畢業(yè)論文羅丹明酰肼縮苯甲酰丙酮(馮仕芬)

1、 本科畢業(yè)論文（設計）本科畢業(yè)論文（設計）小分子熒光探針的合成及其對特定小分子熒光探針的合成及其對特定金屬離子的選擇性研究金屬離子的選擇性研究 學學 院：化學與化工院：化學與化工 專專 業(yè)：分析化學業(yè)：分析化學 班班 級：級：20072007 級級 學學 號：號：070701110109070701110109 學生姓名：馮仕芬學生姓名：馮仕芬 指導教師：牟蘭指導教師：牟蘭 2011 年 06 月 02 日貴州大學本科畢業(yè)論文（設計）貴州大學本科畢業(yè)論文（設計）誠信責任書誠信責任書本人鄭重聲明：本人所呈交的畢業(yè)論文（設計） ，是在導師的指導下獨立進行實驗研究所完成。畢業(yè)論文（設計）中凡引用他人

2、已經(jīng)發(fā)表或未發(fā)表的成果、數(shù)據(jù)、觀點等，均已明確注明出處。特此聲明。 論文（設計）作者簽名：馮仕芬 日 期： 2011.6.10 目錄摘要.5Abstract.5第一章 前言.61.1 分子熒光產(chǎn)生的原理.61.2 熒光探針技術.71.3 羅丹明類熒光探針的研究進展.81.4 本文研究背景及工作內(nèi)容.12第二章 實驗部分.142.1 儀器.142.2 試劑以及標準溶液.142.3 實驗方法.152.3.1 配制溶液.152.3.2 光譜分析.152.3.3 熒光量子產(chǎn)率的測量方法.152.4 實驗步驟.152.4.1 溶劑比例的選擇.152.4.2 緩沖溶液的用量.152.4.3 pH 的選擇.

3、162.4.4 探針 1 對金屬離子的選擇性.162.4.5 共存離子對探針 1 和 Fe3+、探針 1 和 Cu2+的干擾效應.162.4.6 job 法測探針 1 和 Fe3+、探針 1 和 Cu2+的作用比.162.4.7 摩爾法測探針 1 和 Fe3+、探針 1 和 Cu2+的作用比.162.4.8 液相色譜法分析探針 1 和金屬離子的作用.172.4.9 紅外光譜測定和核磁譜測定.172.4.10 探針 1 檢測的 Fe3+分析參數(shù).1717第三章 實驗結(jié)果與討論.183.1 溶劑比例的選擇.183.2 pH 的選擇.193.3 緩沖溶液的用量選擇.203.4 探針 1 對金屬離子的

4、選擇性.203.5 共存離子對探針 1 和 Fe3+、探針 1 和 Cu2+的干擾效應.213.6 job 法和摩爾比法測探針 1 和 Fe3+、探針 1 和 Cu2+的相互作用比.223.7 探針 1 檢測的 Fe3+、Cu2+分析參數(shù).223.8 光譜分析.233.9 可逆性分析.243.10 樣品測定.253.11 結(jié)論.25參考文獻.27致謝.28小分子熒光探針的合成及其對特定金屬離子的選擇性研究小分子熒光探針的合成及其對特定金屬離子的選擇性研究 摘要摘要設計合成具有探針性質(zhì)的小分子席夫堿羅丹明酰肼縮苯甲酰丙酮，利用核磁、質(zhì)譜、紅外光譜、元素分析以等技術對目標化合物結(jié)構(gòu)進行表征。在目標

5、化合物的乙醇-水緩沖溶液中，加入Fe3+和Cu2+后能誘導羅丹明基團螺環(huán)結(jié)構(gòu)開環(huán)，形成金屬配合物。加入Fe3+觀察到顯著的熒光增強并具有較高的選擇識別性能；同等條件下加入Cu2+ 可以觀察到紫外吸收增強并具有較高的選擇性能。色譜及光譜分析證實了配合物的形成。競爭實驗顯示識別響應為可逆過程。關鍵詞：苯基酰肼縮苯甲酰丙酮；羅丹明B衍生物；熒光-比色探針；Fe3+配合物；Cu2+配合物。The recognition properties for Fe3+ and Cu2+ of a new Rhodamine B Schiff-base AbstractA simple structure rho

6、damine fluorescent derivative was synthesized facilely by one step condensation reaction of rhodamine B ethylenediamine and phenyl-acetylacetone. Its structure was characterized by NMR, IR and Elemental analysis. In the ethanol aqueous medium (4:1, V:V, Tris-HCl buffer, pH=6.5), the presence of Fe3+

7、 induced the formation of a 1:1 complex of Fe3+-1, observing significant enhancement of fluorescence and absorption.Besides, In the ethanol aqueous medium (4:1, V:V, Tris-HCl buffer, pH=6.5), the presence of Cu2+ induced the formation of a 1:1 complex ofCu2+-1, observing significant enhancement of u

8、ltraviolet and absorption.And it displayed high recognition properties for the detection of Fe3+ and Cu2+ .The results show that the derivative not only a good fluorescence and colorimetric chemosensor for Fe3+ and Cu2+, but also a metal complex fluorescent probe for BSA. Keywords: Phenyl-acetylacet

9、one; Rhodamine B derivative; Fluorescent and colorimetric chemosensor; Fe3+ complex；Cu2+ complex第一章第一章 前言前言1 1. .1 1 分分子子熒熒光光產(chǎn)產(chǎn)生生的的原原理理熒光分析法是一種靈敏度極高的光譜分析方法，具有熒光壽命、熒光量子產(chǎn)率、激發(fā)峰波長等多種參數(shù)，因而具有較好的選擇性。16 世紀西班牙內(nèi)科醫(yī)生和植物學家 N.monardes 第一次觀察記錄了熒光現(xiàn)象。17 世紀 Boyle 和Newton 等科學家再次觀察到熒光現(xiàn)象，并給予了較為詳細的記錄。直到 1852年 Stokes 在考察奎

