第六講病毒的檢測(cè)ppt課件

1、.病毒的檢測(cè) .內(nèi)容提要內(nèi)容提要l病毒的分離與鑒定病毒的分離與鑒定l病毒感染單位的測(cè)定病毒感染單位的測(cè)定l病毒顆粒的檢測(cè)病毒顆粒的檢測(cè)l病毒的血清學(xué)檢測(cè)病毒的血清學(xué)檢測(cè)l病毒核酸的檢測(cè)病毒核酸的檢測(cè).病毒的分離與鑒定病毒的分離與鑒定病料的采集與準(zhǔn)備病料的采集與準(zhǔn)備病毒的分離與培養(yǎng)病毒的分離與培養(yǎng)病毒的理化特性測(cè)定病毒的理化特性測(cè)定病毒的血清學(xué)與分子生物學(xué)鑒定病毒的血清學(xué)與分子生物學(xué)鑒定.標(biāo)本采集標(biāo)本采集殺滅雜菌殺滅雜菌（青鏈霉素青鏈霉素）接種接種鑒定病毒種型鑒定病毒種型易感動(dòng)物易感動(dòng)物出現(xiàn)病狀出現(xiàn)病狀雞胚雞胚病變或死亡病變或死亡細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞病變細(xì)胞病變?nèi)蠓椒ㄈ蠓椒ù蠖鄶?shù)革蘭氏陽性菌

2、都對(duì)青霉素敏感（結(jié)核桿菌對(duì)青霉素不敏感）；而革蘭氏陰性菌大多數(shù)革蘭氏陽性菌都對(duì)青霉素敏感（結(jié)核桿菌對(duì)青霉素不敏感）；而革蘭氏陰性菌則對(duì)青霉素不敏感（但奈瑟氏菌中的流行性腦膜炎雙球菌和淋病雙球菌對(duì)青霉素敏感）則對(duì)青霉素不敏感（但奈瑟氏菌中的流行性腦膜炎雙球菌和淋病雙球菌對(duì)青霉素敏感），而對(duì)鏈霉素、氯霉素等敏感。所以首先區(qū)分病原菌是革蘭氏陽性菌還是陰性菌，而對(duì)鏈霉素、氯霉素等敏感。所以首先區(qū)分病原菌是革蘭氏陽性菌還是陰性菌，在選擇抗生素方面意義重大。在選擇抗生素方面意義重大。.病料的采集與準(zhǔn)備病料的采集與準(zhǔn)備病料采集部位需適當(dāng)病料采集部位需適當(dāng)l一般可采集發(fā)病或死亡動(dòng)物的組織病料、分泌物一般可采集

3、發(fā)病或死亡動(dòng)物的組織病料、分泌物或糞便等，采樣因動(dòng)物及病毒的種類而異?；蚣S便等，采樣因動(dòng)物及病毒的種類而異。 犬細(xì)小病毒或輪狀病毒腹瀉的幼犬或犢牛犬細(xì)小病毒或輪狀病毒腹瀉的幼犬或犢牛: 糞便糞便 口蹄疫的豬或牛口蹄疫的豬或牛:水泡液及水泡皮水泡液及水泡皮 流感病毒流感病毒: 拭子拭子 肺臟肺臟 .病料采集后處理需適當(dāng)病料采集后處理需適當(dāng)l采集的采集的器官或組織樣本器官或組織樣本如肺臟、腦、肝、脾、如肺臟、腦、肝、脾、淋巴結(jié)等，可取一小塊進(jìn)行充分研磨，加入含淋巴結(jié)等，可取一小塊進(jìn)行充分研磨，加入含青、鏈霉素的青、鏈霉素的Hanks液，離心取上清液作為接液，離心取上清液作為接種物；種物；.l分泌物

