在離心管中加300µL待檢血清或血漿，再加入100µL樣本處理液，漩渦震蕩10秒混勻，將離心管放入水浴鍋內100加熱90秒后10000g離心10

38、分鐘，取上清即可進行檢測。11. 半乳甘露聚糖檢測試劑盒需要做標準曲線和質控嗎？答：為消除系統(tǒng)誤差和保證實驗的準確性、可靠性，每次實驗都必須做標準曲線和陰性、陽性質控，并在質控品不失控的前提下才能進行數(shù)據(jù)分析。12. 哪些因素可造成半乳甘露聚糖檢測假陽性？答：抗菌藥物如哌拉西林、他唑巴坦、阿莫西林、克拉維酸等與GM有交叉反應，因此在接受這些藥物治療的患者中試驗的特異性可能會下降。GM試驗的假陽性率為10%-15%，一般在以乳制品為主食的嬰幼兒、異體骨髓移植患者、菌血癥患者、自身抗體陽性及使用半合成青霉素的患者中較易出現(xiàn)。13. 半乳甘露聚糖檢測的局限性？ 答：GM檢測對中性粒細胞減少患者感染曲

39、霉的診斷價值較高，但對兒童、腫瘤及ICU 危重患者、中性粒細胞不減少或減少不嚴重的其他IA 高危人群診斷價值有限。對此現(xiàn)象的解釋是由于中性粒細胞能吞噬并快速殺傷菌絲，使體內真菌載量降低，從而使釋放入血液的GM 減少而難以檢出。14. 開展GM檢測需用什么儀器設備？答：需要使用的儀器包括：酶標儀（450nm）、恒溫箱（37）、離心機、水浴鍋、混旋器等。二、曲霉菌抗體測定1. 曲霉菌抗體檢測臨床意義？答：曲霉抗體的研究沒有念珠菌抗體那么廣泛和深入。Latgé 等研究小組報道，約1/2的IA 患者產(chǎn)生曲霉特異性抗體。Sambatakou 等進一步證明，抗體測定對非中性粒細胞減少的亞急性侵襲

40、性曲霉病（invasive aspergillosis，IA）患者是最好的無創(chuàng)診斷方法。Kappe R等研究發(fā)現(xiàn)，總體大約23%的侵襲性曲霉感染患者曲霉抗體檢測呈陽性，免疫力低下的病人在用藥有效后10.8天左右能檢測到抗體產(chǎn)生?？贵w檢測尤其是ELISA法IgG抗體檢測對臨床診斷的確認和臨床用藥的評價有著十分重要的意義。2. 商品化的曲霉菌抗體檢測試劑盒有哪些？答：商品化的曲霉菌抗體檢測試劑盒，國外產(chǎn)品有伯樂（Bio-Rad）公司生產(chǎn)的Platelia Aspergullus IgG抗體檢測試劑盒，德國Virion Serion公司生產(chǎn)的IgA、IgM、IgG抗體檢測試劑盒，美國IBL公司生產(chǎn)的

41、IgA、IgM、IgG抗體檢測試劑盒；國內產(chǎn)品有天津貽諾琦（Bio-Enoche）生物工程有限公司（中美合資）生產(chǎn)的曲霉菌IgM、IgG抗體檢測試劑盒（ELISA）。3. 曲霉菌抗體檢測試劑盒原理？答：曲霉菌IgM、IgG抗體檢測試劑盒（ELISA）原理相同，均采用ELISA間接法。將預處理后的患者血清（或血漿）樣本加到包被有曲霉菌抗原的酶標板中，血清（或血漿）中的曲霉菌IgM或IgG抗體與固相抗原結合，再加入抗人IgM酶標抗體或抗人IgG酶標抗體，形成抗原-抗體-酶標抗體復合物，最后加四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物產(chǎn)生顯色反應，用酶標儀在450nm波長下測定其吸光度，吸光度值與待測物濃度成正比，