10、寧和葉綠素的熒光時，首先確定和報告了他們的熒光波長總比激發(fā)波長要長。他通過研究熒光強度和熒光物質(zhì)濃度的關系，發(fā)現(xiàn)在高濃度時熒光會猝滅，在外來物質(zhì)的作用下熒光也會猝滅，從而建議利用熒光作為檢測手段。在紫外可見光的照射下，某些分子吸收特征頻率的光子后由電子基態(tài)振動能級躍遷到電子激發(fā)態(tài)振動能級，然后先以非輻射的形式釋放能量，回到最低激發(fā)態(tài)最低振動能級，最后以光輻射的方式釋放剩余的能量回到基態(tài)，此時發(fā)出的光即為熒光。電子能態(tài)具有基態(tài)和激發(fā)態(tài)兩種，各能態(tài)又具有單重態(tài)和三重態(tài)兩種類型。S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和，其數(shù)值為0或l。S為0時，分子內(nèi)軌道中的所有電子自旋配對，自旋方向相反，此時分子處于單重態(tài)，大

11、多數(shù)有機物分子的基態(tài)是處于單重態(tài)。分子吸收光能后，電子由低能態(tài)躍遷到高能態(tài)，電子自旋方向不變，此時分子處于激發(fā)單重態(tài)。S1，S2，S3.分別表示分子的基態(tài)和第一，第二.激發(fā)單重態(tài)，能量由低到高。如果處于基態(tài)單重態(tài)的電子在躍遷過程中伴隨有電子自旋方向的變化，那么在激發(fā)態(tài)分子軌道中的兩個電子自旋不配對，此時S=1。分子處于激發(fā)態(tài)的三重態(tài)，用T表示，T1，T2分別表示三重態(tài)的第一第二激發(fā)態(tài)。分子中的電子從基態(tài)S0躍遷到激發(fā)態(tài)S1，S2比較容易發(fā)生，速度很快(約10-4s)，而從基志單重態(tài)到激發(fā)三重態(tài)不易發(fā)生。高能量的單重態(tài)激發(fā)態(tài)分子(如S2)可以與其它同類分子或溶劑分子碰撞通過內(nèi)轉(zhuǎn)換回到激發(fā)態(tài)的最低

12、能級Sl，這一過程為10-12 s，處于激發(fā)態(tài)最低能級的分子壽命一般為10-410-8 s，它們會釋放出光子而返回到基態(tài)，這時產(chǎn)生的光就是熒光。從Sl到Tl能量轉(zhuǎn)化是系間跨越。從Tl到S0有兩種過程：一個是能量的釋放；另一個是放出光子，即磷光，在10-410s間完成。處于激發(fā)態(tài)的分子，可以通過不同途徑（振動弛豫，內(nèi)轉(zhuǎn)換，外轉(zhuǎn)換，系間跨躍，熒光發(fā)射，磷光發(fā)射)回到基態(tài)，哪種途徑的速度快，哪種途徑就優(yōu)先發(fā)生。 如果發(fā)射熒光使受激分子去活化過程與其他過程相比較快，則熒光發(fā)生幾率高，強度大。 如果發(fā)射熒光使受激分子去活化過程與其他過程相比較慢，則熒光很弱或不發(fā)生。產(chǎn)生熒光的條件：第一個必要條件是該物質(zhì)

13、的分子必須具有能吸收激發(fā)光的結(jié)構(gòu)，通常應該具有共軛結(jié)構(gòu)；第二個條件是該分子必須具有一定程度的熒光量子效率，即熒光物質(zhì)吸光后所發(fā)射的熒光量子數(shù)與吸收的激發(fā)光的量子數(shù)的比值。1.2 熒光探針技術分子識別是自然界一切生命現(xiàn)象的共同基礎,是有目標的結(jié)合,它是通過一系列結(jié)構(gòu)確定的分子間相互作用而組成的模式識別過程1。識別過程可能引起體系的光學、電學、顏色等性質(zhì)的變化，這些變化意味著化學信息的存儲、傳遞及處理。在分子識別領域中，具有分子器件性質(zhì)的熒光探針通過與目標物質(zhì)選擇性鍵合,結(jié)合前后的很多熒光參數(shù)發(fā)生變化。這種微觀領域的相互作用通過熒光信號表現(xiàn)出來,從而實現(xiàn)在分子水平上的原位實時檢測2，達到對金屬離子

14、、有機分子、生物大分子等很多物質(zhì)的特效識別。由于熒光分析的高靈敏和高選擇性，并能提供豐富的光譜信息，在分析化學、生物化學、環(huán)境科學、材料科學、醫(yī)藥等領域具有廣泛的應用前景。利用探針分子與非熒光或弱熒光物質(zhì)以共價或其他形式結(jié)合形成發(fā)熒光的絡合物或聚集體進行測定，即所謂“熒光探針”技術。它是一種利用探針化合物的光物理和光化學特征，在分子水平上研究某些體系的物理、化學過程和檢測某種特殊環(huán)境材料的結(jié)構(gòu)及物理性質(zhì)的方法。在醫(yī)藥學上，熒光探針可用于標記蛋白質(zhì)分子、檢測 DNA，可應用于腫瘤學、免疫學、血液學、藥物學、臨床檢測等方面。探針分子的識別性能主要受其分子結(jié)構(gòu)的影響，通過從分子骨架、配位原子及發(fā)光基

15、團的選擇設計來提高響應的專一性，利用配合物形成的離子誘導及競爭結(jié)合等熒光增強機理實現(xiàn)響應靈敏度的增強。經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾，改善了探針分子的整體結(jié)構(gòu)，從而改善傳統(tǒng)熒光染料在選擇性、適應性方面的不足，使其具有更高靈敏度、更高選擇性和可靠性，更加有利于分析檢測。熒光探針通常是由熒光基團和識別基團(受體)兩部分組成。熒光基團是熒光探針分子的最基本組成部分，用于將客體的識別信息轉(zhuǎn)化為熒光信號的作用。熒光識別基團必須含有一定的共軛度，因為共軛雙鍵使其容易吸收激發(fā)光，其激發(fā)波長多處于近紫外區(qū)或可見光區(qū)，發(fā)射波長多處于可見光區(qū)，所以共軛 鍵的存在使其發(fā)出強而穩(wěn)定的熒光。具萘、蒽、芘、對苯二醌、苯并雜環(huán)及含有呫噸酮的

