生物信息學(xué)論文Doc1

1、對(duì)歐洲油菜中假定的17.9負(fù)責(zé)二級(jí)熱休克蛋白的研究進(jìn)行生物信息學(xué)分析黃玉霞(201007010105)(周口師范學(xué)院生命科學(xué)系，河南周口，466001)摘要：采用生物信息學(xué)方法，對(duì)其編碼的蛋白從理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞定位、信號(hào)肽預(yù)測(cè)，磷酸化位點(diǎn)，跨膜結(jié)構(gòu)域及功能域等方面進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果表明，該歐洲油菜假定的17.9負(fù)責(zé)二級(jí)熱休克蛋白為154個(gè)氨基酸，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中以-螺旋（37.01%）和擴(kuò)展束（19.48%）-轉(zhuǎn)角（7.14%）和無(wú)規(guī)則卷曲(36.36%)為主，不存在跨膜區(qū)，N端不存在信號(hào)肽序列，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)中；存在3個(gè)不穩(wěn)定區(qū)，不形成球形蛋白域。該研究結(jié)果為進(jìn)一步研究提供了

2、理論基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：蕓苔屬植物籽（歐洲油菜）；熱休克蛋白；生物信息學(xué)引言：熱休克蛋白（Heat shock proteins，又稱(chēng)熱激蛋白，簡(jiǎn)稱(chēng)為HSP）是一類(lèi)功能性相關(guān)蛋白質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞受到升高溫度或其他壓力時(shí)它們的表達(dá)就會(huì)增長(zhǎng)1。這種表達(dá)的增長(zhǎng)是受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控的。熱休克蛋白戲劇性地上調(diào)控是熱休克反應(yīng)的關(guān)鍵部分并且主要由熱休克因子引導(dǎo)2。并且它是在從細(xì)菌到哺乳動(dòng)物中廣泛存在一類(lèi)熱應(yīng)急蛋白質(zhì)。許多熱休克蛋白具有分子伴侶活性。按照蛋白的大小，熱休克蛋白共分為五類(lèi)，分別為HSP100，HSP90，HSP70，HSP60 以及小分子熱休克蛋白 small Heat Shock Proteins (sHSPs

3、)( Kyeong et al., 1998)。絕大部分生物細(xì)胞生成的HSP分子量都在80110kD、6874kD和1830kD之間。不同分子量的HSP，在細(xì)胞內(nèi)的分布也有所不同，例如，在酵母菌中發(fā)現(xiàn)的分子量為89kD的HSP是一種可溶性的細(xì)胞漿蛋白質(zhì)，而分子量為68kD、70kD、110kD的HSP卻主要分布于核或核仁區(qū)域?？偟膩?lái)說(shuō)，HSP的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)的機(jī)制迄今還不清楚，只有一些推測(cè)。HSP可提高細(xì)胞的應(yīng)激能力，特別是耐熱能力，HSP還可調(diào)節(jié)Na+-K+-ATP酶的活性，有人通過(guò)四膜蟲(chóng)屬細(xì)胞熱休克的研究，發(fā)現(xiàn)有些HSP具有促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)糖原異生和糖原生成的作用，使細(xì)胞內(nèi)糖原貯量增多，從而提高應(yīng)激

4、能力。此外，有人還報(bào)道，熱、乙醇、亞砷酸鈉的預(yù)處理不僅能使某些細(xì)胞產(chǎn)生熱耐受，還能使細(xì)胞對(duì)阿霉素（adriamycin）的耐受性增強(qiáng)，提示HSP可以增強(qiáng)對(duì)各種損傷的抵抗力。至于在人類(lèi)的應(yīng)激中，HSP究竟起什么作用，目前還知之甚少。植物在熱激35min內(nèi)HSPmRNA的含量增加。在20分鐘內(nèi)可以檢測(cè)到新合成的HSP。如果植物一直處于熱激狀態(tài)，HSP合成可以持續(xù)幾個(gè)小時(shí)。HSP廣泛存在于植物細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、葉綠體線粒體等組織中。目前已發(fā)現(xiàn)的眾多HSP，它們的主要功能是參與新生肽的折疊以及蛋白質(zhì)變性后的復(fù)性、降解，維持胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定3。因此熱激蛋白的研究將是植物抗逆境脅迫的重要領(lǐng)域。植物細(xì)胞在受脅迫