42、通過標準曲線對樣本中曲霉菌IgM或IgG抗體濃度進行定量分析。4. 國產(chǎn)曲霉菌IgM、IgG抗體檢測試劑盒性能指標？答：上述國產(chǎn)曲霉菌IgM、IgG抗體檢測試劑盒分析靈敏度分別為8 AU/mL、31.25AU/mL；特異性均大于90%；測范圍分別為864AU/mL、 31.25500AU/mL；與德國Virion Serion公司IgM抗體檢測試劑盒總體符合率為96.8%（31例對比）。5. 曲霉菌IgM抗體檢測為什么樣本需要預處理？答：樣本處理的目的是去除類風濕因子的干擾。類風濕因子是一種以變性IgG為抗原的自身抗體，主要為IgM型。進行IgM抗體檢測時，它的存在會導致假陽性結果。此外，結合

43、力強的病原體特異性IgG抗體也可能取代結合力弱的病原體特異性IgM抗體與抗原結合，造成IgM檢測假陰性結果的出現(xiàn)。因此，進行曲霉菌IgM抗體檢測前需用類風濕因子吸附劑吸附掉血清中可能存在的類風濕因子。6. 為什么曲霉菌IgM、IgG抗體檢測濃度單位是AU/ml？答：目前，尚無曲霉菌IgM和IgG的國際標準品和國家標準品，根據(jù)1995年國際純粹與應用化學聯(lián)合會（IUPAC）和國際臨床化學和實驗室醫(yī)學聯(lián)盟（IFCC）推薦的“臨床實驗室物質特性和單位命名規(guī)則”（PROPERTIES AND UNITS IN THE CLINIC LABORATORY SCIENCES I. SYNTAX AND S

44、EMANTIC RULES），使用AU/ml（arbitrary unit）作為濃度單位（該單位不是國際統(tǒng)一單位）。7. 開展曲霉抗體檢測需用什么儀器設備？答：需要使用的儀器包括：酶標儀（450nm）、恒溫箱（37）、離心機、混旋器等。8. 曲霉菌抗原抗體聯(lián)合檢測方案是什么？答：可參考如下方案第四節(jié) 新型隱球菌抗原測定1. 莢膜多糖抗原檢測用于診斷隱球菌感染的優(yōu)勢？ 答：新型隱球菌臨床表現(xiàn)、腦脊液常規(guī)、生化檢測及頭顱影像學檢查均缺乏特異性，與其它顱內感染性疾病尤其是結核性腦膜炎難以鑒別，誤診率高，確診只能依賴于病原菌的檢出。診斷新型隱球菌感染常用有三種方法，即墨汁染色顯微鏡鏡檢法、培養(yǎng)法和抗原

45、檢測法。印度墨汁染色鏡檢法敏感性差，陽性檢出率約80%；腦脊液或血液培養(yǎng)法雖然屬于診斷的金標準，但陽性檢出率約75%，培養(yǎng)（2-10天）及鑒定時間長。莢膜多糖是新型隱球菌特有的分泌物，其分子組成與結構區(qū)別于其他真菌和細菌，是隱球菌存在的直接證據(jù)。在感染的初期，莢膜多糖就能夠在血清、腦脊液、肺泡灌洗液和尿液中被檢測到，可作為隱球菌病早期診斷的標志物。隨著病情的發(fā)展，莢膜多糖的含量會隨之發(fā)生變化，可作為病情監(jiān)測的指標。莢膜多糖抗原檢測快速、簡便，腦脊液和血清樣本抗原檢測的敏感性可達到97%和87%，能實現(xiàn)早期快速診斷。2. 莢膜多糖抗原陽性能作為隱球菌病診斷標準嗎？答：歐洲癌癥研究和治療組織和美國

46、真菌病研究組(EORTC/MSG)已經(jīng)把莢膜多糖作為診斷隱球菌病的標準之一。中國侵襲性真菌感染工作組經(jīng)反復討論，并參照歐洲癌癥研究和治療組織和美國真菌病研究組(EORTC/MSG)有關標準，同樣把血清/腦脊液中莢膜多糖陽性作為診斷隱球菌病的標準。3. 莢膜多糖定量檢測有什么臨床意義？ 答：莢膜多糖定量測定具有診斷和預測價值?？乖男r往往與疾病的程度密切相關，定量檢測莢膜多糖濃度有助于判斷感染的嚴重程度或疾病的活動程度。莢膜多糖含量的動態(tài)監(jiān)測可作為病情轉歸、預后和療效評價指標。患者莢膜多糖濃度降低表明治療有效，不降低說明治療不充分。4. 哪些標本可檢出莢膜多糖？答：血清、腦脊液、肺泡灌洗液和尿