16、基團等是常見的熒光基團。有些有機熒光分子本身就可以與金屬離子配位形成配合物，并表現(xiàn)出顯著的熒光變化，這些熒光分子可直接作為探針使用，如 8-羥基喹啉。識別基團(受體)通過與目標物質(zhì)選擇性的鍵合，再將這種微觀領域的作用通過熒光信號表現(xiàn)出來，從而達到某些離子或分子的特效識別。金屬離子、有機分子、生物大分子(如多肽、蛋白、核苷酸)等很多物質(zhì)都可以用熒光探針方便快速地檢測。部分受體與金屬離子的選擇性結(jié)合主要由雜原子(氧，硫，氮等)與金屬離子的配位作用，和受體分子孔穴的相對尺寸決定。受體空腔及雜原子的不同，表現(xiàn)出對不同的金屬離子顯著的選擇性。熒光分子探針中常用的識別基團有冠醚3、開鏈聚醚4、多乙烯多胺5

17、、環(huán)糊精6、杯芳烴7、多肽等。作為熒光探針應該具有以下特點8：第一，熒光探針的熒光必須與被測樣品的背景熒光易于區(qū)別；第二，熒光探針必須不干擾研究的主體；第三，熒光探針主要用于生物活體或在天然生物條件下的體外樣品的研究，所以熒光探針的毒性、使用的pH范圍，生物相容性等方面都有嚴格的要求。 目前常見的金屬離子熒光試劑主要有席夫堿、冠醚、熒光素、羅丹明、腙類、蒽酮類、羥基哇啉等類型。探索設計與合成具有分子探針和分子光開關功能的新型分子傳感材料，研究其識別性質(zhì)，具有重要的科學意義和廣闊的應用前景。分子傳感器是分子識別研究的一種應用形式，在環(huán)境或生物微觀系統(tǒng)的組織和結(jié)構(gòu)探索方面有著重要應用前景，成為當今

18、分析化學領域中最有生命力和探索空間的研究熱點之一。熒光傳感器以其靈敏度高、使用方便、對客體的高度選擇性識別等優(yōu)點成為各種分子、離子的重要檢測手段。1 1. .3 3 羅羅丹丹明明類類熒熒光光探探針針的的研研究究進進展展羅丹明是一類咕噸類染料，由于在不同的pH介質(zhì)中會結(jié)合質(zhì)子而呈陽離子狀態(tài)存在于溶液中，所以也稱羅丹明染料為堿性染料。其中最著名的是羅丹明B，除此之外，還包括羅丹明G，羅丹明123，羅丹明110。羅丹明B具有高的摩爾吸收系數(shù)和較大的熒光量子產(chǎn)率，水溶性好，無毒，制備成本低等優(yōu)點。因此，羅丹明B及其衍生物是一類較好的熒光探針，在研究生物分子結(jié)構(gòu)及功能，核酸雜交分析和免疫等方面得到廣泛的

19、應用。由于分子內(nèi)苯環(huán)間是以氧橋的連接，使分子具有剛性共平面結(jié)構(gòu)，分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增強，在激發(fā)光的作用下產(chǎn)生強烈的熒光。在可見光區(qū)，它們是一類非常好的熒光染料。其單體水溶液能發(fā)出很強的熒光，在不同的溶劑、pH值、溫度和濃度條件下，羅丹明染料在溶液中主要有以下幾種存在形式：中性分子、離子形式、內(nèi)酯、二聚體或四聚體。如圖1所示，羅丹明B在酸性條件下，以醌式(quinone form)結(jié)構(gòu)存在，有熒光，而在中性或堿性條件下，形成螺環(huán)(spirolaetam form)結(jié)構(gòu)，熒光減弱至消失。ONORNR2R2NONR2R2NOH-OH-closed form式 式 式 式open form式 式 式 式O

20、NR 圖1近年來，羅丹明的內(nèi)酰胺螺環(huán)狀結(jié)構(gòu)成為研究的熱點：羅丹明的內(nèi)酰胺螺環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在長波長處無熒光吸收，無色：如果改變內(nèi)酰胺螺環(huán)狀結(jié)構(gòu)，它的熒光性質(zhì)發(fā)生改變，即在長波長處有強的熒光吸收，有顏色。由于羅丹明類化合物結(jié)構(gòu)具有易修飾的特點，羅丹明內(nèi)酰胺類化合物具有形成“OFF-ON型熒光探針的潛能。一般以羅丹明作為母體進行設計，使它形成具有酰胺螺環(huán)狀結(jié)構(gòu)的化合物，此時它是在長波長處無吸收，無色，無熒光，當它與底物相互作用的時候，內(nèi)酰胺螺環(huán)狀結(jié)構(gòu)被破壞而打開，這時它在長波長有吸收，有顏色，強熒光。利用此原理對羅丹明進行設計合成探針分子，此類探針已被用于許多金屬離子、生物活性物質(zhì)及生物分子的檢測。羅丹

21、明內(nèi)酰胺類熒光探針對金屬離子的選擇性識別，實質(zhì)就是金屬離子與探針分子產(chǎn)生絡合作用，誘導探針的螺環(huán)結(jié)構(gòu)打開，從而產(chǎn)生熒光信號。此類探針的誘導開環(huán)機理存在兩種形式：一種是不可逆開環(huán)，金屬離子通過與探針分子絡合誘導螺環(huán)打開，從而發(fā)生化學反應，形成新的能發(fā)出熒光信號的化合物。另一種是可逆開環(huán)，通過金屬離子與探針分子絡合，誘導螺環(huán)打開，形成發(fā)出熒光的醌式結(jié)構(gòu)，如有更強的絡合劑與金屬離子結(jié)合，此過程則向逆方向進行。ONORNR2R2NguestONORNR2R2Nclosed form式 式 式 式open form式 式 式 式2007年，Xiang 等研究發(fā)現(xiàn)室溫下羅丹明B酰肼在酸性條件下可用于檢測C

