儀器分析實驗設(shè)計方案2

1、 熏肉制品中亞硝酸鹽含量的測定 【摘要】以-萘胺為顯色劑，利用紫外可見分光光度計，探究實驗的最佳條件（最大波長的測定，顯色劑用量的選擇以及顯色時間的選取），繪制亞硝酸鹽的標準曲線，測定熏肉制品中亞硝酸鹽的含量?！娟P(guān)鍵詞】肉制品，亞硝酸鹽，紫外-可見分光光度法【引言】（一）熏肉制品與亞硝酸鹽簡介肉制品是一類深受人民群眾喜愛的食品，在其生產(chǎn)過程中多采用亞硝酸鹽作為發(fā)色劑，它不僅能使肉制品保持良好的色澤，還能抑制肉毒梭狀芽孢桿菌，保證肉制品的后熟風(fēng)味。但近年來由于亞硝酸鹽攝入量過多引起的食物時中毒時有發(fā)生，且加硝處理過的肉制品中的亞硝酸鹽可與胺類生成強致癌物亞硝胺，對人體健康產(chǎn)生潛在的危害。1 亞硝

2、酸鹽的性質(zhì)亞硝酸和硝酸的鈉鹽和鉀鹽常被加入用于腌肉的混合物中，用來產(chǎn)生和保持色澤、抑制微生物和產(chǎn)生特殊的風(fēng)味。此外，亞硝酸鹽（150-200mg/kg）可抑制罐裝碎肉和腌肉中的梭狀芽孢桿菌。亞硝酸鹽的抗微生物作用為它使用于可能生成長肉毒梭狀芽孢桿菌的腌肉中提供了正當(dāng)?shù)睦碛?。亞硝酸鹽含量只要控制在安全范圍內(nèi)使用不會對人體造成危害。肉制品中，亞硝酸鹽含量不得超過30mg/kg，這是因為亞硝酸鹽的中毒劑量是200毫克以上，而正常膳食中的亞硝酸鹽即使是大量用亞硝酸鹽做食品添加劑的肉類，也不會超過50毫克。2 發(fā)色原理亞硝酸鹽在肉中形成一氧化一氮，而一氧化一氮與血紅素類化合物作用生成亞硝酰肌紅蛋白，這種

3、色素產(chǎn)生了腌肉的紅色。3 中毒后癥狀亞硝酸鹽是不會蓄積在體內(nèi)的，膳食中絕大部分亞硝酸鹽隨尿排出，不會對人體造成危害。過量亞硝酸鹽進入人體，會氧化血液中的血紅蛋白為高鐵血紅蛋白，后者無攜氧功能，導(dǎo)致組織缺氧，引起腸原性青紫癥，皮膚青紫是本病的特征，尤以口唇青紫最為普遍?？诜喯跛猁}10分鐘至3小時后，可出現(xiàn)頭暈、惡心、嘔吐等癥狀。嚴重者出現(xiàn)意識喪失、昏迷、呼吸衰竭，甚至死亡。4 亞硝酸鹽中毒作用機理當(dāng)血紅蛋白中的鐵處于+2（亞鐵）并且缺乏配體鍵合所需的第6部位時它被稱為肌紅蛋白，是由珠蛋白和血紅素組成的絡(luò)合物，位居血紅蛋白中央的鐵原子(d2sp3)具有6個配位部位，其中4個分別被4吡咯環(huán)上的氮原

4、子占據(jù)，第5個配位部位與珠蛋白的組氨酸殘基鍵合，剩余的第6個配位部位可與各種配基提供的電負性原子絡(luò)合。亞硝酸鹽為強氧化劑，進人人體后，可使血中低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，失去運氧的功能，導(dǎo)致組織缺氧。（二）亞硝酸鹽的測定方法為了有效的控制其毒性，檢測其在食品中的殘留量，目前常采用的測定方法主要有光度法、色譜法、電化學(xué)法。其中光度法又分為鹽酸萘乙二胺法、格里試劑比色法、催化光度法、紫外光度法；色譜法中有離子色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法；電化學(xué)法又分為示波極譜法、伏安法。還有一些新的方法如化學(xué)發(fā)光法、熒光法、原子吸收光譜法等。1 光度法 在弱酸性溶液中，NO2-與對氨基苯磺酸反應(yīng)生成重氮