4、或滲出液、糞便分泌物或滲出液、糞便l拭子取樣拭子取樣鼻液、膿汁、乳液汁等鼻液、膿汁、乳液汁等分泌物或滲出液分泌物或滲出液、糞、糞便，應(yīng)加入高濃度的抗生素，充分混勻后，便，應(yīng)加入高濃度的抗生素，充分混勻后，置置4度冰箱內(nèi)處理度冰箱內(nèi)處理24小時(shí)或過夜，離心后小時(shí)或過夜，離心后取上清作接種用；取上清作接種用；拭子拭子在取樣后應(yīng)迅速將其浸泡入含有在取樣后應(yīng)迅速將其浸泡入含有2%犢犢牛血清和一定濃度的青、鏈霉素的牛血清和一定濃度的青、鏈霉素的Hanks液液中，充分涮洗棉拭子，反復(fù)凍融中，充分涮洗棉拭子，反復(fù)凍融35次，離次，離心后取上清液作為接種材料。心后取上清液作為接種材料。.病毒的分離與培養(yǎng)病毒的

5、分離與培養(yǎng)l病毒是嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的生物，所以病毒的培病毒是嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的生物，所以病毒的培養(yǎng)需要在活體內(nèi)進(jìn)行。養(yǎng)需要在活體內(nèi)進(jìn)行。l細(xì)胞培養(yǎng)、雞胚和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、雞胚和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物l原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞株和傳代細(xì)胞系原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞株和傳代細(xì)胞系.細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)知識(shí)細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)知識(shí).l病毒嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生，培養(yǎng)病毒必須使用細(xì)胞。病毒嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生，培養(yǎng)病毒必須使用細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、雞胚都擁有大量活的細(xì)胞，可用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、雞胚都擁有大量活的細(xì)胞，可用于病毒培養(yǎng)。尤其是病毒培養(yǎng)。尤其是SPF動(dòng)物或動(dòng)物或SPF雞胚，目前雞胚，目前仍然經(jīng)常供培養(yǎng)病毒之用，但是發(fā)展最快的技仍然經(jīng)常供培養(yǎng)病毒之用，但是發(fā)

6、展最快的技術(shù)是細(xì)胞培養(yǎng)。術(shù)是細(xì)胞培養(yǎng)。.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)一般流程.l原代細(xì)胞（原代細(xì)胞（primary cell）對(duì)病毒較易感，尤其是來源于胚胎或幼畜組織的細(xì)胞。l二倍體細(xì)胞株（二倍體細(xì)胞株（diploid cell strain） 將長(zhǎng)成的原代細(xì)胞消化分散成單個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)傳代，其細(xì)胞染色體數(shù)與原代細(xì)胞一樣，仍為二倍體。l傳代細(xì)胞系（傳代細(xì)胞系（established cell line） 來源于腫瘤組織或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，染色體數(shù)目不正常，為異倍體。lHeLa（人子宮癌細(xì)胞）、Vero（非洲綠猴腎細(xì)胞）、BHK-21（乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞）、PK-15（豬腎細(xì)胞）等，并有專門機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)鑒定和保管，如ATCC

7、等 細(xì)胞培養(yǎng)的類型細(xì)胞培養(yǎng)的類型.細(xì)胞培養(yǎng)所需要的一般器材.一般營(yíng)養(yǎng)要求及培養(yǎng)條件培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：狀態(tài)狀態(tài): : 液體培養(yǎng)液（動(dòng)物細(xì)胞生活的液體環(huán)境）液體培養(yǎng)液（動(dòng)物細(xì)胞生活的液體環(huán)境）成分成分: : 葡萄糖（滿足能量需求、作為細(xì)胞碳源）葡萄糖（滿足能量需求、作為細(xì)胞碳源） 氨基酸（合成蛋白質(zhì)）氨基酸（合成蛋白質(zhì)） 無機(jī)鹽（重要的細(xì)胞組成物質(zhì)）無機(jī)鹽（重要的細(xì)胞組成物質(zhì)） 維生素、動(dòng)物血清等維生素、動(dòng)物血清等 （生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用）（生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用）條件條件: : 恒溫（恒溫（ 動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)溫度）動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)溫度） 無菌條件（防止微生物污染）無菌條件（防止微生物污染） 一般還需要一定濃度的二氧化碳一般

