熒光定量RT-PCR方法與兔體定型熱試驗(yàn)對(duì)于檢測(cè)豬瘟兔化弱毒疫苗的平行關(guān)系.docx

1、第33卷第9期2011年9月中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicineVol.33,No.9Sep.2011doi:10.3969/j.issn.1008-0589.2011.09.08熒光定量RT-PCR方法與兔體定型熱試驗(yàn)對(duì)于檢測(cè)豬瘟兔化弱毒疫苗的平行關(guān)系葛葉”，張興娟I,朱慶虎2,韓秋影I,王牟平2,李偉杰2,孫建宏2,仇華吉、(I.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所善醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/豬傳染病研究室，黑龍遼哈爾濱150001;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司.黑龍江哈爾濱150069)摘要：為探討熒

2、光定量RT-PCR技術(shù)與傳統(tǒng)兔體定型熱試臉時(shí)于檢測(cè)豬瘟兔化弱毒疫苗的平行關(guān)系，本研究采用熒光定量RT-PCR方法與兔體定型熱試驗(yàn)對(duì)5份豬瘟兔化弱毒細(xì)胞苗成品和6份半成品樣品進(jìn)行平行檢測(cè)。結(jié)果表明，兩種檢測(cè)方法存在正相關(guān)性，最低10s個(gè)病毒拷貝可以使家兔產(chǎn)生定型熱反應(yīng)，最低IO,個(gè)病毒拷貝可以使家兔產(chǎn)生輕熱反應(yīng)。熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的檢測(cè)過(guò)程僅需3.5h,大大縮短了豬瘟疫苗的檢測(cè)時(shí)間，該方法可以補(bǔ)充傳統(tǒng)的兔體定型熱反應(yīng)用于豬瘟兔化弱毒疫苗半成品與成品的檢驗(yàn)。關(guān)鍵詞：豬瘟兔化弱毒疫苗；熒光定量RT-PCR;兔體定型熱試驗(yàn)中圖分類號(hào)：S852.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1008-0589(2

3、011)09-0699-05Parallelrelationshipbetweenreal-timeRT-PCRandfeverreactionmethodinrabbitsfortestinghogcholeralapinizedvirusvaccinesGEYe”，ZHANGXing-juan1,ZHUQing-hu2,HANQiu-ying1,WANGMu-ping2,LIWci-Jie2,SUNJian-hong2,QIUHua-ji1收稿日期：2011-01-11基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2006BAD06A03)作者簡(jiǎn)介：葛葉(1982-),女，河北秦皇島人，碩士,LIWci-J

4、ie2,SUNJian-hong2,QIUHua-ji1收稿日期：2011-01-11基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2006BAD06A03)作者簡(jiǎn)介：葛葉(1982-),女，河北秦皇島人，碩士,通信作者：E-mail:qiuhuaji(I.DivisionofSwineInfectiousDiseases,StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology,HarbinVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150001,China;2.HarbinWeik

5、cBiotechnologyDevelopmentCompany,HarbinVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150069,China)Abstract:Toevaluateaparallelrelationshipbetweenthereal-timeRT-PCRmethodandfeverreactionmethodinrabbits,wcdetected5finishedand6semi-finishedproductsofhogcholeralapinizedvirus(HCL

6、V)vaccines.Theresultsshowedthatbothmethodshadpositivecorrelation,105copiesofHCLVwereabletoinducetypicalfeverreactionand10copiesinducemoderatefeverreactioninrabbits.Only3.5hourswasneededforthereal-timeRT-PCR,indicatingthatthereal-timeRT-PCRcouldbeanalternativetotraditionalfeverreactiontestforHCLVvacc

7、inedosagedeterminationinrabbits.Keywords：hogcholeralapinizedvirus;real-timeRT-PCR;feverreactionmethodinrabbits豬瘟是由豬瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)引起的一種嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)的病毒性疾病，他界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為須呈報(bào)的動(dòng)物傳染病，我國(guó)也將其列為一類傳染病3】。目前用于豬瘟免疫接種的疫苗主要是豬瘟兔化弱毒細(xì)胞苗(HogCorrespondingauthorcholeralapinizedvirus,HCLV),疫苗的半成品、成品的效價(jià)測(cè)定

