骨髓增生異常綜合征患者血清造血抑制活性的研究

1、    骨髓增生異常綜合征患者血清造血抑制活性的研究        摘要目的探討骨髓增生異常綜合征(MDS)患者血清對正常骨髓粒系及紅系造血祖細胞的抑制作用。方法應(yīng)用甲基纖維素體外培養(yǎng)法，以DNA末端標記及流式細胞術(shù)分析觀察患者血清體外抑制正常人骨髓造血祖細胞增殖及對正常人造血細胞凋亡的作用。結(jié)果23例患者中有3例的血清具有抑制正常骨髓粒系祖細胞生長的作用，4例血清具有抑制正常骨髓紅系祖細胞生長的作用。4例對正常骨髓紅系祖細胞生長有抑制作用的患者中有3例患者血清的抑制活性可被

2、抗腫瘤壞死因子(TNF)單克隆抗體中和。2例具有抑制正常骨髓紅系祖細胞生長活性的血清在體外可促進正常骨髓造血細胞凋亡。結(jié)論部分MDS患者血清中存在造血抑制因子，這種抑制因子主要是TNF，TNF誘導(dǎo)造血細胞凋亡是致部分MDS患者無效造血的重要原因。關(guān)鍵詞造血系統(tǒng)腫瘤壞死因子細胞死亡，程序性骨髓增生異常綜合征Inhibition of hematopoiesis by sera from patients with myelodysplastic syndromesDING Runsheng,LIU Hong,XU Ruirong,et al.Department of Hematology,Th

3、e Affiliated Hospital of Nantong Medical College,Nantong226001AbstractObjectiveTo explore the inhibitory effect of sera from patients with myelodysplastic syndromes (MDS) on the growth of normal hematopoietic progenitor cells.MethodsThe inbibitory activity to the growth of BFU-E and CFU-GM was analy

4、sed by in vitro methylcellulose culture.Hematopoietic cell apoptosis was assayed with a programed cell death assay kit and flow cytometry.ResultsIn the 23 MDS patients studied，a potent inhibitory activity to CFU-GM and BFU-E was demonstrated in 3 and 4 patients,respectively.The inhibitory activity t

5、o BFU-E of sera from 3 patients was almost entirely neutralized by anti-TNF McAb.Sera from two MDS patients induced apoptosis of normal hematopoietic progenitor cells.ConclusionInhibitors of hematopoietic progenitor cells are present in sera from some MDS patients. One of the inhibitors might be TNF

6、, which can induce apoptosis, resulting in ineffective hematopoiesis in MDS.Key wordsHematopoietic systemTumor necrosis factorCell death,programedMyelodysplastic syndrome骨髓增生異常綜合征(MDS) 是一組造血干細胞克隆性疾病1,2。骨髓細胞常增生，但由于無效造血,外周血有一系、兩系或三系血細胞減少。從體液因素討論其骨髓無效造血的原因，也許能更好地了解MDS的發(fā)病機制。曾有MDS患者血清造血抑制作用的報道3,但血清中抑制物的性

7、質(zhì)尚無統(tǒng)一結(jié)論，其作用機制尚不清楚。我們觀察MDS患者血清對正常造血細胞的抑制活性，并進一步探討抑制物的特性。病例和方法1病例MDS患者23例，男11例，女12例，年齡3078歲，平均51.2歲；其中RA 12例，RAS 3例，RAEB 5例和RAEB-t 3例，均按FAB診斷標準4確診。所有病例都有不同程度的貧血。實驗前，所有病例未經(jīng)任何治療。以10名正常志愿者為供體，取其骨髓作為紅系爆式集落(BFU-E)及粒-巨噬細胞集落(CFU-GM)的來源。2血清標本取患者及正常對照者的外周血適量，室溫靜置1小時后離心。將血清分裝于試管中，-30凍存?zhèn)溆谩?單個核細胞(MNC)分離取正常人肝素抗凝骨髓

8、適量，以Ficoll液(相對密度為1.077) 密度梯度法分離MNC作培養(yǎng)用。部分骨髓的MNC進一步以塑料皿吸附法除去單核細胞，以尼龍纖維(日本W(wǎng)akojunyakm會社)去除B淋巴細胞，以E玫瑰花環(huán)法除去T淋巴細胞，再做培養(yǎng)5。4甲基纖維素體外培養(yǎng)按Iscove法6改良：將正常供體骨髓分離所得MNC加入培養(yǎng)體系中，細胞終濃度為2×105/ml。BFU-E體系含12g/L甲基纖維素,體積分數(shù)為30的滅活胎牛血清，體積分數(shù)為1的牛血清清蛋白，10ng/ml的白細胞介素3(購自日本Kirin公司)，450ng/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白(購自美國Sigma公司)，2U/ml紅細胞生成素(購自Kirin

9、公司)及IMDM培養(yǎng)液。CFU-GM培養(yǎng)體系含12g/L甲基纖維素，體積分數(shù)為30的熱滅活胎牛血清，體積分數(shù)為1的牛血清清蛋白，10ng/ml白細胞介素3，10ng/ml粒系集落刺激因子(購自Kirin公司)及IMDM培養(yǎng)液。每份標本一式兩份，37、體積分數(shù)為5的CO2及飽和濕度下培養(yǎng)14天，分別計算BFU-E及CFU-GM的數(shù)量。5血清抑制活性分析患者及正常人血清以56滅活補體，再分別加至正常人骨髓MNC懸液中，按以上方法培養(yǎng)。血清終濃度體積分數(shù)為10?；颊哐逡种苹钚砸园俜只謴?fù)率(PR)表示。PR計算見下列公式：    按照Poisson分布原理進行