8、還需要一定濃度的二氧化碳.血清的作用：血清的作用： （1）提供有利于細(xì)胞生長(zhǎng)增殖所需的激素、生長(zhǎng)因子或提供合成培）提供有利于細(xì)胞生長(zhǎng)增殖所需的激素、生長(zhǎng)因子或提供合成培養(yǎng)基所缺乏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。養(yǎng)基所缺乏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 （2）提供可識(shí)別金屬、激素、維生素和脂質(zhì)的結(jié)合蛋白，并通過與）提供可識(shí)別金屬、激素、維生素和脂質(zhì)的結(jié)合蛋白，并通過與上述物質(zhì)的結(jié)合而起到穩(wěn)定和調(diào)節(jié)上述物質(zhì)的作用。此外結(jié)合蛋白還上述物質(zhì)的結(jié)合而起到穩(wěn)定和調(diào)節(jié)上述物質(zhì)的作用。此外結(jié)合蛋白還可消除某些毒素和金屬對(duì)細(xì)胞的毒性作用。可消除某些毒素和金屬對(duì)細(xì)胞的毒性作用。 （3）提供貼壁細(xì)胞固著于適當(dāng)?shù)母街嫠璧馁N壁因子和擴(kuò)展因子。）提供貼壁

9、細(xì)胞固著于適當(dāng)?shù)母街嫠璧馁N壁因子和擴(kuò)展因子。 （4）提供蛋白酶抑制劑，使細(xì)胞免受蛋白酶的損傷。）提供蛋白酶抑制劑，使細(xì)胞免受蛋白酶的損傷。 （5）提供）提供 PH 緩沖物質(zhì)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基緩沖物質(zhì)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH。 （6）影響培養(yǎng)系統(tǒng)中的某些物理特性如：剪切力、黏度、滲透壓和）影響培養(yǎng)系統(tǒng)中的某些物理特性如：剪切力、黏度、滲透壓和氣體傳遞速度等。氣體傳遞速度等。 .細(xì)胞培養(yǎng)的方法l靜置培養(yǎng)（靜置培養(yǎng)（stationary culture） 封閉，靜置于恒溫箱內(nèi)，數(shù)天后細(xì)胞可生成貼壁的單層細(xì)胞。l旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)（旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)（roller culture） 不同之處是要培養(yǎng)的細(xì)胞不是靜置，而是使之不斷緩慢

10、旋轉(zhuǎn)（510r/h），經(jīng)過一段時(shí)間，細(xì)胞可在培養(yǎng)瓶（管）的四壁長(zhǎng)滿單層。.l懸浮培養(yǎng)（懸浮培養(yǎng)（suspensive culture） 通過攪拌使細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)或維持存活。此法適用于此法適用于某些不需要貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞系，如某些不需要貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞系，如NS-1（一種骨髓瘤細(xì)胞系），或作某種特（一種骨髓瘤細(xì)胞系），或作某種特殊研究之用。殊研究之用。l微載體培養(yǎng)（微載體培養(yǎng)（micro-carrier culture） 是在懸浮培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，結(jié)合微載體的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。微載體是直徑微載體是直徑10035m的微小顆粒，對(duì)細(xì)胞無毒性，細(xì)胞可貼附其的微小顆粒，對(duì)細(xì)胞無毒性，細(xì)胞可貼附其上長(zhǎng)成單層。由

11、于微載體數(shù)量較大，所獲得的細(xì)胞數(shù)也比上述常規(guī)方法大為上長(zhǎng)成單層。由于微載體數(shù)量較大，所獲得的細(xì)胞數(shù)也比上述常規(guī)方法大為增加，對(duì)規(guī)?；募?xì)胞或疫苗生產(chǎn)很有吸引力，雖則增高了生產(chǎn)成本。增加，對(duì)規(guī)?；募?xì)胞或疫苗生產(chǎn)很有吸引力，雖則增高了生產(chǎn)成本。.細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用范疇（1 1）生產(chǎn)有重要價(jià)值的蛋白質(zhì)產(chǎn)品分泌性的蛋白質(zhì)產(chǎn)品）生產(chǎn)有重要價(jià)值的蛋白質(zhì)產(chǎn)品分泌性的蛋白質(zhì)產(chǎn)品（2 2）培養(yǎng)皮膚細(xì)胞用于移植形成組織）培養(yǎng)皮膚細(xì)胞用于移植形成組織（3 3）檢測(cè)有毒物質(zhì)致癌致畸引起染色體目和結(jié)構(gòu)改變）檢測(cè)有毒物質(zhì)致癌致畸引起染色體目和結(jié)構(gòu)改變 （4 4）理論研究）理論研究: :培養(yǎng)正?；虍惓＜?xì)胞用于生理、病理、藥培養(yǎng)