22、r6+的濃度，檢出限低，樣品檢測實驗結(jié)果表明，此探針對于飲用水中Cr6+含量的的檢測具有重要應用。 圖1.2 羅丹明B內(nèi)酰胺(RBH)的結(jié)構(gòu)式 Yu Xiang, Ling Mei, Na Li, Aijun Tong, Sensitive and selective spectrofluorimetric determination of chromium(VI) in water by fluorescence enhancement. Analytica Chimica Acta 581 (2007) 1321362009年，Chen等設計合成了探針2，該探針對Cu2+具有較高的選擇性和

23、靈敏度識別。并通過加入競爭性試劑，證明該過程是不可逆的。1.Chen X Q, Jia J, Ma H M, Wang S J, Wang X C. Characterization of rhodamine B hydroxylamide as a highly selective and sensitive fluorescence probe for copper(II)J. Analytica Chimica Acta, 2009, 632: 9-142005年，Jinsung Tae12等人利用汞離子催化氨基硫脲形成1, 3, 4-噁二唑酮的原理合成一種新的熒光探針，可用于檢測汞離子

24、。該熒光探針具有較快的響應時間，向溶液中加入汞離子后，溶液瞬間變成紅色，并產(chǎn)生黃色的熒光。Zhang等 以羅丹明6G為基礎，研究合成了探針8。Fe3+的加入引起羅丹明的螺環(huán)結(jié)構(gòu)打開，體系呈現(xiàn)出明顯的熒光增強。 Lizhu Zhang, Jiangli Fan, Xiaojun Peng,X-ray crystallographic and photophysical properties of rhodamine-based chemosensor for Fe3+. Spectrochimica Acta Part A 73 (2009) 3984022006年，Chunying Duan1

25、3等人在羅丹明6G酰肼上接上吡啶醛實現(xiàn)了選擇性檢測汞離子。2007年，Yoon14等人設計合成尿素基團的羅丹明衍生物9和10，在乙腈溶液中成功的選擇性識別了汞離子。1997年，Czarinik15等合成了羅丹明B酰肼，其可以選擇性識別銅離子，該熒光探針是基于銅離子催化羅丹明B酰肼水解生成強熒光的羅丹明B分子的。2006年，Aijun Tong16等人合成水楊醛羅丹明B酰腙，可以可逆性的熒光增強識別銅離子。也就是說，在緩沖溶液中，當加入銅離子時，內(nèi)酰胺螺環(huán)狀結(jié)構(gòu)被打開，吸收和熒光增強，當加入絡合劑EDTA時，化合物表現(xiàn)出沒有吸收和熒光，而在此時再加入銅離子，熒光恢復。2006年，Tong17等人

26、利用二乙基三胺將兩個羅丹明B連接起來，從而形成無色，沒有熒光的羅丹明B的衍生物，三價鐵離子的加入，導致其內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)的開環(huán)，熒光增強，從而實現(xiàn)了對三價鐵離子的檢測。2007年，Tae和Bae18等人用兩步簡單合成的探針18，以羥甲氧基為識別基團的羅丹明衍生物。據(jù)介紹，羥甲氧基基團能夠調(diào)節(jié)羅丹明內(nèi)酰胺的開環(huán)與閉環(huán)之間的平衡，加入Fe3+離子，熒光強度快速增加而且溶液為紫紅色?；诹_丹明的閉環(huán)(OFF)到開環(huán)(ON)這個機理，同年Huang19等人合成了羅丹明酰腙衍生物19，成功的識別Fe3+離子，而且能檢測細胞中的Fe3+。2007年，weisheng Liu20等設計合成了兩個修飾羅丹明的探針，

27、能夠分別在純水中高選擇性的識別Fe3+和Cr3+，包括Cd2+在內(nèi)的其它離子都沒有干擾。從以上的文獻綜述中，可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)修飾的羅丹明類探針一般都具有較高的選擇性、靈敏性。此外，在分子識別的過程中，此類探針的識別性質(zhì)不僅可以通過熒光信號來進行檢測，而且伴隨識別過程其吸收顏色會產(chǎn)生紅移，進入可見光范圍內(nèi)，因此這類探針還可以用作比色化學傳感器，通過“肉眼”來進行檢測。更具發(fā)展前景的是，此類探針的熒光分子開關性質(zhì)，它們可以用來檢測生物活性細胞內(nèi)的金屬離子，在研究金屬離子的生物效應方面有著廣闊的應用前景。1.41.4 本文研究背景及工作內(nèi)容本文研究背景及工作內(nèi)容鐵是地殼中含量排名第二位的金屬，是生物系統(tǒng)

28、中最重要的金屬之一。三價鐵是構(gòu)成蛋白、細胞色素和多種酶的基本元素，對細胞的新陳代謝起著至關重要的作用。對血液、生物組織等樣品中微量鐵離子的精確測定是研究其吸收代謝機制的基礎。設計結(jié)構(gòu)簡單、性能優(yōu)越的鐵離子探針以滿足各種測試的需要。本實驗主要是設計合成了一種小分子熒光探針羅丹明酰肼縮苯甲酰丙酮：通過苯甲酰丙酮與羅丹明酰肼的分子間縮合反應，一步合成了結(jié)構(gòu)簡單的羅丹明內(nèi)酰胺類熒光探針。研究了探針對Fe3+可見吸收增強和熒光增敏的響應性能，并用多種方法探討了Fe3+和Cu2+探針配合物的形成，對探針的傳感性能進行了考察。1在不同的 pH 值條件下，羅丹明類熒光探針表現(xiàn)出不同的性質(zhì)。在酸性條件下，由于羅

29、丹明開環(huán)引起強烈的質(zhì)子化，羅丹明類熒光探針呈現(xiàn)出顯色現(xiàn)象及明顯的熒光增強效應，而在中性及堿性條件下時，顏色及熒光強度均無明顯的變化。因此 pH 值的選擇對于羅丹明類熒光探針的識別性質(zhì)起著至關重要的作用。本文中通過條件實驗選擇了探針的最佳 pH 值及溶劑比。2. 在上述選定的最佳條件下，通過熒光光譜及紫外可見吸收光譜分別考察了探針對金屬離子識別的選擇性，用等摩爾連續(xù)變化法及摩爾比法研究了探針與金屬離子的作用比，測定了探針對金屬離子檢測的線性范圍及檢出限等分析參數(shù)，并且考察了其他金屬離子共存對此探針響應的影響。3. 通過實驗觀察探針和探針-金屬離子體系的1H NMR 譜圖、紅外特征光譜、液相色譜分

