遺傳工程技術(shù)

1、9.9 遺傳工程技術(shù) 遺傳工程問(wèn)世于70年代初。它是按照人們預(yù)先設(shè)計(jì)的生物藍(lán)圖，通過(guò)對(duì)遺傳物質(zhì)的直接操縱，進(jìn)行改組、重建，實(shí)現(xiàn)對(duì)遺傳性狀定向改造的技術(shù)。目前采用的基本方法是把遺傳物質(zhì)從一種生物細(xì)胞中提取出來(lái)，在體外施行“外科手術(shù)”，然后再把它導(dǎo)入另一個(gè)生物細(xì)胞中，改變其遺傳結(jié)構(gòu)，使之產(chǎn)生符合人類需要的新遺傳特性，定向地創(chuàng)造新生物類型。由于它采用了對(duì)遺傳物質(zhì)體外施工，類似工程設(shè)計(jì)那樣，具有很高的預(yù)見(jiàn)性、精確性與嚴(yán)格性，因此稱為遺傳工程。遺傳工程包括兩個(gè)水平的研究：一是細(xì)胞水平（如轉(zhuǎn)化、接合和轉(zhuǎn)導(dǎo)等）；另一是基因水平。所以，又可把它分成細(xì)胞工程和基因工程。實(shí)際上目前研究的主要內(nèi)容是基因工程，因此，

2、狹義的講，遺傳工程就是基因工程。構(gòu)建基因工程菌治理環(huán)境污染是環(huán)境生物工程高新技術(shù)的前沿課題。它能定向有效地利用環(huán)境微生物細(xì)胞中降解污染物的基因，去執(zhí)行凈化污染物的功能。已發(fā)現(xiàn)環(huán)境微生物具有降解農(nóng)藥、塑料、多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴、石油烴、染料及其中間體、酚類化合物和木質(zhì)素等有機(jī)污染物的功能及相關(guān)的基因。具有降解污染物基因的土著微生物菌株有時(shí)難以適應(yīng)處理環(huán)境，而且繁殖速度慢，清除有機(jī)污染物的速度和效果達(dá)不到治理工程的要求，因此有必要將降解污染物的基因轉(zhuǎn)入繁殖能力強(qiáng)和適應(yīng)性能佳的受體菌株內(nèi)，構(gòu)建出高效菌株用于治理污染或用于建立清潔生產(chǎn)工藝及生產(chǎn)其他利于環(huán)境保護(hù)的生物制品。例如利用降解石油烴的基因構(gòu)建出基

3、因工程菌用于清除大面積海洋石油污染，利用木質(zhì)素降解基因構(gòu)建成基因工程菌用于建立生物制漿造紙的清潔生產(chǎn)工藝，利用毒性蛋白基因構(gòu)建基因工程菌生產(chǎn)生物農(nóng)藥等等。一、 治理污染基因工程菌構(gòu)建的基本過(guò)程首先從環(huán)境中篩選出具有降解污染物功能的菌株，再?gòu)木哂薪到夤δ芫甑募?xì)胞內(nèi)分離出具有降解污染物功能的基因片段，經(jīng)確認(rèn)鑒定之后作為目的基因使用。在細(xì)胞外將目的基因DNA片段與其他來(lái)源的載體DNA片段通過(guò)一系列酶學(xué)反應(yīng)，重組為新的DNA。DNA重組過(guò)程即稱為基因操作過(guò)程，然后將重組后的DNA分子導(dǎo)入受體菌細(xì)胞內(nèi)?；蚬こ淌?0年代初發(fā)展起來(lái)的。它是在分子水平上，用剪接DNA片段，通過(guò)載體（一般用質(zhì)粒）與同種、同

4、屬或異種、甚至異界的基因連接成為一個(gè)新的遺傳整體，然后再用它感染受體細(xì)胞，復(fù)制出新的遺傳特性的機(jī)體的方法。具體過(guò)程簡(jiǎn)述于下：選擇合適的供體細(xì)胞，將其DNA取出，一般DNA應(yīng)為雙螺旋分子。選擇合適外切酶或限制性的內(nèi)切酶，它能專一地切斷供體細(xì)胞DNA分子的特定部位，并在切斷處形成具有粘著性的末端單鏈（又稱粘接末端）如圖55，使DNA分子在體外進(jìn)行剪接、重組。目前，這類酶已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)幾十種，它們的切點(diǎn)各不相同，可以分別選用，并已制成商品出售?；虻倪\(yùn)載和復(fù)制。大部分DNA片段在細(xì)胞內(nèi)無(wú)自體復(fù)制能力，所以要選擇有自體復(fù)制能力的質(zhì)粒（如R因子，降解質(zhì)粒等）或病毒（如入噬菌體、SV40病毒等）作為載體。取出