12、正?；虍惓＜?xì)胞用于生理、病理、藥 理研究理研究 (5) (5) 病毒的分離鑒定病毒的分離鑒定.應(yīng)用舉例病毒對(duì)細(xì)胞的選擇性病毒對(duì)細(xì)胞的選擇性l豬傳染性胃腸炎病毒初次分離最好用豬甲狀腺豬傳染性胃腸炎病毒初次分離最好用豬甲狀腺原代或二倍體細(xì)胞等培養(yǎng)。原代或二倍體細(xì)胞等培養(yǎng)。lPRRSV僅在豬肺巨噬細(xì)胞、僅在豬肺巨噬細(xì)胞、Marc-145細(xì)胞及細(xì)胞及非洲綠猴腎細(xì)胞系非洲綠猴腎細(xì)胞系MA-104生長(zhǎng)生長(zhǎng) lPCV常用常用PK15細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) .培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法l常用的有靜置培養(yǎng)和旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)產(chǎn)率常用的有靜置培養(yǎng)和旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)產(chǎn)率更高更高l大部分的病毒以靜置培養(yǎng)為主大部分的病毒以靜置培養(yǎng)為

13、主l如輪狀病毒，初次分離時(shí)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)成功率較靜如輪狀病毒，初次分離時(shí)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)成功率較靜置培養(yǎng)為高。置培養(yǎng)為高。.SARS-CoV in various cell linesRD293HeLa.A:正常正常A72細(xì)胞細(xì)胞(A72);B:CCV感染后，導(dǎo)致的合胞體細(xì)胞感染后，導(dǎo)致的合胞體細(xì)胞 (a)及凋亡現(xiàn)象及凋亡現(xiàn)象(b)AabB.圖圖3426-1 雞胚接種途徑示意圖（據(jù)雞胚接種途徑示意圖（據(jù)Flint等）等）雞胚雞胚.l依據(jù)不同的病毒種類，選擇適當(dāng)?shù)慕臃N途徑，依據(jù)不同的病毒種類，選擇適當(dāng)?shù)慕臃N途徑，通常接種通常接種尿囊腔尿囊腔，如新城疫病毒等。，如新城疫病毒等。l特殊情況可接種包括特殊情況可接種

14、包括卵黃囊卵黃囊、絨毛尿囊膜絨毛尿囊膜和和羊羊膜腔膜腔等，如雞痘病毒接種絨尿膜。等，如雞痘病毒接種絨尿膜。.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物.病毒的理化特性測(cè)定l病毒核酸型鑒定是病毒理化特性測(cè)定的最主要指標(biāo)。病毒核酸型鑒定是病毒理化特性測(cè)定的最主要指標(biāo)。l代謝抑制法，即添加代謝抑制法，即添加氟脫氧尿核苷氟脫氧尿核苷（FUDR）病毒復(fù)）病毒復(fù)制被抑制者，即為制被抑制者，即為DNA病毒，否則為病毒，否則為RNA病毒。病毒。lDNA酶或酶或RNA酶酶分別作用，以判定核酸的性質(zhì)。分別作用，以判定核酸的性質(zhì)。l綠豆芽酶（綠豆芽酶（Mung bean nuclease）可降解單股核酸，可降解單股核酸，用它可進(jìn)一步鑒定核酸