5、化合物后，再與鹽酸萘乙二胺偶聯(lián)生成紫紅色的偶氮染料，用分光光度法在540nm處測定，與標準曲線比較定量。 GB50090332003測定方法中，其中一種方法就是格里試劑比色法，其原理是在弱堿性條件下，用熱水從樣品中提取NO2-，然后用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀蛋白，過濾后，在弱酸條件下，NO2-與對氨基苯磺酸發(fā)生重氮化后，再和N1萘基乙二胺耦合形成紅色偶氮染料，最大吸收波長為538nm，所選擇的顯色劑不一樣，最大吸收波長也有所不同。針對衛(wèi)生標準的規(guī)定和工藝的不同，以及檢測過程中pH、溫度、放置時間對顯色的影響，在檢測肉制品中NO2-時，格里試劑比色法的準確性和穩(wěn)定性均高于鹽酸萘乙二胺法。另外用對氨

6、基苯磺酰胺代替對氨基苯磺酸，其靈敏度、精密度均得到提高。 主要原理是在一定的溫度和酸性條件下，NO2-對KBO3氧化染料(或指示劑)而褪色的反應(yīng)具有較明顯的催化作用，且在一定NO2-的濃度范圍內(nèi)，吸光度變化與NO2-濃度成較好的線性關(guān)系，因此，可用該原理定量溶液中NO2-的濃度。 在稀鹽酸介質(zhì)中，NO2-與堿性品紅發(fā)生重氮反應(yīng)，用8羥基喹啉作偶聯(lián)劑，在弱堿性條件下，生成茶紅色偶氮染料來定量測定NO2-含量。光度法是測定NO2-的經(jīng)典方法，其檢測所需費用較低，靈敏度較高，不經(jīng)分離可直接同時測定樣品中NO3-和NO2-，具有較好的選擇性，操作簡便?！? 色譜法 主要原理是當(dāng)淋洗液攜帶樣品進入分離柱

7、后，樣品離子便與離子交換功能基的平衡離子爭奪樹脂的離子交換位置。經(jīng)過多次競爭達到交換平衡。由于不同離子對樹脂固定相的親和力不同，通過淋洗液的不斷淋洗，各種離子便先后從色譜柱上被洗脫下來，實現(xiàn)了分離。通過檢測器，即可經(jīng)檢測器檢測各種離子，得到一個個色譜峰，然后與標準進行比較，根據(jù)保留時間定性，根據(jù)峰面積或峰高定量。用紫外檢測離子色譜法對醬腌菜中的NO3-與NO2-進行定量分析。樣品經(jīng)過超聲提取后，以1.8mmol/LNaCO3及1.7mmol/LNaHCO3為淋洗液，經(jīng)DIONEXIonpacAS4ASC分析柱分離，于210nm處紫外檢測。該法可以采用其他類型的色譜柱進行分離，所用的檢測器也可選

8、用化學(xué)抑制型電導(dǎo)檢測器(可大幅度降低淋洗液的電導(dǎo)值)。離子色譜法所用的化學(xué)試劑較少，并且實驗耗時相對來說較少。 食品中NO2-含量的重氮化耦合高效液相色譜法測定方法是將食品樣品中蛋白質(zhì)、脂肪除去后，NO2-與對氨基苯磺酸重氮化，再與N一1一萘乙二胺耦合之后，進行HPLC分析。若采用反相高效液相色譜法一二極管陣列檢測器法測定鹵肉制品中NO3-及NO2-的含量，則該方法選擇四丁基溴化銨作為離子對試劑，與NO3-和NO2-陰離子形成中性締合物，在甲醇一混合磷酸鹽流動相中，被非極性鍵合相柱(ODS)分離并定量檢測。該方法靈敏度高，并且樣品中其他成分如色素、動物性蛋白等對檢測不構(gòu)成干擾。3 電化學(xué)法 G