5、體稱載體DNA，也用內(nèi)切酶將其切斷并形成粘性末端。在DNA連接酶的作用下，將供體細(xì)胞DNA粘性末端與載體細(xì)胞DNA粘性末端粘著起來(lái)，相應(yīng)的互補(bǔ)堿基對(duì)以氫鍵相聯(lián)，形成一個(gè)新的重組的載體DNA分子。將重組的載體DNA分子加入受體細(xì)胞培養(yǎng)液中，受體細(xì)胞吸入載體，載體在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，使受體細(xì)胞以及后代獲得原供體細(xì)胞的基因和相應(yīng)的新的屬性。整個(gè)過(guò)程如圖56所示。圖55 DNA分子的剪切圖56 基因工程菌構(gòu)建的基本過(guò)程圖解二、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選與鑒定 目的基因是否已轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞必須通過(guò)嚴(yán)格鑒定才能確認(rèn)。目的基因DNA片段是否存在于受體細(xì)胞內(nèi)，一般可通過(guò)聯(lián)合使用分子雜交技術(shù)、基因體外擴(kuò)增技術(shù)和基因DNA序列分析技

6、術(shù)進(jìn)行鑒別。測(cè)定目的基因分子雜交技術(shù)稱為Southern印跡法。它是根據(jù)目的基因DNA堿基數(shù)量和順序，人工合成含有放射性元素標(biāo)記的相應(yīng)DNA片段即分子探針，分子探針的DNA片段能與目的基因的DNA片段發(fā)生互補(bǔ)反應(yīng)，反應(yīng)的產(chǎn)物能在膠片上留下放射性元素感光的痕跡，以此確證與分子探針互補(bǔ)的DNA即為目的基因?；蝮w外擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用是為了增加目的基因的數(shù)量，使分子雜交試驗(yàn)的結(jié)果更為明顯。DNA序列測(cè)定是直接測(cè)試轉(zhuǎn)化細(xì)胞中目的基因DNA片段的堿基數(shù)量和順序。如果測(cè)得的DNA片段中堿基數(shù)量和順序與分子克隆的目的基因DNA片段吻合，即可判定目的基因確實(shí)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)。作為受體菌，一般選擇對(duì)人類無(wú)害，繁殖能

7、力強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快的微生物作為執(zhí)行目的基因功能的使者，如大腸桿菌、枯草桿菌等。三、目的基因的表達(dá) 降解污染物基因經(jīng)確認(rèn)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)，但并不等于該轉(zhuǎn)化細(xì)胞就一定能執(zhí)行表達(dá)目的基因的功能。構(gòu)建基因工程菌的最終目的是為了降解污染物或生產(chǎn)有用物質(zhì)。目的基因的表達(dá)不僅受到重組DNA分了內(nèi)啟動(dòng)子等調(diào)控單元的控制或受到細(xì)胞內(nèi)其他因素的影響，而且受到外界環(huán)境因素的干擾。因此，在分子克隆成功之后，研究目的基因的表達(dá)已成為基因工程中又一關(guān)鍵性環(huán)節(jié)。相關(guān)的基礎(chǔ)研究和配套的工程技術(shù)需要投入相當(dāng)?shù)慕?jīng)費(fèi)、技術(shù)、人力和時(shí)間。四、連續(xù)發(fā)酵與追蹤考察 在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)確認(rèn)轉(zhuǎn)化菌具有高效表達(dá)功能之后，一般應(yīng)用連續(xù)發(fā)酵自控反應(yīng)技術(shù)使獲

8、得的基因工程菌增殖并制成產(chǎn)品，用于具體的污染治理現(xiàn)場(chǎng)?；蚬こ叹哂泄δ芏ㄏ虻奶卣?，對(duì)其性能穩(wěn)定性、遺傳穩(wěn)定性和生態(tài)學(xué)安全性需要進(jìn)行跟蹤考察，經(jīng)嚴(yán)格的鑒定之后，方可正式用于相應(yīng)的環(huán)境微生物工程中。 治理污染基因工程應(yīng)該包括從污染物降解菌株的篩選與目的基因的分離到工程實(shí)施與技術(shù)鑒定的全過(guò)程。而基因工程菌的構(gòu)建即分子克隆操作僅僅是其中的中心環(huán)節(jié)。五、遺傳工程在水污染及環(huán)境工程中的應(yīng)用 由于新的化學(xué)物質(zhì)不斷發(fā)現(xiàn)，每年約有30萬(wàn)種新的物質(zhì)問(wèn)世，其中微生物難降解的污染物日益增多，致使廢水處理日趨復(fù)雜，為了解決這個(gè)問(wèn)題，各國(guó)科學(xué)工作者正試圖利用遺傳工程新技術(shù)，把具有降解某些特殊物質(zhì)的質(zhì)粒剪切后，連接到受體