15、是單股或雙股。用它可進(jìn)一步鑒定核酸是單股或雙股。l直接用純化的病毒核酸通過電子顯微鏡觀察直接用純化的病毒核酸通過電子顯微鏡觀察lPCR核酸測(cè)序技術(shù)核酸測(cè)序技術(shù).脂溶性試驗(yàn)脂溶性試驗(yàn)l用乙醚或氯仿處理待檢病毒液，而后與未處理用乙醚或氯仿處理待檢病毒液，而后與未處理者比較其者比較其TCID50的變化，以判斷是否敏感的變化，以判斷是否敏感,從從而判定是否為有囊膜病毒而判定是否為有囊膜病毒 .空斑試驗(yàn)l病毒樣本接種吸附于單層細(xì)胞病毒樣本接種吸附于單層細(xì)胞l細(xì)胞上覆蓋一層含營(yíng)養(yǎng)液的瓊脂細(xì)胞上覆蓋一層含營(yíng)養(yǎng)液的瓊脂l感染病毒的細(xì)胞及病毒擴(kuò)散的周圍細(xì)胞形成空感染病毒的細(xì)胞及病毒擴(kuò)散的周圍細(xì)胞形成空斑或蝕斑（

16、斑或蝕斑（plaque）.l空斑形成單位（空斑形成單位（PFU）l僅計(jì)數(shù)含僅計(jì)數(shù)含20-100個(gè)空斑的培養(yǎng)板。個(gè)空斑的培養(yǎng)板。 .Virus Plaques病毒的空斑（據(jù)病毒的空斑（據(jù)Madigan等）等）病毒空斑病毒空斑單層細(xì)胞單層細(xì)胞高稀釋度高稀釋度低稀釋度低稀釋度.終點(diǎn)稀釋法l終點(diǎn)稀釋法（Endpoint dilution assay）用于測(cè)定幾乎所有種類的病毒滴度，包括某些不能形成空斑的病毒，并可用以確定病毒對(duì)動(dòng)物的毒力或毒價(jià)。l使用細(xì)胞培養(yǎng)，可通過CPE來判定組織培養(yǎng)半半數(shù)感染量（數(shù)感染量（TCID50）。）。.病毒顆粒的檢測(cè)病毒顆粒的檢測(cè).電子顯微鏡技術(shù)l最直觀的方法是用電子顯微鏡

17、（Electron microscopy，EM）觀察病毒顆粒。.l電子顯微鏡觀察法電子顯微鏡觀察法 可放大數(shù)十萬倍，能觀察1nm的微粒。.l一些一些含毒量高的病毒樣本含毒量高的病毒樣本，如糞樣、鼻拭子浸，如糞樣、鼻拭子浸液或組織勻漿液，可用液或組織勻漿液，可用EM檢出病毒。檢出病毒。l可用可用磷鎢酸鹽等重金屬鹽磷鎢酸鹽等重金屬鹽直接作負(fù)染而后觀察，直接作負(fù)染而后觀察，器官組織樣本則須作超薄切片后再作負(fù)染觀察。器官組織樣本則須作超薄切片后再作負(fù)染觀察。l前者適用于觀察病毒的表面結(jié)構(gòu)如口瘡病毒等，前者適用于觀察病毒的表面結(jié)構(gòu)如口瘡病毒等，后者則可觀察細(xì)胞內(nèi)的病毒結(jié)構(gòu)，如冠狀病毒、后者則可觀察細(xì)胞內(nèi)

18、的病毒結(jié)構(gòu)，如冠狀病毒、反錄病毒在組織中出芽的病毒顆粒等。反錄病毒在組織中出芽的病毒顆粒等。.血凝試驗(yàn)（Hemagglutination assay）l許多動(dòng)物病毒，如正黏病毒科、副黏病毒科、腺病毒許多動(dòng)物病毒，如正黏病毒科、副黏病毒科、腺病毒科的成員，能夠凝集某些種類動(dòng)物（如雞、小鼠、豚科的成員，能夠凝集某些種類動(dòng)物（如雞、小鼠、豚鼠、人）的紅細(xì)胞。鼠、人）的紅細(xì)胞。l這些病毒含有可與紅細(xì)胞結(jié)合的蛋白質(zhì)，如禽流感病這些病毒含有可與紅細(xì)胞結(jié)合的蛋白質(zhì)，如禽流感病毒的囊膜上有一種稱為血凝素的糖蛋白，可與紅細(xì)胞毒的囊膜上有一種稱為血凝素的糖蛋白，可與紅細(xì)胞表面的表面的N乙酰神經(jīng)氨酸糖蛋白結(jié)合，引起