47、液均可檢出莢膜多糖，但腦脊液敏感性高于血清和其它體液。5. 商品化的莢膜多糖抗原檢測試劑盒有哪些？ 答：目前，商品化的新型隱球菌莢膜多糖抗原檢測試劑盒國外產(chǎn)品有美國IMMY公司生產(chǎn)的LATEX-CRYPTOCOCCUS ANTIGEN DETECTION SYSTEM（乳膠凝集法）和CrAg Lateral Flow Assay（膠體金法）；伯樂（Bio-Rad）公司生產(chǎn)的PASTOREX® CRYPTO PLUS（乳膠凝集法）；國內產(chǎn)品有天津貽諾琦（Bio-Enoche）生物工程有限公司（中美合資）生產(chǎn)的新型隱球菌莢膜多糖抗原檢測試劑盒（ELISA法）。6. 隱球菌莢膜多糖檢測試劑

48、盒原理？答：國外產(chǎn)品乳膠凝集法試劑盒原理：該檢測系統(tǒng)利用包被在乳膠顆粒中的抗隱球菌抗體與含有隱球菌莢膜多糖抗原的樣本發(fā)生凝集反應，通過凝集顆粒的大小進行定性分析。貽諾琦（Bio-Enoche）公司試劑盒（ELISA）原理：該試劑盒采用競爭法， 先將莢膜多糖包被在酶標板上，再加入待檢血清（或腦脊液）和辣根過氧化物酶標記的莢膜多糖抗體，此時，待檢標本中的莢膜多糖及莢膜多糖標準品與酶標板上的莢膜多糖競爭性結合有限的抗體結合位點，再加入底物顯色，在酶標儀450nm處測定吸光度值，測定值和待檢抗原的濃度呈負相關，可根據(jù)莢膜多糖標準品繪制標準曲線并計算待檢標本中莢膜多糖的濃度。該試劑盒可進行定量或定性分析

49、。 7. 各種莢膜多糖檢測技術敏感性如何？答：由于方法學不同，各種檢測技術的靈敏度不同，依次為ELISA法>膠體金法>乳膠凝集法，ELISA法檢測靈敏度可達0.5ng/ml，腦脊液和血清樣本莢膜多糖抗原檢測的敏感性可達到97%和87%。莢膜多糖抗原檢出的敏感性與菌株的血清型有關，血清型A/B/D可在0.5ng/ml時就可檢出，而血清型C在25ng/ml時才能被檢測到。 8. 國產(chǎn)莢膜多糖ELISA試劑盒性能怎樣？答：上述國產(chǎn)莢膜多糖ELISA試劑盒分析靈敏度<0.5ng/ml；特異性達99%；測范圍為0.32-32 ng/ml；與美國IMMY公司新型隱球菌抗原檢測試劑盒（乳膠

50、凝集法）進行對比試驗（166例樣本），陽性符合率86.67%，陰性符合率100%。9. 開展甘露聚糖檢測需用什么儀器設備？答：需要使用的儀器包括：酶標儀（450nm）、恒溫箱（37）、離心機、混旋器等。參考文獻1、Sulahian A，Touratier S，Ribaud PFalse positive test for aspergillus antigenemia related to concom itant adm inistration of piperacillinand tazobactamN Engl J Med，2003，349(24)：236623672、M. Machet

51、ti, M. J. Majabo, E. Furfaro,et al. Kinetics of galactomannan in surgical patients receiving perioperative piperacillin/tazobactam prophylaxis. Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2006) 58, 8068103、Tyler Warkentien, MD. An Update on Cryptococcosis Among HIV-Infected Persons. Int J STD AIDS. 2010 October ; 21(10): 679684.4、Clancy C J，Nguyen M L，Cheng S，et al.Immunoglobulin G responses