8、需將待檢樣品稀釋后經(jīng)耳緣靜脈注射試驗(yàn)兔，連續(xù)4d測(cè)定兔體溫變化獲得，該方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)錢鑒于熒光定量RT-PCR方法可以對(duì)兔體組織中的豬瘟病毒含最進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，具主要從事豬瘟疫苗定墳監(jiān)測(cè)方法研究.有特異、敏感、快速、高通處和實(shí)時(shí)等優(yōu)點(diǎn)網(wǎng)。本研究將熒光定量RT-PCR技術(shù)與傳統(tǒng)兔體定型熱試驗(yàn)進(jìn)行平行比較，通過(guò)優(yōu)化方案，多次重復(fù)試驗(yàn)表明，熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法可以補(bǔ)充傳統(tǒng)的兔體定型熱試驗(yàn)用于疫苗生產(chǎn)過(guò)程中的半成品及成品疫苗的檢驗(yàn)，可應(yīng)用該方法以縮減檢驗(yàn)周期。1材料和方法1.1疫苗和半成品HCLV株由哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司提供；疫苗半成品為初生犢牛睪丸細(xì)胞培養(yǎng)上清，收獲后-20-C保存?zhèn)?/p>

9、用；隨機(jī)抽取5批次豬瘟細(xì)胞疫苗成品和6批半成品備檢。1.2主要實(shí)驗(yàn)材料QIAampViralRNAKit提取試劑盒購(gòu)自QIAgen公司；DEPC購(gòu)自Promcga公司；HotStartExTaqDNA聚合酶、ReverseTranscriptaseXL(AMV).MgCl2(25mM)、RNA酶抑制劑(HPRI)和dNTP(10mM和2.5mM)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；體質(zhì)最為1.5kg3.0kg的新西蘭大耳白兔購(gòu)自哈爾濱坤達(dá)養(yǎng)殖場(chǎng)。1.3兔體定型熱反應(yīng)法測(cè)定疫苗半成品及成品豬瘟兔化弱毒疫苗效價(jià)測(cè)定按規(guī)程進(jìn)行，即將樣品用生理鹽水稀釋后，每個(gè)樣品接種2只試驗(yàn)兔，停只經(jīng)耳緣靜脈注射ImL,

10、接種后，上下午各測(cè)定體溫1次，48h后，每隔6h測(cè)定體溫1次，根據(jù)體溫反應(yīng)和接種結(jié)果進(jìn)行綜合判定。結(jié)果判定如下：定型熱反應(yīng)(+):潛伏期48h96h,體溫上升呈明顯曲線，至少有3個(gè)溫次超過(guò)正常體溫1C以上，并稽留18h36h;輕熱反應(yīng)(+):潛伏期48h96h,體溫上升呈明顯曲線，至少有2個(gè)溫次超過(guò)正常0.5-C以上，并稽留12h36h；無(wú)反應(yīng)(-):體溫正常；兩只家兔均呈定型熱反應(yīng)標(biāo)記為+/廿，一只呈定型熱反應(yīng)，另一只呈輕熱反應(yīng)標(biāo)記為廿/+,兩只均呈輕熱反應(yīng)標(biāo)記為+/+,一只呈輕熱反應(yīng)而另一只無(wú)反應(yīng)標(biāo)記為+/,兩只均無(wú)熱反應(yīng)標(biāo)記為/。1.4引物使用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的位于CSFVNS5B區(qū)域的豬瘟

11、兔化弱毒特異性引物(HCLV-F/HCLV-R)和TaqMan水解探針(HCLV.JOE)同。1.5病毒RNA的提取取140jjiL樣品，用QIAampViralRNAKit提取試劑盒提取病毒RNA,具體操作方法參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。最后用60piLAVE洗脫液洗脫溶解，直接用于cDNA的合成。1.6反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成取5以病毒RNA,加入到20反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，內(nèi)含4jiL5xRTBuffer2p.LdNTPMixture(各10mM)、50pmol9-mer隨機(jī)引物、10uAMV和20uHPRl,42C水浴1h,最后95C5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶1.7疫苗成品與半成品檢測(cè)1.7.1熒光定量RT-P

12、CR檢測(cè)熒光定量RT-PCR反應(yīng)總體積25gL,反應(yīng)體系含10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和疫苗樣品的cDNA2jjlL,10xHotStartExTaqBuffer2|xL,HCLV-F、HCLV-R引物各lptL(10pM).HCLV-JOE0.4|iL(1pM),dNTPs0.4p,L(10mM),HotStartExTaq0.25pL,滅菌雙蒸水補(bǔ)齊至25jjlLo反應(yīng)條件為：95*C5min；95C30s、60C45s,40個(gè)循環(huán)。每次循環(huán)的退火延伸時(shí)收集熒光。試驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。1.7.2動(dòng)物接種試驗(yàn)為確定熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法與兔體發(fā)熱反應(yīng)的相關(guān)性，將經(jīng)熒