30、別探討了探針識別金屬離子的作用機理，推測了配合物形成的作用模式。4. 研究了探針體系與牛血清蛋白的相互作用。小分子熒光探針羅丹明酰肼縮苯甲酰丙酮的合成及其小分子熒光探針羅丹明酰肼縮苯甲酰丙酮的合成及其傳感性能的研究傳感性能的研究摘要摘要 設計合成具有探針性質(zhì)的小分子席夫堿羅丹明酰肼縮苯甲酰丙酮，利用核磁、質(zhì)譜、紅外光譜、元素分析以等技術對目標化合物結(jié)構(gòu)進行表征。在目標化合物的乙醇-水緩沖溶液中，加入Fe3+和Cu2+后能誘導羅丹明基團螺環(huán)結(jié)構(gòu)開環(huán)，形成金屬配合物。加入Fe3+觀察到顯著的熒光增強并具有較高的選擇識別性能；同等條件下加入Cu2+ 可以觀察到紫外吸收增強并具有較高的選擇性能。色譜及

31、光譜分析證實了配合物的形成。競爭實驗顯示識別響應為可逆過程。關鍵詞關鍵詞：苯基酰肼縮苯甲酰丙酮；羅丹明B衍生物；熒光-比色探針；Fe3+配合物；Cu2+配合物。前言前言分子識別是自然界一切生命現(xiàn)象的共同基礎,是有目標的結(jié)合,它是通過一系列結(jié)構(gòu)確定的分子間相互作用而組成的模式識別過程1。識別過程可能引起體系的光學、電學、顏色等性質(zhì)的變化，這些變化意味著化學信息的存儲、傳遞及處理。在分子識別領域中，具有分子器件性質(zhì)的熒光探針通過與目標物質(zhì)選擇性鍵合,結(jié)合前后的很多熒光參數(shù)發(fā)生變化。這種微觀領域的相互作用通過熒光信號表現(xiàn)出來,從而實現(xiàn)在分子水平上的原位實時檢測2，達到對金屬離子、有機分子、生物大分子

32、等很多物質(zhì)的特效識別。由于熒光分析的高靈敏和高選擇性，并能提供豐富的光譜信息，在分析化學、生物化學、環(huán)境科學、材料科學、醫(yī)藥等領域具有廣泛的應用前景。目前常見的金屬離子熒光試劑主要有席夫堿、冠醚、熒光素、羅丹明、腙類、蒽酮類、羥基哇啉等類型。由于羅丹明類熒光探針最大吸收和發(fā)射波長較長，受樣品背景干擾相對較少，因而羅丹明熒光衍生物在熒光標示與識別領域得到了廣泛應用3,4。其對金屬離子的選擇性識別大多是通過金屬離子與探針分子產(chǎn)生絡合作用，誘導羅丹明的螺環(huán)開環(huán)，從而伴隨光譜信號變化5。對過渡金屬、重金屬離子響應的熒光增強型羅丹明類探針已有報道6-10。有利用二乙烯三胺聯(lián)接羅丹明基團得到的雙羅丹明結(jié)構(gòu)

33、的對 Fe3+響應的探針11；或通過羅丹明與氨基吡啶縮合得到對 Fe3+及過渡金屬離子響應的探針12；也有用羅丹明 6G 的乙二胺衍生物與水楊醛縮合，再經(jīng)還原后得到羅丹明氨基酚衍生物的 Fe3+響應探針13。探索設計與合成具有分子探針和分子光開關功能的新型分子傳感材料，研究其識別性質(zhì)，具有重要的科學意義和廣闊的應用前景。探針分子的識別性能主要受其分子結(jié)構(gòu)的影響，通過從分子骨架、配位原子及發(fā)光基團的選擇設計來提高響應的專一性，利用配合物形成的離子誘導及競爭結(jié)合等熒光增強機理實現(xiàn)響應靈敏度的增強。經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾，改善了探針分子的整體結(jié)構(gòu)，從而改善傳統(tǒng)熒光染料在選擇性、適應性方面的不足，使其具有更高靈

34、敏度、更高選擇性和可靠性，更加有利于分析檢測。分子傳感器是分子識別研究的一種應用形式，在環(huán)境或生物微觀系統(tǒng)的組織和結(jié)構(gòu)探索方面有著重要應用前景，成為當今分析化學領域中最有生命力和探索空間的研究熱點之一。熒光傳感器以其靈敏度高、使用方便、對客體的高度選擇性識別等優(yōu)點成為各種分子、離子的重要檢測手段。本實驗主要是設計合成了一種小分子熒光探針羅丹明酰肼縮苯甲酰丙酮：通過苯甲酰丙酮與羅丹明酰肼的分子間縮合反應，一步合成了結(jié)構(gòu)簡單的羅丹明內(nèi)酰胺類熒光探針。研究了探針對Fe3+可見吸收增強和熒光增敏的響應性能，并用多種方法探討了Fe3+和Cu2+探針配合物的形成，對探針的傳感性能進行了考察。1 實驗部分實

35、驗部分1.1 儀器與試劑儀器與試劑Varian Cary Eclipse 熒光分光光度計；Amersham Biosciences Ultrospec 5300 pro 紫外-可見分光光度計；Bruker Vertex 70 FT-IR紅外光譜儀；Varian Nova-400核磁共振波譜儀；Agilent LC/MSD質(zhì)譜儀；BAS EC Epsilon電化學分析儀，使用靜汞電極為工作電極，鉑絲為輔助電極，Ag/AgCl為參比電極。Shimadzu LC-20A HPLC儀，SPD-M20A二極管陣列紫外檢測器，320 nm為檢測波長，ODS-SP 柱 (5 m, 4.6250 mm)，流動

