苯甲醇對紅細胞凍干前海藻糖負載紅細胞影響研究

1、    苯甲醇對紅細胞凍干前海藻糖負載紅細胞影響研究【摘要】  為研究苯甲醇對海藻糖負載紅細胞的影響，在4條件下將紅細胞孵育在濃度分別為10、30、50、100 mmol/L的苯甲醇海藻糖溶液中24小時，用氰化血紅蛋白試劑盒測定海藻糖負載紅細胞的溶血率，用硫酸蒽酮法檢測紅細胞內海藻糖濃度水平。結果表明：在100 mmol/L苯甲醇海藻糖溶液組，其紅細胞內海藻糖濃度為72±12.98 mmol/L，與其它各組相比，有顯著統(tǒng)計學差異（p=0.000）；溶血率為17.99±3.75%，與其它各組相比，有顯著統(tǒng)計學差異（p=0.00

2、0）。結論：苯甲醇可提高海藻糖負載紅細胞的負載率，隨著苯甲醇濃度的升高紅細胞海藻糖負載率也提高，100 mmol/L的苯甲醇濃度為可用濃度。 【關鍵詞】  苯甲醇    Effect of Benzyl Alcohol on Trehaloseloading Red Blood Cells before Lyophilization       Abstract    This study was aimed to evaluate the effect of be

3、nzyl  alcohol on  trehaloseloading red blood cells (RBCs). The RBCs were incubated in 10, 30, 50 and 100 mmol/L concentrations of benzyl alcoholtrehaloe solution at 4 for 24 hours. The hemolysis rate of loaded RBCs was detected by using cyanohemoglobin kit,  the intracellular trehalos

4、e level were assayed by sulfate anthrone method. The results showed that the intracellular trehalose concentration in group with  100 mmol/L benzyl alcohol  was 72±12.98 mmol/L，compared  with that in  groups of 10, 30 and 50 mmol/L, the statistical  difference were sign

5、ificant (p=0.000);  the hemolysis rate of loaded RBCs in group with 100 mmol/L of benzyl alcohol  was 17.99±3.75%, as compared with groups of 10, 30 and 50 mmol/L, the statistical difference  was significant  (p=0.000). It is concluded that benzyl alcohol can enhance the int

6、racellular trehalose concentration. As concentration of benzyl alcohol ascends, the intracellular trehalose concentration increases.100 mmol/L benzyl alcohol may be proper for loading RBCs.    Key words    benzyl alcohol; red blood cell; trehalose    J Ex

7、p Hematol 2007; 15(4):882-884    目前，輸血已成為臨床重要的治療手段之一，據統(tǒng)計，90%的輸血目的是為了補充紅細胞。用現有的紅細胞保存裝備保存費用昂貴，不便運輸，遠遠不能滿足臨床急救和突發(fā)事件或災害事故的救援。凍干紅細胞由于其性能穩(wěn)定，可在常溫下保存，保存時間長，保存費用低廉，易于再水化，輸注方便，以固體干粉劑形式存在，體積小，便于運輸，克服了目前血液保存的局限性，因此凍干紅細胞的保存已成為研究的熱點。    凍干紅細胞的研究已有30多年的歷史，進展緩慢.。2004年，Satpathy等1利用滲透非平衡

8、原理和磷脂膜相變相結合原理將海藻糖導入到紅細胞內。2005年，Satpathy等2將負載海藻糖的紅細胞冰凍干燥，再水化后血紅蛋白回收率達59%。這項研究，為凍干紅細胞的臨床應用邁出了重要一步。2005年，我們在Satpathy實驗的基礎上，改進某些實驗方法，用海藻糖負載紅細胞，并進行凍干保存研究，實驗結果與Satpathy的實驗結果接近。在實驗中我們發(fā)現，優(yōu)化海藻糖負載紅細胞技術，提高細胞內海藻糖濃度，是進一步提高凍干紅細胞回收率的關鍵。苯甲醇為海藻糖負載紅細胞的媒介，可大大提高紅細胞海藻糖負載率，從而提高凍干紅細胞血紅蛋白回收率。    材料和方法 &

9、#160;  試劑    海藻糖、蒽酮購自美國Sigma公司，三氯乙酸、濃硫酸分析純購自北京化工廠，氰化血紅蛋白試劑盒購自北京天來公司。苯甲醇 （純度98%，密度1.04535，分子量108.14，毒性LD 50 mg/kg）購自北京化工廠。    儀器    MP4R低溫離心機（IEC，USA產品），723型分光光度計（上海第三儀器廠產品），SL2數控層析冷柜（北京四環(huán)科學儀器廠產品）。    制備濃集紅細胞    從解放軍307醫(yī)院

10、取3人份新鮮全血，在4條件下，以329×g離心14分鐘，棄上清及白膜（血小板及白細胞）；用等量PBS液清洗3遍，用530×g離心10分鐘，棄上清，制成濃集紅細胞。    海藻糖負載紅細胞    以0.8 mol/L的海藻糖溶液為原液，配制10、30、50、100 mmol/L苯甲醇海藻糖溶液。實驗以苯甲醇溶液濃度為準，分為10 mmol/L組、30 mmol/L組、50 mmol/L組、100 mmol/L組。將每份血均分于5小組，每組3個樣品，濃縮紅細胞與苯甲醇海藻糖負載液以13體積比混勻。每個樣品設立空白對照，

