重組孕激素受體基因酵母法對南山茶子拮抗孕激素作用的研究

1、重組孕激素受體基因酵母法對南山茶子拮抗孕激素作用的研究 作者：吳小娟，李劍，劉蕓，李娜 ，唐玲，馮寶民，王永奇【摘要】 目的研究南山茶子拮抗孕激素作用。方法用系統(tǒng)溶劑分離法將南山茶子醇提物分成極性不同的組分，利用重組人孕激素受體基因酵母生物檢測法篩選南山茶子拮抗孕激素活性部位。結(jié)果5個組分都表現(xiàn)出拮抗孕激素的效應(yīng)，活性強弱依次為醋酸乙酯層正丁醇層石油醚層水層醇提物。結(jié)論醋酸乙酯部位可能為南山茶子拮抗孕激素的活性部位。 【關(guān)鍵詞】 南山茶 重組人基因酵母 孕激素受體 拮抗作用Abstract：ObjectiveTo study the antiprogestin active parts of

2、the seeds of Camellia serrdserrate Chi.MethodsThe seeds of Camellia serrdserrate Chi. extract was separated into four fractions according to polarity, its antiprogestin active parts was investigated by a recombinant yeast screening assay. ResultsThe five fractions showed antiprogestin activity, and

3、the order of the estrogenic activity of these fractions was ethyl acetate normal butyl alcohol petroleum ether water extract alcohol extraction.ConclusionThe ethyl acetate is the antiprogestin active parts of the seeds of Camellia serrdserrate Chi.Key words：Camellia serrdserrate Chi.; Recombinant ye

4、ast; Progesterone receptor; Antagonistic effect正常人骨代謝的平衡是離不開體內(nèi)一種特殊物質(zhì)調(diào)節(jié)的，這種特殊物質(zhì)就是激素。激素是由內(nèi)分泌器官所分泌的一種高效能有機化合物，人體內(nèi)很多種激素，其中目前已經(jīng)明確與骨質(zhì)疏松有關(guān)聯(lián)的8種：雌激素、甲狀腺激素（PTH）、降鈣素、活性維生素D、甲狀腺激素、雄激素、皮質(zhì)類固醇激素、生長激素。其中前4種更為重要。這些激素或通過影響破骨細胞的數(shù)量及活性來調(diào)節(jié)骨吸收過程，或通過影響成骨細胞的活性來調(diào)節(jié)骨形成過程，從而調(diào)節(jié)骨代謝。當這些激素在人體內(nèi)達到某一濃度時能夠維持骨吸收與骨形成的平衡，但當它們在體內(nèi)的含量發(fā)生異常變化時

5、，便會使骨代謝失去平衡，導(dǎo)致骨量的減少，從而引起骨質(zhì)疏松。已有大量的報道1，2：孕激素受體能夠降低雌激素受體(ER)的轉(zhuǎn)錄活性，也就是說對孕激素受體活性的抑制能夠增強體內(nèi)雌激素受體活性的表達。南山茶Camellia serrdserrate Chi.屬于山茶科山茶屬植物，廣泛分布于我國的西南部和東南部，集中分布于我國長江以南的亞熱帶地區(qū)，資源非常豐富3，其化學成分主要有黃酮，皂苷和多酚這三大類4，我們在對山茶屬植物藥用價值的研究過程中發(fā)現(xiàn)，南山茶種子乙醇提取物對維甲酸所致骨質(zhì)疏松的大鼠有很強的抗骨質(zhì)疏松活性，并且明顯高于陽性對照藥。為了具體確定南山茶子抗骨質(zhì)疏松的有效部位，我們首先用95%乙醇