13、光定量RT-PCR檢測(cè)后的疫苗樣品以10倍系列稀釋，按照ImU只的劑量經(jīng)耳緣靜脈接種試驗(yàn)兔，測(cè)定兔體發(fā)熱情況，每6h記錄一次兔體溫變化。為進(jìn)一步確定熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法與兔體定型熱反應(yīng)法的雖化關(guān)系，將經(jīng)熒光定量:RT-PCR檢測(cè)后的豬瘟兔化弱毒疫苗按照1000病毒拷貝數(shù)/叫、100病毒拷貝數(shù)/以、20病毒拷貝數(shù)仙L、4病毒拷貝數(shù)/|iL、2病毒拷貝數(shù)仙L、1病毒拷貝數(shù)/皿、0.5病毒拷貝數(shù)/piL、0.25病毒拷貝數(shù)仙L稀釋后，以ImL/H的劑量:經(jīng)耳緣靜脈接種試驗(yàn)兔，每個(gè)稀釋度接種3只。接種48h后停隔6h測(cè)定體溫，連續(xù)測(cè)4d,記錄兔體溫變化情況，同時(shí)用熒光定量RT-PCR檢測(cè)接種后

14、4d家兔脾臟中的總病毒RNA含最。2結(jié)果2.1定性試驗(yàn)隨機(jī)選取豬瘟兔化弱毒疫苗樣品3份，分別用兔熱法和熒光定量RT-PCR測(cè)定其效價(jià),10倍系列稀釋熒光定量RT-PCR測(cè)定的疫苗樣品，耳緣靜脈接種家兔1mL,連續(xù)4d記錄兔體溫變化，結(jié)果顯示，病毒含量在不低于IO?拷貝61L時(shí)均出現(xiàn)定型熱反應(yīng)(表Do表1熒光定量RT-PCR方法與兔體反應(yīng)熱方法試驗(yàn)比較Table1Comparativedetectionusingreal-timeRT-PCRandfeverreactionmethodinrabbits疫苗編號(hào)Vaccinebatches拷貝數(shù)蝕CopieszjiL徐群度Dilutions生理鹽

15、水Norma)saline1041站I0410,10*IO720090367.66x10*-H-/+nT+/+-/-20090372.86x10，+/+-H/+/+個(gè)/+J-20100043.17x10+/+/+/+/+/20091226-14.7x10*H-/+/+/+/-+/+/+20091228-13.6x0H-/44-+/+/+/+-/-20091230-29.86x10*+/+/+/+/.+/-20091230-31.27x1伊+/+/+/-A+/-20100101l.56xl07+/+/-+/+/+/+200912242.4x10*+/+/+/-注：+/+：兩只試臉兔均為定型熱反應(yīng)

16、；+/+：只試驗(yàn)兔JL定型然反應(yīng)，另一只呈輕熱反應(yīng)；+/+：兩只試驗(yàn)兔均呈輕熱反應(yīng)；+/-：兩只試瞼兔一只呈輕熱反應(yīng)，另一只無(wú)反應(yīng)；-/-：兩只試驗(yàn)兔均無(wú)反應(yīng)Note:-W-/+:Bothrabbitsshowedfeverreaction;-H-/+:Onerabbitshowedfeverreaction,theothershowedmoderatefeverreaction;+/+:Bothrabbitsshowedmoderatefeverreaction;+/:Onerabbitshowedmoderatethermalreaction,theotherremainednormal;

17、/:Bothrabbitsremainednormal隨機(jī)選取6份HCLV半成品，包括同一批次不同收毒時(shí)間、不同批次相同收毒時(shí)間及不同批次不同收毒時(shí)間，用兩種方法進(jìn)行平行測(cè)定。結(jié)果顯示，熒光定&RT-PCR測(cè)定的效價(jià)與兔體發(fā)熱法效價(jià)測(cè)定結(jié)果為相同稀釋度，20091226-1批次的疫苗半成品熒光定雖RT-PCR檢測(cè)結(jié)果為4.7xIO。拷貝，該樣品IO,稀釋免疫家兔，1只家兔無(wú)發(fā)熱反應(yīng)；將樣品IO?稀釋時(shí)，兔體出現(xiàn)輕熱反應(yīng)，將接種10,和10稀釋度樣品的家兔迫殺.無(wú)菊采取脾臟，采用熒光定量RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，10。稀釋度的樣品檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，而10,稀釋度樣品檢測(cè)結(jié)果為陰性，表明10。稀釋