9、細(xì)胞中，使之用以處理污水中難降解的物質(zhì)。這種用人工方法選出的多質(zhì)粒，多功能的新菌種稱“超級(jí)細(xì)菌”。這方面的研究工作，現(xiàn)舉幾例如下：1. 降解石油的超級(jí)細(xì)菌70年代美國(guó)生物學(xué)家查克拉巴蒂（Chakrabarty）針對(duì)運(yùn)輸石油，使湖泊、江、海面造成溢油，水面浮油影響水生物，破壞水或生態(tài)的情況，研究、開(kāi)發(fā)出這項(xiàng)技術(shù)。當(dāng)時(shí)已知許多微生物有降解原油中某種成份，并依此生長(zhǎng)的能力。但是原油組成復(fù)雜。內(nèi)含各種脂肪烴、芳烴、環(huán)烷烴和多環(huán)芳烴等。通常一種菌僅具有氧化少數(shù)幾種烴能力。如酵母僅能氧化脂肪烴。另外的微生物如假單胞菌、節(jié)桿菌及不動(dòng)桿菌等也可降解原油中的一些成份。如將它們混合培養(yǎng)在一起進(jìn)行原油降解，則由于原

10、油組分復(fù)雜，各組分降解難易程度各異，不同菌種對(duì)石油組分的利用性又差別很大，因降解過(guò)程十分緩慢。為此考慮將各菌種所含降解烴的質(zhì)粒移入到一個(gè)菌株中去。經(jīng)研究比較，選擇銅綠色假單胞菌PAO（Pseudomonas aeruginosa）作為各種質(zhì)粒的受體細(xì)胞，因?yàn)樗瓤山到?6烷以上的烷烴，又可生活在污水環(huán)境種，并且可以轉(zhuǎn)化接受同屬各種的質(zhì)粒。惡臭假單胞菌（P.putida）AC59攜帶CAM-OCT質(zhì)粒，能在巳烷、辛烷和、癸烷中生長(zhǎng)，但在十二烷和十四烷中生長(zhǎng)慢，CAM質(zhì)粒還具有降解萜、菠烴及各種異構(gòu)體的作用。另一菌株AC63在巳烷及辛烷中生長(zhǎng)慢，在十二烷和十四烷中生長(zhǎng)良好，它攜帶DOD質(zhì)粒。把以上

11、三種質(zhì)粒全部轉(zhuǎn)入銅綠色假單胞菌PAO中，這個(gè)菌株能降解C68直鏈脂烴及環(huán)烴。又以類似方法將能降解甲苯、二甲苯及三甲苯衍生物的質(zhì)粒XYL轉(zhuǎn)入銅綠色假單胞菌。此時(shí)該銅綠色假單胞菌便成為帶有多種質(zhì)粒的“超級(jí)細(xì)菌”。它具有降解直鏈脂肪烴、芳烴、萜烴及多環(huán)芳烴的能力，可去除原油中的三分之二烴類。浮油在一般自然條件下降解需1年左右時(shí)間，用了“超級(jí)細(xì)菌”只需幾小時(shí)即可把原油去除。2. 降解染料的質(zhì)粒1983年瑞士科學(xué)家Kulla發(fā)現(xiàn)有兩種假單胞菌，具有降解印染廢水中兩種染料的能力。其一為假單胞菌K24，具有降解1號(hào)橙偶氮染料的質(zhì)粒；其二為假單胞菌K46具有降解2號(hào)橙偶氮染料的質(zhì)粒。他把兩個(gè)菌株進(jìn)行質(zhì)粒接合，

12、形成具有產(chǎn)生兩種酶的細(xì)菌細(xì)胞。結(jié)果該細(xì)胞可獲得具有降解兩種染料的新菌株。3. 分解尼龍寡聚物的微生物尼龍寡聚物在化工廠污水中難被降解。已發(fā)現(xiàn)黃桿菌屬（Flavobacterium）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）和產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）具有分解尼龍寡聚物的質(zhì)粒。但此三個(gè)菌株不易在污水中生長(zhǎng)，而污水中能生長(zhǎng)的大腸桿菌卻無(wú)降解尼龍寡聚物的能力。有人將分解尼龍寡聚物的POAD2基因移植到大腸桿菌中，使大腸桿菌獲得降解尼龍寡聚物的能力。該基因工程操作步驟如下：從黃桿菌內(nèi)提取質(zhì)粒POAD2，同時(shí)在大腸桿菌內(nèi)提取質(zhì)粒PBR322（具抗四環(huán)素和抗氨基青霉素性質(zhì)）。提取的方法是常規(guī)的質(zhì)粒DNA提取法。用限制性內(nèi)切酶Hind，分別酶解POAD2