9、B50090332003測定方法中，另外一種方法是示波極譜法，試樣經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)、除去脂肪后，在弱酸性的條件下，NO2-與對氨基苯磺酸重氮化后，在弱堿性條件下再與8羥基喹啉耦合形成橙色染料，該染料在汞電極上還原產(chǎn)生電流，電流與NO2-的濃度呈線性關(guān)系，可與標準曲線比較定量。 10-4mol/L范圍時有良好的線性關(guān)系，運用方波伏安法在優(yōu)化條件下測定了水樣中亞硝酸鹽含量，測定結(jié)果令人滿意。相比較可以發(fā)現(xiàn)，光度法所用儀器設(shè)備簡單、價廉、靈敏度較高，具有實用性和可操作性。由于NO2-在固體電極(如GCE，Au和Pt等)上氧化(或還原)一般需要較高的過電位，因而不易直接發(fā)生電化學(xué)氧化(或還原)反應(yīng)，故電化

10、學(xué)方法的使用范圍不如光度法使用范圍廣。而熒光法、化學(xué)發(fā)光法、原子吸收光譜法等對儀器的要求較高。分光光度法以其設(shè)備簡單、操作快捷、靈敏度高、結(jié)果直觀的優(yōu)點，深受歡迎。本實驗研究了以-萘胺為顯色劑，利用紫外可見分光光度計測定肉制品中的亞硝酸鹽的含量的方法。結(jié)果證明，此方法簡單、快捷、準確，是一種食品檢測的好方法?，F(xiàn)實生活中，食品檢測人員經(jīng)常采用亞硝酸鹽快速測試盒測定食品中亞硝酸鹽的含量，亞硝酸鹽快速測試盒采用N-1-萘乙二胺代替?zhèn)鹘y(tǒng)的a-萘胺，使顯色的靈敏度高，顯色的摩爾質(zhì)量增大，測定出來的結(jié)果更準確，但鑒于各方面的局限性，本實驗我們采用紫外分光光度法，以a-萘胺為顯色劑測定熏肉制品中亞硝酸鹽的含

11、量?！緦嶒?zāi)康摹苛私庋庵衼喯跛猁}的作用和危害，以及含量測定的方法；掌握紫外分光光度法測定亞硝酸鹽含量的基本原理與操作方法；明確亞硝酸鹽的測定與控制成品質(zhì)量的關(guān)系?！緦嶒炘怼勘敬卧囼炦x定紫外分光光度法來測定熏肉中亞硝酸鹽的含量：以-萘胺為顯色劑，利用可見分光光度計測定肉制品中的亞硝酸鹽的含量，其實驗原理如下：樣品經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)、除去脂肪后，抽提分離出亞硝酸鹽，在弱酸條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)生成重氮鹽，此重氮鹽再與-萘胺試劑發(fā)生偶合反應(yīng)，生成紫紅色偶氮化合物，其最大吸收波長為547nm，其顏色的深度與樣液中亞硝酸含量成正比，可測定吸光度并與標準曲線比較定量。反應(yīng)式如下：肉制品

12、中亞硝酸鹽含量=（mg/kg）式中：X為由測得的吸光度在標準曲線上對應(yīng)的亞硝酸鈉質(zhì)量濃度（g/mL）；m為樣品質(zhì)量（g）。經(jīng)文獻和實驗經(jīng)驗參考，試劑空白和去離子水對吸光度的影響相差不大，因此對于實驗的參比溶液的選擇根據(jù)實驗方便原則，選擇去離子水為參比溶液。此外，分別在15%、20%與25%的鹽酸中的測定結(jié)果顯示，酸度變化對顯色反應(yīng)的影響并不是很明顯，實驗中用20%的鹽酸溶解對氨基苯磺酸測得的吸光度相對較大，因此實驗選取20%的鹽酸溶解對氨基苯磺酸。【儀器與試劑】試劑：（1） 亞鐵氰化鉀溶液：稱取亞鐵氰化鉀K4Fe(CN)63H2O溶于水，并稀釋至100mL。（2） 乙酸鋅溶液：稱取乙酸鋅Zn(