6、提取南山茶子得到醇提物，對其中三類化學成分的含量進行了測定，總黃酮4.07%，總皂苷12.15%，總酚4.30%5，并分別依次用石油醚、醋酸乙酯、水飽和正丁醇進行萃取，濃縮至干，再用轉(zhuǎn)基因酵母的生物檢測方法對它們是否有拮抗孕激素受體的作用進行研究，從而從另一角度來闡明南山茶子抗骨質(zhì)疏松的作用機理。1 儀器與試藥Laborata 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Heidolph，Germany）；酶標儀（Spectra Fluor plus，TECAN，Austria）；分光光度計（WFZ UV-2000，上海）；恒溫振蕩搖床（HZQ-F，哈東聯(lián)）；恒溫平板搖床（Titramax 1000，Heidolp

7、h，Germany）；百級超凈工作臺（DL-CJ-1F，哈東聯(lián)）,旋渦混合器（MS2，廣州IKA Works），96孔培養(yǎng)板，96孔酶標板（比利時 Orange）。ONPG（Sigma，USA），二甲基亞砜（99.9%，Sigma，USA），酵母氮堿（Difco，USA）。南山茶種子（2006年3月采集于廣西省平南縣六陳鎮(zhèn)，經(jīng)昆明植物民裴盛基教授鑒定）；重組人孕激素受體（hPR）基因酵母（Gaido贈送）；SC培養(yǎng)基；孕酮（PG）（MP. Bio medical公司）；酶反應(yīng)底物鄰硝基苯基D半乳糖苷（Sigma）；二甲基亞楓(Sigma)，所用試劑均為分析純，溶于超純水（Milli-Q，USA

8、）。2 方法2.1 試劑的配制2.2 酵母接種的培養(yǎng)重組人孕激素受體基因酵母由Gaido贈送，培養(yǎng)基為增加硫酸銅（50 molL-1）、腺嘌啉、賴氨酸、色氨酸的SC培養(yǎng)基，室溫避光保存6。1 將1 ml新鮮凍融的酵母菌株接種到9 ml SC培養(yǎng)液中加10 l CuSO4，置于轉(zhuǎn)速130 rmin-1，溫度為37的空氣浴搖床中培養(yǎng)過夜，用分光光度計測定10倍稀釋的酵母菌株培養(yǎng)液在600 nm波長處的吸光度（以培養(yǎng)基為空白），要求吸光度值在0.150.5，用培養(yǎng)液將酵母菌液稀釋到A600=0.75作為工作液7。2.3 南山茶的抗孕激素活性測定分別稱取南山茶子醇提物，石油醚層浸膏，醋酸乙酯層浸膏，正

9、丁醇層浸膏以及水層浸膏各50 mg，用1 ml DMSO溶解，得濃度為50 mgml-1的溶液。取990 l工作菌液至對應(yīng)的EP管中，分別加入5 l DMSO（空白），5 l用DMSO溶解的孕酮（PG，陽性對照，110-7molL-1）和5 l用DMSO溶解的樣品渦旋混勻。在加入5 l樣品的EP管中再加入5 l PG（濃度為110-7molL-1）渦旋混勻，將以上溶液各200 l依次轉(zhuǎn)移至96孔板中，然后于恒溫平板搖床800 rmin-1，37振蕩培養(yǎng)2 h。酶標儀測定A595后，吸取150 l溶液棄去，加入120 l測試緩沖液和20 l氯仿，在30的恒溫搖床上預(yù)培養(yǎng)10 min。加入40 l

10、 ONPG（4 mgL-1）反應(yīng)液將酶反應(yīng)啟動至出現(xiàn)明顯的黃色后加入100 l 1 molL-1Na2CO3溶液終止反應(yīng)，吸取200 l上清液轉(zhuǎn)移到酶標板中測定A420的值7。2.4 -半乳糖苷酶活性以及孕激素抑制活性的U=(A420-A420)/TVA595D式中U代表酶活力，A420代表樣品在420 nm處的吸光度，A420為空白溶液（即DMSO）在420 nm處的吸光度，A595為樣品在595 nm處的吸光度，T代表反應(yīng)時間，V為反應(yīng)菌液的稀釋倍率，D為稀釋因子。抑制率(%)=1-U樣U陽100%U樣為加入樣品后標準品所表現(xiàn)出的酶活性，U陽為對照品PG的酶活性。3 結(jié)果實驗最后的總體積為