5、時(shí)HSPs能合成 ，而且不同的細(xì)胞中存在不同類(lèi)型的，這些結(jié)果表明:在基本的生命過(guò)程中起一定的作用 。因此脅迫下產(chǎn)生的HSPs與未受脅迫時(shí)HSPs之間的關(guān)系也是一個(gè)非常值得探討的問(wèn)題。從目前研究來(lái)看，還沒(méi)有任何有關(guān)轉(zhuǎn)基因植株中HSPs表達(dá)量增加或減少的報(bào)道，更沒(méi)有HSPs量的增加可使轉(zhuǎn)基因植株抗逆性能力提高的報(bào)道。如果轉(zhuǎn)HSPs基因植株中HSPs量增加后確實(shí)可以提高其耐熱、抗旱能力，那么就可以斷定HSPs具有增強(qiáng)植株的耐熱、抗旱等功能。 目前已經(jīng)獲得了一些HSPs的抗體以及HSPs的cDNA探針，有實(shí)驗(yàn)表明在豌豆、大豆和玉米中能克隆出葉綠體smHSPs的cDNA，這些將可能有助于上述問(wèn)題的解決。

6、分子伴侶是當(dāng)今國(guó)際上蛋白質(zhì)研究的一個(gè)熱點(diǎn)，其作用的分子機(jī)理已有一些假說(shuō)，但還需進(jìn)一步深入研究 搞清楚分子伴侶的作用機(jī)理對(duì)于揭示植物細(xì)胞抗逆性的本質(zhì)無(wú)疑是十分重要的 此外，對(duì)HSPs生物學(xué)特性及交叉保護(hù)的研究也將會(huì)是未來(lái)的研究熱點(diǎn)。因此，只有在徹底弄清楚HSPs誘導(dǎo)機(jī)理以及各種HSPs的功能之后才有可能有目的地利用HSPs改良蔬菜，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)服務(wù)。此外，油菜對(duì)干旱以及其它逆境脅迫的研究不能僅限于搞清楚一兩個(gè)蛋白或通過(guò)轉(zhuǎn)移一兩個(gè)基因來(lái)提高其抗性，而應(yīng)當(dāng)結(jié)合其它相關(guān)研究（如植物抗逆性調(diào)控基因或植物信號(hào)感受系統(tǒng)），綜合地進(jìn)行研究，這樣才能對(duì)植物的抗旱機(jī)理有更深的認(rèn)識(shí)，實(shí)現(xiàn)培育新的抗性品種的突破相信隨著

7、人們對(duì)耐旱分子機(jī)制研究的不斷深入、植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法和技術(shù)的改善，基因操作技術(shù)也將日趨完善，將抗旱基因轉(zhuǎn)移到無(wú)抗旱性的油菜組織中，以增強(qiáng)油菜抗旱性，也是很有可能的4-6.。本文利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對(duì)其進(jìn)行綜合預(yù)測(cè)分析，為進(jìn)一步研究其在油菜發(fā)育過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用提供理論基礎(chǔ)。1.油菜熱休克蛋白的生物信息學(xué)分析1.1利用Protparam（/proteomics）工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)，利用SOPMA工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用NetPhos 2.0 Server 預(yù)測(cè)磷酸化作用位點(diǎn)，在/proteomics上利用TMPr

8、ed工具分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)和跨膜方向，利用TargetP 1.1 Server預(yù)測(cè)氨基酸前導(dǎo)肽的細(xì)胞定位。2 結(jié)果與分析2.1對(duì)歐洲油菜中假定的17.9負(fù)責(zé)二級(jí)熱休克蛋白序列分析利用NCBI得到的歐洲油菜中假定的17.9負(fù)責(zé)二級(jí)熱休克蛋白序列為：>gi|397787610|gb|AFO66516.1| putative 17.9 kDa class II heat shock protein Brassica napusMDFGRFPIISILEDMLEVPEEHSEKGRSNPSRAYVRDQKAMAATPADVIEQPDAYAFVVDMPGIKGDEIKVQVESDNVLVVSGER