10、u檢驗,BFU-E的PR81.5，CFU-GM的PR79.0可定為具有集落抑制活性。6血清中和試驗按Tohda等的方法7進行。將各血清標本分別與抗干擾素單克隆抗體(單抗)、抗腫瘤壞死因子(TNF)單抗孵育1小時后再加入MNC懸液中，按以上方法進行培養(yǎng)。7細胞凋亡的誘導(dǎo)及測定將患者及正常人血清分別加至含正常人MNC的IMDM培養(yǎng)液中，細胞終濃度為2×105/ml，37、體積分數(shù)為5的CO2及飽和濕度下培養(yǎng)48小時，分別進行DNA末端標記(ISEL)染色及細胞DNA測定。前者按程序性細胞死亡藥盒（華美生物工程公司）操作說明進行。后者主要操作過程如下：細胞經(jīng)PBS洗滌后以100U/ml R

11、Nase消化，并以50g/ml碘化丙錠染色15分鐘，流式細胞儀(Becton Dickinson公司產(chǎn)品)檢測細胞DNA含量并計算凋亡細胞的數(shù)量。8統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)以<"wpe8.jpg (766 bytes)" src="/med/cano/201003/20100317174019496.jpg" 13 21>±s表示,按照Poisson分布原理進行u檢驗。結(jié)果1血清的造血抑制活性23例患者中有4例血清具有紅系造血抑制活性，他們的PR分別為34.6，58.7，48.4和52.1。3例血清具有粒系造血抑制活性，他們的PR分別為39.4

12、，52.8和44.6。2單抗對血清抑制活性的中和作用患者血清的造血抑制活性都不能被干擾素單抗中和。TNF單抗可完全中和3例患者血清對BFU-E的抑制活性(表1)。表1TNF單抗對3例患者血清抑制活性的中和作用(<"wpe9.jpg (766 bytes)" src="/med/cano/201003/20100317174020592.jpg" 13 21>±s)例號實驗次數(shù)BFU-E PR(%)中和前中和后1334.6±2.390.8± 4.52348.4±7.294.6± 2.93252.

13、1±3.983.2±11.3正常對照5100.0±0.2100.0±1.8     3患者血清對正常骨髓MNC凋亡的影響具有造血抑制活性的患者血清與正常骨髓MNC共育48小時后，分別用DNA ISEL和流式細胞術(shù)(FCM)檢測凋亡細胞。在ISEL方法中，我們應(yīng)用的底物為聯(lián)苯二胺，故凋亡細胞的特征是細胞核中有棕色顆?；蚝吮恢厣?yīng)用Poisson分布統(tǒng)計分析表明，具有紅系造血抑制活性的4例患者中2例患者血清作用后計數(shù)500個細胞中凋亡細胞百分率為12. 3和10.6，與正常血清作用后計數(shù)500個細胞中凋亡細胞百分率

14、1.2相比，差異有顯著性(u=3.02,u=2.73,P0.01)。以流式細胞儀測定細胞的凋亡峰(1),經(jīng)2例患者血清作用后細胞凋亡率為14.2和12.7，均較正常人血清作用后的細胞凋亡率(1.4)為高,患者血清明顯促進正常骨髓MNC凋亡(u=3.24,u=2.75,P0.01)。 討論曾有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，部分MDS患者血清具有造血抑制活性3，這種抑制活性可能是引起部分患者血液學(xué)異常的原因。我們測定了23例患者血清的造血抑制活性。結(jié)果顯示3例患者血清具有粒系造血抑制活性，4例患者血清具有紅系造血抑制活性。因而證實了部分患者的發(fā)病機制與患者血清的造血抑制因子對造血祖細胞生長的抑制作用有關(guān)。正常造血的調(diào)

15、節(jié)有賴于造血刺激因子和造血抑制因子的平衡。作為造血負調(diào)控因子的TNF在MDS的病理學(xué)過程中的作用日益受到關(guān)注。TNF體外能抑制正常紅系和粒系集落生長。本實驗中有4例患者血清具有紅系造血抑制活性，用抗TNF單抗可中和其中3例患者血清對BFU-E的抑制活性。表明部分患者血清中的造血抑制物是TNF。MDS作為一種克隆性疾患，TNF在造血調(diào)控過程中可能優(yōu)先產(chǎn)生紅系造血抑制。     1正常人及2例MDS患者血清對正常骨髓MNC凋亡的影響Raza等8觀察到患者骨髓活檢片中ISEL陽性細胞周圍有大量TNF。為了探討TNF與MDS無效造血之間的關(guān)系，我們分別以DNA原位末端標記及流式細胞術(shù)分析觀察了患者血清對正常人骨髓MNC凋亡的影響。實驗結(jié)果證實了2例患者血清有明顯促進正常人MNC凋亡的作用，表明血清中的造血抑制物其實質(zhì)是TNF，加速造血細胞凋亡的作用在該2例患者尤其明顯。隨后Raza等9又證實,MDS患者骨髓微環(huán)境中存在的TNF具有雙重作用,在誘導(dǎo)正常細胞凋亡的同時又刺激異?？寺〖毎脑鲋场Ｓ纱宋覀冋J為,MDS是