36、相為95%甲醇-水溶液；Bruker Smart Apex2 單晶衍射儀；X-5型顯微熔點測定儀（溫度未校正） 。牛血清蛋白(BSA , Solarbio Company)，所有藥品均為分析純，金屬離子溶液由其硝酸鹽或鹽酸鹽配制。實驗用水為二次蒸餾水。1.2 羅丹明酰肼縮苯甲酰丙酮的合成羅丹明類探針可由羅丹明芳環(huán)修飾或通過羅丹明內(nèi)酯縮合生成內(nèi)酰胺，酰胺再與醛縮合得到席夫堿。本文以羅丹明酰肼與苯甲酰丙酮一步縮合生成目標產(chǎn)物。合成線路如圖 1 所示。OOreflux 24h1OEt2NNEt2NOCH3ONOEt2NNEt2NONH2圖 1稱取羅丹明酰肼(2.0 g，4 mmol)，苯甲酰丙酮(0

37、.74 g，4 mmol)，量取無水乙醇 100 mL，加至 250 mL 的圓底燒瓶中，在氮氣氛圍下攪拌回流反應 24 h。反應完全后，減壓濃縮反應液，冷卻后過濾得黃色固體。將該固體用氯仿/乙醇重結(jié)晶，得 1.8 g 淺紅色化合物(1)，產(chǎn)率 68 %。1H NMR (400MHz, CDCl3) : 1.17(t, 12H, NCH2CH3), 1.67(s, 3H, CCH3), 2.09(s, 2H, CH2CO), 3.343.39(m, 8H, NCH2CH3), 5.68(s, 1H, ArH), 6.376.39(d, 3H, ArH), 6.506.52(d, 2H, ArH

38、), 7.197.21(d, 1H, ArH), 7.347.38(m, 2H, ArH), 7.41 (s, 1H, ArH), 7.567.65(m, 2H, ArH), 7.727.74(d, 2H, ArH), 7.947.95(d, 1H, ArH), 11.63(s, 1H, HC=N); IR (KBr) : 3137cm-1, 2967cm-1, 2929cm-1, 1713cm-1; ESI-MS m/z: (ESI: 617.7 M+H+, 638.7 M+Na+). Anal. calcd for C40H44N4O3: C 76.0, H 7.19; N 9.08, O

39、 7.78; found(%):C 76.05, H 7.16; N 8.90, O 7.64.1.3 實驗方法實驗方法1.3.1 標準溶液的配置探針儲備液(1.0010-4 molL-1)：稱取6.0 mg化合物，乙醇溶解，配制成100 mL溶液。 Fe3+儲備液(2.0010-3 molL-1)：稱取80.8 mg Fe(NO3)39H2O，二次蒸餾水溶解，配制成100 mL溶液。 Cu2+儲備液(2.0010-3 molL-1)：稱取48.32mgCu(NO3)2.3H2O，二次蒸餾水溶解，配制成100 mL溶液。 其他金屬離子均配制成二次蒸餾水溶液(2.0010-3 molL-1)。

40、Tris-HCl乙醇-水緩沖溶液(4.010-3 molL-1, pH=6.5)：取0.004 molL-1Tris及適量的HCl相混合，調(diào)節(jié)pH值至所需。配制1.010-4 gmL-1的BSA標準溶液備用，BSA標準液在04冰箱中保存。1.3.2 測量過程測量過程在10.0 mL容量瓶中依次加入探針儲備液(1.0010-4 molL-1，08.0 mL)， Tris-HCl 緩沖溶液(4.0010-3 molL-1，1.0 mL)，F(xiàn)e3+儲備液(2.0010-3 molL-1，08.0 mL)、Cu2+儲備液(2.0010-3 molL-1，08.0 mL)及其他金屬離子。用乙醇-水溶液(

41、1/4，V/V)稀釋至刻度，搖勻，放置一定時間，測量熒光和吸收光譜及強度。熒光光譜測定的激發(fā)/發(fā)射波長為557/577 nm。1.3.3 熒光量子產(chǎn)率的測量方法熒光量子產(chǎn)率的測量方法以羅丹明B為標準，濃度為0.1 gmL-1（2.0810-7 molL-1） ，在557 nm的波長下，控制體系pH為6.5左右，分別測量待測物（5.0010-5 molL-1探針，9.0010-5 molL-1 Fe3+）和標準物的熒光積分面積和該波長下紫外吸收的吸光度。由公式可以計算得熒光量子產(chǎn)率14。2 結(jié)果與討論結(jié)果與討論2.1 實驗條件的選擇2.1.1 pH的選擇通常，螺環(huán)結(jié)構(gòu)的羅丹明衍生物不產(chǎn)生熒光，而

42、開環(huán)后能產(chǎn)生較強的熒光。實驗采用乙醇-水溶液為介質(zhì)，進行了酸度滴定實驗（圖 2） 。2345678902004006008001000pHFluorescence Intensity 1+Fe3+ 1+Cu2+ 1234567890.00.20.40.60.81.01.2AbsorbancepH 1+Fe3+ 1+Cu2+ 1 (a) (b)圖 2(a)不同酸度下探針 1 (10 M)、Fe2+探針配合物、Cu2+探針配合物的熒光強度變化曲線。(b)不同酸度下探針 1 (10 M)、Fe2+探針配合物、Cu2+探針配合物的吸收強度變化曲線。結(jié)果表明，pH 6.5 的條件下 Fe2+探針配合物無

43、明顯的熒光；pH 對 Fe2+探針配合物的紫外吸收無明顯的影響。pH 6.5 時，Cu2+探針配合物的熒光強度減小但效果不明顯，然而體系的紫外吸收明顯降低。因此為了研究的一致性，本實驗采用 Tris-HCl 緩沖溶液控制體系的 pH=6.5。2.1.2 溶劑比的選擇實驗結(jié)果表明，在一定的條件下，體系的熒光強度隨著體系的含水量的增加而增強，當體系的含水量在 60%80%時，F(xiàn)e2+探針配合物的體系熒光最強。為了將這一探針用于生物研究，本實驗選擇乙醇-水溶液為 1/4(v/v)的體系進行研究。010020030040050060010%20%30%40%50%60%70%80%Fluorescen