9、KRESKENEGVKYVRMERRMGKFMRKFQLPENADLEKISASCNDGVLKVTVGKLPPPEPKKPKTIQVQVA圖1歐洲油菜克休克蛋白保守結(jié)構(gòu)域2.2對(duì)歐洲油菜中假定的17.9負(fù)責(zé)二級(jí)熱休克蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析利用Protparam（/proteomics）工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì),表明該蛋白分子式為C758H1234N212O233S8，分子量為17301.9，理論等電點(diǎn)（PI）為5.97。含有19種基本氨基酸，其中含量最高的是Val (V)（11.0%），含量最低的是Cys（0.6%）、His (H) （0.6%）；其中帶負(fù)電荷

10、的氨基酸殘基（(Asp + Glu): 26個(gè)，帶正電荷的氨基酸殘基(Arg + Lys): 25個(gè)。其水溶液在280nm處的消光系數(shù)（Extinction coefficients）為4470。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)（Instability index）為42.22，為不穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)（Aliphatic index）是76.49；平均親水系數(shù)（Grand average of hydropathicity）為-0.587。其氨基酸組成如表：表1 該油菜17.9負(fù)責(zé)二級(jí)熱休克蛋白氨基酸組成氨基酸比例氨基酸比例氨基酸比例氨基酸比例氨基酸比例Ala (A)6.5%Gln (Q)3.9%Leu (

11、L)4.5%Ser (S)5.8%Pyl (O)0.0%Arg (R)6.5%Glu (E)10.4%Lys (K)9.7%Thr (T)1.9%Sec (U)0.0%Asn (N)3.2%Gly (G)5.8%Met (M)4.5%Trp (W)0.0%Asx (B)0.0%Asp (D)6.5%His (H)0.6%Phe (F)3.2%Tyr (Y)1.9%Glx (Z)0.0%Cys (C)0.6%Ile (I)5.2%Pro (P)7.8%Val (V)11.0%Xaa(X)0.0%2.3對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白紊亂區(qū)、球蛋白區(qū)預(yù)測(cè)：利用軟件SOPMA對(duì)該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)

12、果表明，該蛋白質(zhì)序列中-螺旋占37.01%，擴(kuò)展束占19.48%，-轉(zhuǎn)角占7.14%，無(wú)規(guī)則卷曲占36.36%。利用GlobPlot軟件（.embl. de/）對(duì)歐洲油菜17.9負(fù)責(zé)二級(jí)熱休克蛋白序列中的紊亂區(qū)、球蛋白區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果(圖4)顯示該蛋白存在3個(gè)較小的不穩(wěn)定區(qū)，分別位于1-10，23-30，132-147氨基酸位置，在2-131位處形成一個(gè)較大的潛在球形蛋白區(qū)。圖2 歐洲油菜17.9負(fù)責(zé)二級(jí)熱休克蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖3歐洲油菜17.9負(fù)責(zé)二級(jí)熱休克蛋白紊亂區(qū)、球蛋白區(qū)預(yù)測(cè)2.4對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞定位分析：利用TargetP 1.1 Server 軟件對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞定位分析則

13、可知：該蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)（RC = 2），表明可靠度可以。圖3歐洲油菜17.9負(fù)責(zé)二級(jí)熱休克蛋白進(jìn)行細(xì)胞定位分析2.5對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)：利用SignalP 4.0 Server軟件對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，該蛋白N端序列不存在任何信號(hào)肽序列。圖4 歐洲油菜17.9負(fù)責(zé)二級(jí)熱休克蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)2.6對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)：利用NetPhos 2.0 Server對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化預(yù)測(cè)結(jié)果（圖1）表明，該蛋白具有多個(gè)不同的磷酸化位點(diǎn)，其中有5個(gè)絲氨酸磷酸化作用位點(diǎn)（Ser: 5）、1個(gè)蘇氨酸磷酸化作用位點(diǎn)（Thr:1）和2個(gè)酪氨酸磷酸化作用位點(diǎn)（Tyr:2），表明該蛋