19、紅細(xì)胞凝集。乙酰神經(jīng)氨酸糖蛋白結(jié)合，引起紅細(xì)胞凝集。l利用這種特性，可作血凝試驗(yàn)來檢測(cè)這些病毒的存在。利用這種特性，可作血凝試驗(yàn)來檢測(cè)這些病毒的存在。.l一般將病毒液在血凝反應(yīng)板上作倍比稀釋，加入紅細(xì)一般將病毒液在血凝反應(yīng)板上作倍比稀釋，加入紅細(xì)胞胞l未凝集的紅細(xì)胞呈圓點(diǎn)或紐扣狀沉于孔底未凝集的紅細(xì)胞呈圓點(diǎn)或紐扣狀沉于孔底 l凝集的紅細(xì)胞彌漫性格狀復(fù)蓋整個(gè)孔凝集的紅細(xì)胞彌漫性格狀復(fù)蓋整個(gè)孔 血凝試驗(yàn)血凝試驗(yàn)血凝抑制試驗(yàn)血凝抑制試驗(yàn).血清學(xué)檢測(cè)血清學(xué)檢測(cè) .病毒中和試驗(yàn)（Virus neutralization）l針對(duì)病毒的一些蛋白質(zhì)抗原或抗原表位的抗體與病毒針對(duì)病毒的一些蛋白質(zhì)抗原或抗原表位的

20、抗體與病毒結(jié)合后可以中和病毒的感染性。結(jié)合后可以中和病毒的感染性。l病毒中和試驗(yàn)可以在細(xì)胞培養(yǎng)、雞胚或動(dòng)物上進(jìn)行，病毒中和試驗(yàn)可以在細(xì)胞培養(yǎng)、雞胚或動(dòng)物上進(jìn)行，一般將抗體作稀釋，與一定量的病毒混合，然后檢測(cè)一般將抗體作稀釋，與一定量的病毒混合，然后檢測(cè)其在細(xì)胞培養(yǎng)、雞胚或動(dòng)物上的殘余感染性。其在細(xì)胞培養(yǎng)、雞胚或動(dòng)物上的殘余感染性。l終點(diǎn)是以抑制細(xì)胞病變（細(xì)胞培養(yǎng)）或病毒復(fù)制（雞終點(diǎn)是以抑制細(xì)胞病變（細(xì)胞培養(yǎng)）或病毒復(fù)制（雞胚或動(dòng)物）的抗體最高稀釋度來表示。胚或動(dòng)物）的抗體最高稀釋度來表示。l中和試驗(yàn)具有很強(qiáng)的特異性，是檢測(cè)病毒和新分離病中和試驗(yàn)具有很強(qiáng)的特異性，是檢測(cè)病毒和新分離病毒毒株的鑒定

21、最經(jīng)典的方法，也可用于檢測(cè)病毒感染毒毒株的鑒定最經(jīng)典的方法，也可用于檢測(cè)病毒感染動(dòng)物血清中的抗體。動(dòng)物血清中的抗體。.補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（Complement fixation）l補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)可以用于檢測(cè)動(dòng)物血清中補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)可以用于檢測(cè)動(dòng)物血清中的病毒抗體。病毒抗原與抗體的相互反的病毒抗體。病毒抗原與抗體的相互反應(yīng)可以引起補(bǔ)體結(jié)合，最終可導(dǎo)致膜溶應(yīng)可以引起補(bǔ)體結(jié)合，最終可導(dǎo)致膜溶解。解。l在補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中，利用紅細(xì)胞作為靶在補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中，利用紅細(xì)胞作為靶細(xì)胞，溶血系統(tǒng)作為指示系統(tǒng)，因紅細(xì)細(xì)胞，溶血系統(tǒng)作為指示系統(tǒng)，因紅細(xì)胞膜的溶解易于觀察到。胞膜的溶解易于觀察到。l如果存在抗體抗體結(jié)合反應(yīng)，補(bǔ)體