11、200 l，樣品的反應(yīng)時間都為60 min，樣品稀釋倍率為0.2，將我們所測得A420和A595值帶入上面的公式，就可以計算出相應(yīng)的-乳糖苷酶的活力值和抑制率。結(jié)果見表1和圖1。表1 加入南山茶各樣品后孕酮的酶活值/U和抑制率（略）由表1和圖1可以看出，樣品南山茶子的醋酸乙酯部位抗孕激素活性最強，抑制率達到50%，其他各個組分基本相當，因此通過以上的數(shù)據(jù)分析我們可以判斷南山茶子醇提物的醋酸乙酯部位為其拮抗孕激素的活性部位。4 討論重組孕激素受體基因酵母是一種快速、有效的檢測化合物是否有孕激素活性或抗孕激素活性的方法。它是將人孕激素受體基因（hPR）和孕激素受體響應(yīng)元件（PRE）相連的-半乳糖苷

12、酶（LacZ）報告基因這兩個基因片段引入到酵母中，當被測物質(zhì)加入培養(yǎng)基中誘導(dǎo)或抑制PR時，都會啟動基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生和分泌-半乳糖苷酶。通過測定A420的吸光度值來反應(yīng)-半乳糖苷酶的活性，從而可以得出被測物質(zhì)對孕激素受體的作用。 植物雌激素與雌激素受體結(jié)合，在體內(nèi)具有雙向調(diào)節(jié)作用。當體內(nèi)雌激素水平較低時，它就表現(xiàn)出雌激素樣活性，當體內(nèi)雌激素超過正常水平時，它就發(fā)揮出抗雌激素的作用8。重組雌激素受體基因酵母篩選南山茶子抗骨質(zhì)疏松有效部位的實驗的結(jié)果顯示醋酸乙酯部位對雌激素受體表現(xiàn)出雙向調(diào)節(jié)的作用，具有較明顯的雌激素活性同時又有較強的抗雌激素活性，因此推斷雌激素樣作用可能是南山茶子發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用

13、的主要機理之一，但是, 醋酸乙酯部位具有抑制孕激素受體的作用，同樣能夠?qū)е律矬w產(chǎn)生類雌激素樣的結(jié)果。因此，同時應(yīng)用重組雌激素和孕激素受體基因酵母，可以更加準確篩選出南山茶子抗骨質(zhì)疏松的活性部位。 致謝：本實驗是在中科院生態(tài)研究中心水生態(tài)毒理研究組完成，在此特別向王子健研究員給予本實驗的幫助和支持表示最誠摯的謝意，感謝本實驗室所有的老師和同學。【】 1Wen D X, Xu Y F, Mais D E, et al. The A and B isoforms of the human progesterone receptor operate through distinct signalin

14、g pathways within target cellsJ.Mol Cell Biol , 1994, 14: 8356.2Kraus W L, Weis K E, Katzenellenbogen B S. Inhibitory cross-talk between steroid hormone receptors: differential targeting of estrogen receptor in the repression of its transcriptional activity by agonist- and antagonist-occupied progestin receptorsJ.Mol. Cell. Biol., 1995, 15: 1847.3高繼銀. 山茶屬植物主要原種彩色圖集M.杭州：浙江技術(shù)出版社,2005:15.4王永奇，吳小娟，李紅冰，等.藥用山茶屬植物的研究J.大連大學學報,2006,27(4):47.5吳小娟，林紅景，唐 玲，等.山茶種子抗骨質(zhì)疏松有效部位群化學成分的含量測定J.中南藥學,2007,5(2):107.6李 劍，崔 梅，馬