13、CH3COO)22H2O，加3mL冰醋酸溶于水，并稀釋至100mL。（3） 飽和硼砂溶液：硼酸鈉（Na2BO410H2O）溶于100mL熱水中，冷卻備用。（4）0.4%對氨基苯磺酸溶液（4g/L）：稱取對氨基苯磺酸，溶于100mL20%鹽酸中，臵棕色瓶中，混勻，避光保存。0.2%-萘胺溶液(2g/L)：稱取mL，避光保存。（5） 亞硝酸鈉標準溶液（g/mL）：精確稱取gmL。（6） 亞硝酸鈉標準溶液（5g/mL）：臨用前，吸取亞硝酸鈉標準溶液0mL，臵于100mL的容量瓶中，加水稀釋到刻度。儀器：砧板，菜刀 UV8500紫外-可見分光光度計 比色皿2個 分析天平1mL、2mL、5mL、10mL

14、、20mL移液管各1支50mL燒杯1個，100mL燒杯1個，500mL燒杯1個10mL量筒1個，100mL量筒1個50mL容量瓶12個，100mL容量瓶4個，200mL容量瓶1個，500mL容量瓶2個濾紙、漏斗、玻璃棒過濾裝置一套【實驗內(nèi)容與步驟】1、樣品處理樣品中硝酸鹽及亞硝酸鹽的提?。悍Q取經(jīng)剁碎混合均勻的樣品5.0565g于100mLmL，以玻璃棒攪拌，然后用70左右的水約300mL，將其稀釋轉(zhuǎn)移到500mL容量瓶，沸水浴中加熱15分鐘，取出，邊轉(zhuǎn)動邊加入5mL亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加5mL乙酸鋅溶液以沉淀蛋白質(zhì)。冷卻到室溫，用水定容，搖勻。放置片刻，去除上層脂肪并過濾，棄去前30mL濾

15、液。2、最大波長的測定于內(nèi)層1cm比色皿中，用空白溶液即參比溶液進行基線調(diào)零。調(diào)零后，把靠近外面的比色皿拿出換裝濃度為g/mL的標準溶液在610nm450nm之間進行掃描，得到最大吸收波長max=_nm。3、亞硝酸鈉標準曲線的繪制用移液管精確吸取亞硝酸鈉標準液(5g/mL、0.2、和mL于一組50mL容量瓶中，各加水至約25mL，分別加2mL/mL對氨基苯磺酸溶液，搖勻，靜置35min后，各加入2mL0.2%-萘胺溶液，并用水定容到50mL、04、08、12、16、20、30和40ug/mL）靜置15min后，用1cm比色皿，用分光光度計在最大波長下測定吸光度，以蒸餾水為空白。以測得的各比色液

16、的吸光度對應(yīng)的亞硝酸濃度作曲線。4、亞硝酸鹽含量的測定取20mL待測液于25mL容量瓶中，加1mL0.4%對氨基苯磺酸溶液，搖勻。靜置35分鐘后，加入mL0.2%-萘胺溶液，定容，搖勻。比色測定，記錄吸光度。根據(jù)標準曲線方程算得相應(yīng)的亞硝酸鈉濃度（g/mL），計算試樣中亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計）的含量。【實驗數(shù)據(jù)與結(jié)果分析】1. 最大吸收波長的確定結(jié)果分析：由上圖可知，待測物質(zhì)的最大吸收波長為545.7nm，故此實驗選用波長545.7nm為測定波長。2、亞硝酸鈉標準曲線（max=_nm, 顯示時間為15min）V(NaNO2)/mlC(NaNO2) (g/mL）40吸光度A72734762800.11951結(jié)果分析：繪制出亞硝酸鈉溶液的標準曲線如上圖，可根據(jù)其線性方程求出待測液的亞硝酸濃度，曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.99610，線性關(guān)系較好，由圖可知，第2個點偏離較大。出現(xiàn)誤差的原因：定容時操作不準確，即配制標準溶液時出現(xiàn)了誤差。待測溶液吸光度A 待測液中亞硝酸含量(g/ml）結(jié)果分析：由標準曲線方程y=0.7089x+0.0071，可求的待測溶液的濃度x=（0.0071）g/ml，由計算公式：肉制品中亞硝酸鹽含量= （mg