14、白質(zhì)磷酸化以絲氨酸磷酸化為主，兼有蘇氨酸和酪氨酸磷酸化。圖 5 歐洲油菜17.9負(fù)責(zé)二級(jí)熱休克蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)2.7 對(duì)該蛋白進(jìn)行跨膜分析在/proteomics上利用TMHMM工具分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)和跨膜方向，可得到該蛋白不存在跨摸區(qū)，結(jié)果如下圖：圖6歐洲油菜中假定的17.9負(fù)責(zé)二級(jí)熱休克蛋白跨膜結(jié)果預(yù)測(cè)2.8歐洲油菜、擬南芥等植物同源蛋白的比較和同源進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建歐洲油菜熱休克蛋白的氨基酸序列分別與擬南芥琴（Arabidopsis lyrata subsp. lyrata ）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、溫州蜜柑（Cit

15、rus unshiu）、可可樹(shù)（Theobroma cacao），同源蛋白的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，其序列相似性分別達(dá)到89%、77%、74%和70%，表明十字花科植物籽類(lèi)蛋白氨基酸序列總體上比較保守，預(yù)期形成穩(wěn)定的球型蛋白結(jié)構(gòu)執(zhí)行其功能。運(yùn)用DNAman軟件對(duì)以上幾種禾本科植物該蛋白氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建（圖7），結(jié)果表明，歐洲油菜熱休克蛋白與擬南芥琴親緣關(guān)系最近，首先聚為一類(lèi)，然后與擬南芥歸為一類(lèi),他們與溫州蜜柑和可可樹(shù)親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。圖7幾種植物熱休克蛋白蛋白的氨基酸序列比較圖8幾種植物F-box 蛋白序列的進(jìn)化樹(shù)3 討論與結(jié)論：植物HSPs是一類(lèi)在逆境條件和特定發(fā)育階段表達(dá)的小分子

16、蛋白，是植物對(duì)逆境脅迫短期適應(yīng)的必需組成成分，對(duì)減輕逆境脅迫引起的傷害有很大的作用，有機(jī)體在受到逆境脅迫后，體內(nèi)變性蛋白急劇增加，熱激蛋白可以與變性蛋白結(jié)合，維持它們的可溶狀態(tài)。此油菜中的熱休克蛋白很不穩(wěn)定，因此在研究中應(yīng)特別注意。熱休克蛋白（HSPs）也是植物體內(nèi)最大的酶家族之一,是目前國(guó)際研究的熱點(diǎn)之一，不同領(lǐng)域的科學(xué)家正在從不同領(lǐng)域揭示其本質(zhì)。在植物體內(nèi)，植物HSPs作為關(guān)鍵物質(zhì)主要參與植物的抗逆性，因此，研究植物HSPs對(duì)揭示植物抗逆性及其過(guò)程具有重要理論價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)用生物信息方法學(xué)對(duì)其編碼的蛋白序列，進(jìn)行了理化性質(zhì)、信號(hào)肽、跨膜區(qū)、亞細(xì)胞定位，功能域分析，初步獲得了該蛋白的一些特性。

17、并對(duì)其與其作物同源熱休克蛋白蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，獲得了其進(jìn)化相關(guān)的信息?？傻弥煌参镩g，熱休克蛋白的同源性不同，本次試驗(yàn)中可得知這幾種植物的同源性比較大，可能與其mRNA有關(guān)7。并且HSPs的高度保守性說(shuō)明它們?cè)谏锷顒?dòng)中具有重要的作用。因此可根據(jù)該基因序列設(shè)計(jì)引物，研究其在油菜發(fā)育的不同時(shí)期在各器官或組織中的表達(dá)情況，以探索其具體功能。4參考文獻(xiàn)：1. De Maio A. Heat shock proteins: facts, thoughts, and dreams. Shock (Augusta, Ga.). 1999.January, 11 (1): 112. doi:10.1097/00024382-199901000-00001. PMID 9921710. 2. Wu C. Heat shock transcription factors: structure and regulation. Annual review of cell and developmental biology. 1995, 11: 44169.