44、ce IntensityH2O%90%圖 3 Fe2+（200 M）存在下探針 1 (10 M)在 Tris-HCl 緩沖體系(pH=6.5)的不同溶劑體系中的熒光強度的變化(557nm)。2.2 離子識別性能在 pH 5.010.0 的乙醇-水溶液 (1:4，V:V)介質(zhì)中，探針在可見光區(qū)無吸收，在 557 nm 激發(fā)波長下不產(chǎn)生明顯的熒光發(fā)射。實驗選擇 Tris-HCl 緩沖溶液控制體系 pH 為 6.5 左右，在該條件下，F(xiàn)e3+的加入使探針溶液的熒光顯著增強。Cu2+的加入可引起體系熒光強度的較弱變化，其它金屬離子加入后體系基本無變化。而在一定的光照條件下，Cu2+的加入能使體系紫外吸

45、收強度變化顯著，體系由無色變?yōu)樽霞t色。除 Fe3+的加入可引起體系的較弱變化外，其它的實驗金屬離子 Na+，Mg2+，Ca2+ ，Mn2+ ，Co2+，Zn2+，Sr2+，Cd2+，Hg2+，Ni2+對探針均無明顯的響應信號（圖 4） 。且隨著 Fe3+及 Cu2+濃度的增大，體系的熒光強度和可見吸收強度也逐漸增強。這一特殊的實驗現(xiàn)象表明，利用熒光或可見光譜可實現(xiàn)探針 1 對 Fe3+及 Cu2+的分別檢測。體現(xiàn)了這一結(jié)構(gòu)的探針對金屬離子優(yōu)越的選擇性識別響應性能。4505005506006507000100200300400500600700other metal ionsCu2+Fe3+Fl

46、uorescence IntensityWavelength(nm)4505005506000.00.20.40.60.81.0other metal ionsFe3+Cu2+Wavelength(nm)Absorbance圖 4 (a) 探針探針 1 (1.0010-5mol L-1)與不同金屬離子(20 倍)相互作用的熒光光譜。(b)光照 3h 后，探針 1 (2.0010-5mol L-1) 與不同金屬離子相互作用的紫外吸收光譜。(乙醇-水溶液，1/4, v/v, Tris-HCl pH =6.5)Fe3+對探針的熒光滴定曲線如圖5，摩爾比法和Job法均推測出Fe3+與探針的作用比為1:

47、1。用該作用比計算得Fe3+配合物的穩(wěn)定常數(shù)為1.50105。以羅丹明B(，0.89，乙醇溶液)為標準測定了配合物的熒光量子產(chǎn)率（）為0.75 14，表明配合具有較高的熒光量子產(chǎn)率。Cu2+對探針的吸收滴定曲線如圖6，摩爾比法和Job法均推測出Cu2+與探針的作用比為1:2。用該作用比計算得Cu2+配合物的穩(wěn)定常數(shù)為5.9104。40045050055060065070001002003004005000.00.20.40.60.81.00501001502001/1+Fe3+F-Fo 0.00.51.01.52.00100200300400500Fluorescence IntensityF

48、e3+/10eq2.0eqFluorescence IntensityWavelength(nm)4505005506000.00.51.01.52.02.50.00.20.40.60.81.00.00.51.01.52.02.51/1+Cu2+A-Ao0.00.51.01.52.00.00.51.01.52.02.53.0AbsorbanceCu2+/1(b)0eq2.0eqWavelength(nm)Absorbance圖5 圖62.3 共存離子的干擾實驗研究了常見金屬離子的共存對 Fe3+探針配合物的熒光強度的干擾（圖 7） ，結(jié)果表明在相同實驗條件下，探針除對 Cu2+有微弱響應外，對

49、K+，Na+，Mg2+，Ca2+，Mn2+，Co2+，Ni2+，Cu2+,Zn2+，Sr2+，Cd2+，Hg2+，Ba2+,Pb2+幾乎沒有明顯的響應，而加入 Fe3+能夠誘導探針產(chǎn)生強而穩(wěn)定的熒光發(fā)射及紫外吸收；在 Fe3+探針溶液中加入相對于 Fe3+濃度 2 倍的上述金屬離子時，對配合物的熒光發(fā)射及紫外吸收強度的影響的相對標準偏差在 5%以內(nèi)，即探針對 Fe3+的識別幾乎不受這些通常共存離子的影響，具有較高的選擇性。0100200300400500600 1+metal ion 1+metal ion +Fe3+Pb2+Ba2+Hg2+Cd2+Sr2+Zn2+Cu2+Ni2+Co2+Mn

50、2+Mn2+Ca2+Mg2+Na2+K+Fe3+Fluorescence Intensity圖 7 探針 1 (1.0010-5mol L-1)與 Fe3+（2.0010-4mol L-1）的溶液中加入不同金屬離子(2.0010-4mol L-1)后熒光強度的變化(乙醇-水溶液，1/4, v/v, Tris-HCl pH =6.5)，激發(fā)波長 557nm。 而 Cu2探針+配合物的吸收強度受 Fe3+的影響較大，Na+，Co2+，Zn2+對體系的吸收強度也有微弱影響（圖 8） 。它們的存在可引起體系吸收強度不同程度的減少，溶液中其它共存離子幾乎不對體系的吸收強度造成干擾。 0.00.20.40

51、.60.81.0 1+metal ion 1+metal ion +Cu2+Pb2+Ba2+Hg2+Cd2+Sr2+Zn2+Fe3+Ni2+Co2+Mn2+Ca2+Mg2+Na2+K+Cu2+Absorbance 圖 8探針 1 (1.0010-5mol L-1)與 Cu2+（2.0010-4mol L-1）的溶液中加入不同金屬離子(2.0010-4mol L-1)后紫外吸收強度的變化 (乙醇-水溶液，1/4, v/v, Tris-HCl pH =6.5)，amx=557nm。2.4 分析性能測定在 Tris-HCl 緩沖體系(pH=6.5)的乙醇-水 (1/4,v/v) 溶液中，以激發(fā)和發(fā)射