22、結(jié)合如果存在抗體抗體結(jié)合反應(yīng)，補(bǔ)體結(jié)合將發(fā)生，后者利用加入結(jié)合紅細(xì)胞抗體將發(fā)生，后者利用加入結(jié)合紅細(xì)胞抗體（溶血素）的綿羊紅細(xì)胞可以檢測(cè)到。（溶血素）的綿羊紅細(xì)胞可以檢測(cè)到。l如果補(bǔ)體被病毒抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，如果補(bǔ)體被病毒抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，則紅細(xì)胞仍然是完整的；相反，如果補(bǔ)則紅細(xì)胞仍然是完整的；相反，如果補(bǔ)體未被結(jié)合，紅細(xì)胞將在游離的補(bǔ)體的體未被結(jié)合，紅細(xì)胞將在游離的補(bǔ)體的作用下被溶解。作用下被溶解。.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）l酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)可用于樣本中病毒的檢測(cè)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)可用于樣本中病毒的檢測(cè)和動(dòng)物血清中病毒特異性抗體的檢測(cè)，檢測(cè)病毒動(dòng)物血清中病毒特異性抗體的檢測(cè)，檢測(cè)病

23、毒抗原可采用夾心法和雙夾心法，檢測(cè)抗體可采抗原可采用夾心法和雙夾心法，檢測(cè)抗體可采用間接法。用間接法。.病毒核酸的檢測(cè)病毒核酸的檢測(cè) .聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)l原理: 設(shè)計(jì)PCR引物，檢測(cè)目的片段的大小，DNA測(cè)序，比對(duì)已知病毒序列。lPCR可直接用于DNA病毒的檢測(cè)，如果是RNA病毒，則需在擴(kuò)增之前進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，即提取病毒RNA，加入反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA后，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，稱為RT-PCR .M123465789101112131415161718192021bp750200010005001099.RT-PCRl主要適用于主要適用于RNA病毒的病毒的檢測(cè)檢測(cè)l也可用于對(duì)也可用于對(duì)DNA病毒等病毒等

24、的轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè).核酸雜交l核酸雜交（核酸雜交（Nucleic acid hybridization）包括）包括DNA雜交和雜交和RNA雜雜交。前者即交。前者即Southern blot hybridization，用于檢測(cè)病毒，用于檢測(cè)病毒DNA。lRNA雜交雜交 即即Northern blot hybridization，用于病毒，用于病毒RNA的檢測(cè)，的檢測(cè)，基本過程與基本過程與DNA雜交相似。雜交相似。l核酸雜交技術(shù)可用于細(xì)胞、組織中病毒基因組或轉(zhuǎn)錄本的定位檢核酸雜交技術(shù)可用于細(xì)胞、組織中病毒基因組或轉(zhuǎn)錄本的定位檢測(cè)，即稱為原位雜交（測(cè)，即稱為原位雜交（in situ

25、hybridization）。）。標(biāo)本滴加硝酸纖維素膜標(biāo)本滴加硝酸纖維素膜加熱和堿處理變性加熱和堿處理變性標(biāo)記的核酸探針雜交標(biāo)記的核酸探針雜交放射自顯影或其他技術(shù)檢測(cè)放射自顯影或其他技術(shù)檢測(cè).lDNA樣本經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化，凝膠電泳，變性，轉(zhuǎn)移到濾膜上，樣本經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化，凝膠電泳，變性，轉(zhuǎn)移到濾膜上，然后用放射性同位素標(biāo)記的病毒核酸序列探針檢測(cè)結(jié)合到固相濾膜然后用放射性同位素標(biāo)記的病毒核酸序列探針檢測(cè)結(jié)合到固相濾膜上的上的DNA。目前放射性同位素標(biāo)記的核酸探針很少使用，而大多用。目前放射性同位素標(biāo)記的核酸探針很少使用，而大多用非放射性標(biāo)記探針（如生物素標(biāo)記）進(jìn)行檢測(cè)。一種改良的方法，非放射性標(biāo)記探針（如生物素標(biāo)記）進(jìn)行檢測(cè)。一種改良的方法，稱為斑點(diǎn)雜交，可用于樣本中病毒核酸的快速檢測(cè)。稱為斑點(diǎn)雜交，可用于樣本中病毒核酸的快速檢測(cè)。lSouthern 和和Northerin原理基本相同，都是利用原理基本相同，都是利用DNA或或RNA的復(fù)性的復(fù)性過程，但過程上也有區(qū)別，主要是過程，但過程上也有區(qū)別，主要