11、紅細胞與不同濃度的苯甲醇溶液以13體積比混勻。樣品放置在4 SL2數控層析冷柜中，負載24小時。    測定負載溶血率    用氰化血紅蛋白試劑盒，測定負載樣品的吸光值，以2 000轉/分鐘離心15分鐘，測定上清的吸光值。溶血率為上清吸光值比負載樣品的吸光值。    細胞內海藻糖量的硫酸蒽酮法測定    負載后的紅細胞離心棄上清，用等滲的PBS清洗3遍，加入3倍體積的10%的三氯乙酸混勻,萃取45分鐘,共2次3。離心后收集上清，取上清1 ml,加入濃度為2%的硫酸蒽酮溶液4

12、ml,煮沸10分鐘, 自然冷卻至室溫，在620 nm波長下測定各樣品吸光值。配制不同濃度的海藻糖標準溶液，繪制標準曲線，計算擬合方程，用擬和方程求出各樣品的海藻糖含量，用溫氏法4測定所萃取紅細胞的壓積，計算紅細胞內海藻糖的濃度。    數據處理    數據用SPSS軟件處理，實驗結果用均值±標準差表示，采用隨機區(qū)組方差分析方法處理實驗數據。    結    果    不同濃度組紅細胞內海藻糖濃度比較   

13、經海藻糖苯甲醇液負載的紅細胞， 紅細胞內海藻糖的濃度是海藻糖負載組內的糖濃度，減去對照組中紅細胞內的糖濃度。實驗結果見附表。結果顯示100 mmol/L組負載紅細胞內海藻糖濃度最高，達72±12.98 mmol/L，與其它各組相比較，有顯著統(tǒng)計學差異（p=0.000）。紅細胞來自9個健康獻血者，45個樣本。    不同濃度組紅細胞溶血率比較    各濃度組溶血率結果見附表。隨著苯甲醇濃度升高，負載紅細胞的溶血率也在增加。在100 mmol/L組，負載紅細胞內溶血率達17.99±3.75%，與其它各組相比較，有顯著統(tǒng)

14、計學差異（p=0.000）。    討    論    紅細胞在冰凍干燥過程中經歷冰凍和干燥兩個過程，目前的紅細胞凍干技術主要無法克服干燥對細胞膜的損傷，其機制主要是干燥升華過程中，細胞膜結構水的去除，使組成細胞膜的磷脂、蛋白結構發(fā)生改變，細胞膜上的蛋白與蛋白、磷脂與蛋白相互作用，造成細胞膜大片融合破裂，細胞內容物的外漏5。而海藻糖可對抗低溫和干燥對紅細胞的損傷6。海藻糖是葡萄糖的二聚體，對人體無任何毒副作用，被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、農業(yè)等行業(yè)7。干燥狀態(tài)，海藻糖在細胞膜周圍形成一層水膜，以替代丟失的結構

15、水膜，維持細胞膜上蛋白、磷脂正常的結構，保持細胞膜的完整性8。研究表明，海藻糖只有分布于細胞膜內外兩側，且細胞內的海藻糖達到100 mmol/L時，才能在低溫和干燥狀態(tài)下發(fā)揮生物學保護作用9。海藻糖是二糖，一般情況下，不能透過細胞膜，而紅細胞也不能合成海藻糖，因此如何將海藻糖導入紅細胞內，是紅細胞冰凍干燥保存的關鍵所在。    2005年，我們利用滲透非平衡原理和磷脂膜相變相結合的原理，將海藻糖導入到紅細胞內冰凍干燥保存，并將負載了海藻糖的紅細胞功能進行一系列評價。在最佳負載條件下，紅細胞內海藻糖的濃度只有40 mmol/L，負載過程中紅細胞溶血率接近20%，而變

16、形性僅有0.0289±0.00738，負載海藻糖的紅細胞冰凍干燥保存后，血紅蛋白回收率約為52%10。細胞內的海藻糖濃度與凍干后紅細胞血紅蛋白回收率正相關，因此提高紅細胞內海藻糖負載率，是優(yōu)化負載技術的重要一步。    苯甲醇由于具有防腐、消毒和輕微的麻醉作用，常被用做食品添加劑和注射針劑的稀釋液。少量的苯甲醇進入人體后被肝臟分泌的酶催化分解為無毒物質而排除體外。目前臨床上所用注射劑中,苯甲醇的安全劑量范圍1%-2%（100 mmol/L換算成百分比濃度小于2%）。苯甲醇還可增加細胞膜的流動性，改善細胞膜的通透性，故用來做為海藻糖負載紅細胞的媒介。實驗研

17、究，苯甲醇濃度為50-60 mmol/L，可增加細胞內膜的流動性，增大苯甲醇濃度，使細胞雙層膜流動性增加，但不影響細胞的黏彈性（變形性），對紅細胞溶血率影響也很小11。本實驗研究了濃度為10、30、50、100 mmol/L苯甲醇對海藻糖負載紅細胞的影響，隨著苯甲醇濃度的增大，細胞內海藻糖濃度逐步增加，苯甲醇濃度為100 mmol/L時，細胞內海藻糖濃度為72±12.98 mmol/L，與其它各濃度組相比較有顯著統(tǒng)計學差異（p=0.000）；苯甲醇濃度為100 mmol/L時，溶血率僅為 17.99±3.75%。綜合苯甲醇的安全性、紅細胞海藻糖負載率和溶血率三方面的因素，100 mmol/L苯甲醇負載濃度，是可用的負載濃度。苯甲醇作為媒介，負載紅細胞的方法值得推廣及進一步研究。    總之，海藻糖為凍干紅細胞的保存帶來了新曙光，但海藻糖導入細胞內技術是紅細胞冰凍干燥保存成功的關鍵一步，現有的海藻糖負載紅細胞技術均有一定局限性。進一步改進負載方法，降低負載過程中紅細胞的溶血率，提高海藻糖的負載率，防止負載過程中紅細胞的變形性下降，仍是今后研究的焦