52、波長為 557/577nm，室溫下測定 Fe3+對探針 s1 (1.0010-5mol L-1)的熒光增強的校準曲線，F(xiàn)e3+濃度在 2.510-7 mol/L 2.510-5 mol/L范圍內(nèi)，體系熒光強度與濃度呈線性相關，相關系數(shù) R=0.9952（n=8） ，檢出限 7.4010-9 mol/L。以 557nm為最大吸收波長，測定體系吸光度與 Cu2+濃度的線性范圍為 2.510-7 mol/L 2.510-5 mol/L，相關系數(shù) R=0.9971（n=13） ，檢出限 9.4910-8 mol/L。0.00.51.01.52.02.50100200300400500Fluoresce

53、nce IntensityFe3+10-50.00.51.01.52.02.50.00.51.01.52.02.5AbsorbanceCu2+10-5圖 9 圖 10圖 9 探針 1 (10 M)與 Fe3+作用的 IfFe3+曲線(乙醇-水溶液，v/v=1/4，Tris-HCl，pH=6.5)，ex/em=557/577nm。 圖 10 探針 1 (10 M)與 Cu2+作用的 ACu2+曲線(乙醇-水溶液，v/v=1/4，Tris-HCl，pH=6.5)，（amx =557nm）。2.5 探針配合物性質(zhì)用HPLC方法對探針及配合物進行了分析，結(jié)果如圖11所示。在保留值為11 min出現(xiàn)探針

54、色譜峰。當在探針中加入Fe3+后，11 min處的峰基本不見，而在6.2 min處出現(xiàn)了一個新的色譜峰，表明有Fe3+探針配合物生成。當探針中加入Cu2+，17.5min處出現(xiàn)一個新的色譜峰，而11 min處的峰基本不見，表明有Cu2+探針配合物生成。圖 11以EDTA為配合競爭試劑，在Fe3+-羅丹明席夫堿配合物溶液中加入相對于羅丹明席夫堿80倍的EDTA，發(fā)現(xiàn)溶液立即褪色，熒光猝滅；當再加入100倍的Fe3+(相對于羅丹明席夫堿)后，溶液顏色、熒光及吸收強度均恢復接近未加競爭試劑前，此過程證明了配合反應的可逆性。從羅丹明席夫堿與金屬形成的配合物特征紅外吸收峰變化、核磁化學位移并結(jié)合光譜滴定

55、實驗結(jié)果，推測配合作用的機理如圖 12 所示。由于配合物的形成，誘導探針的螺環(huán)結(jié)構(gòu)打開，發(fā)生熒光及吸收顯著變化，這與文獻報道的羅丹明類探針響應金屬離子的離子誘導作用相同15,16,17。OEt2NNEt2NOCH3CH3ONOEt2NNEt2NOCH3CH3ON= Fe3+/Cu2+圖 122.6配合物與牛血清蛋白的相互作用 研究蛋白質(zhì)與配體之間的相互作用及動力學過程，對解釋蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關系及蛋白質(zhì)與各種配體的作用機制意義重大。利用小分子配體與生物大分子結(jié)合前后的光譜差異，在不分離的情況下用分子光譜研究配體與蛋白質(zhì)分子的相互作用。分別以羅丹明席夫堿及Fe3+-羅丹明席夫堿配合物為探針，研

56、究了與牛血清蛋白(BSA) 作用的熒光光譜特征。發(fā)現(xiàn)單純的配體與BSA作用的光譜強度變化靈敏度遠遠小于配合物的作用，初步建立了利用金屬配合物作為探針研究測定痕量蛋白質(zhì)的方法。4505005506006507000100200300400500600700Fluorescence IntensityWavelength(nm)-5.0 -4.8 -4.6 -4.4 -4.2 -4.0 -3.8 -3.6-1.6-1.4-1.2-1.0-0.8-0.6-0.4lg( F0 - F)/FlgFe3+ 圖 13 圖 14圖 13 C derivative 1 : 1.0 10-5 molL-1, CF

57、e3+ : 1.0 10-4 molL-1, pH 6.5, ex 557 nm.在室溫下配合物能迅速與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復合物，并可穩(wěn)定5h，其熒光強度基本保持不變。在一定的BSA濃度范圍內(nèi)，隨BSA濃度的增大，F(xiàn)e3+-羅丹明席夫堿配合物的熒光強度逐漸降低，并具有良好的線性關系（圖14）。隨著溫度的升高，猝滅曲線斜率降低，初步證明該過程為靜態(tài)猝滅。其熒光強度變化用靜態(tài)猝滅公式18求得不同溫度下的KA和n，結(jié)果見表2。數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)e3+-羅丹明席夫堿配合物與BSA的結(jié)合常數(shù)較大，且溫度對結(jié)合常數(shù)KA影響很小。較大的KA數(shù)值說明Fe3+-羅丹明席夫堿配合物與BSA之間有較強的結(jié)合作用，可以被蛋白質(zhì)

58、運輸和儲存。有機小分子和蛋白質(zhì)之間的作用力主要有疏水作用力、氫鍵、范德華力和靜電引力等。不同分子與蛋白質(zhì)結(jié)合力的類型不同。由表2中數(shù)據(jù)：H 0，說明配合物與BSA 之間的主要作用力為靜電引力，且G 0，所以配合物與BSA之間的結(jié)合反應是自發(fā)進行的，可以作為研究BSA的標記試劑。Table 2 The binding constants (KA), binding numbers (n) and correlation coefficients (R) between Fe3+ complex and BSAt/KAnRH/(kJ mol-1)G/(kJ mol-1)S/(JK-1 mol-1)nR3 3結(jié)論結(jié)論利用縮合反應一步合成得到了羅丹明酰肼縮苯甲酰丙酮，利用核磁和質(zhì)譜對目標產(chǎn)物進行了表征。光譜研究表明化合物具有熒光探針性質(zhì)，能選擇性的響應Fe3+的熒光和Cu2+的紫外吸收。色譜及光譜分析均表明了Fe3+探針配合