18、度的病毒樣品在家兔脾臟發(fā)生了病毒復(fù)制，可能由于家兔的個(gè)體差異未出現(xiàn)預(yù)期的發(fā)熱反應(yīng)；而10稀釋度病毒樣品在部分家兔出現(xiàn)發(fā)熱但在脾臟未發(fā)生病毒復(fù)制，提示家兔易受非特異性因素影響致使體溫異常升高，這同時(shí)顯示了采用家兔發(fā)熱法測(cè)定疫苗效價(jià)存在的弊端。通過(guò)熒光定量RT-PCR檢測(cè)與兔體發(fā)熱比較表明，兩者存在很好的相關(guān)性，對(duì)3個(gè)不同批次的HCLV和6個(gè)不同批次的HCLV半成品的定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)熒光定最RT-PCR檢測(cè)的樣品同時(shí)按照10倍系列稀釋后接種家兔，使兔體發(fā)生不同程度的發(fā)熱反應(yīng).隨著稀釋倍數(shù)增高即病毒含量降低，兔體的發(fā)熱反應(yīng)逐漸減弱（表1）。2.2定量試驗(yàn)熒光定量RT-PCR測(cè)得2010014批

19、次和2010039批次的HCLV效價(jià)分別為1.51x106和6.02x0.用生理鹽水倍比稀釋后分別按1mLZ只接種試驗(yàn)兔，觀測(cè)其體溫變化.4d后，無(wú)菌摘取試驗(yàn)兔脾臟，研磨后對(duì)兔脾臟的總病毒及病毒負(fù)鏈RNA進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)及熱反應(yīng)試驗(yàn)，結(jié)果顯示接種1（T個(gè)病毒拷貝數(shù)可以使兔體產(chǎn)生定型熱反應(yīng)，接種10,個(gè)病毒拷貝數(shù)可以使兔體產(chǎn)生輕熱反應(yīng)（表2、表3）,表明HCLV的兔體最小感染量（RID）為IO,個(gè)病毒拷貝數(shù)需要指出的是，在發(fā)熱法測(cè)定過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)個(gè)別家兔出現(xiàn)異常反應(yīng)，如編號(hào)2010014-21的試驗(yàn)兔出現(xiàn)類似定型熱反應(yīng)，2010039-17出現(xiàn)類似輕型熱反應(yīng)，但用熒光定量RT-PC

20、R檢測(cè)該兔脾臟總病毒和病毒負(fù)鏈RNA時(shí)，結(jié)果均呈陰性（即NoCT）,表明這兩只家兔脾臟內(nèi)未發(fā)生病毒復(fù)制，該家兔體溫上升可能是在體溫測(cè)定過(guò)程中擦傷肛門導(dǎo)致；表2中的2010014-18號(hào)和表3的2010039-14號(hào)試驗(yàn)兔，并未出現(xiàn)預(yù)期的發(fā)熱反應(yīng)，在脾臟內(nèi)亦無(wú)病毒復(fù)制，推測(cè)是由于兔個(gè)體對(duì)HCLV不敏感所致。表2熒光定量RT-PCR方法與兔體反應(yīng)熱方法定試驗(yàn)比較-1Table2Quantitativecomparisonbetweenreal-timeRT-PCRandfeverreactionmethodinrabbits-1初觥毒拷則wCopies/Lininocuhte試做號(hào)Rabbitnu

21、mber鬼體發(fā)魏法FeverreactionsinrabbitsRNA找TotalRNAinthespleeniofinoculatedrabbits樓種知牌辰負(fù)俄RNAt()RNAinthespleenofinoculatedrabbits20)0014-1X4.04x10s1.16x10*io52010014-2-H-4.70x10*1.22XIO32010014-3+9.31x10*8.86xg20100144W3.61x1/2.53x10*1002010014-53.06x101.45x10*2010014+2.52x10s1.32x10*2010014-72.22X1051.23x1

22、0*20201001*2.04x1/1.I6xI02010014-94.95x1伊2.74x10*2010014-10+2.05x10s1.62x10*42010014-11+2.60XI058.98x10=2010014-124.89x10s2.37x10s2010014-13+1.55x10*8.02x!0J22010014-14+7.10x10s5.68x10*2010014-155.51X1O54.41xIO52010014-16+1.75x10,4.7xlffI2010014-1747.24x1儼4.O5XIO22010014-18NoCTNoCT2010014-19.NoCTNoC

23、T0.52010014-20NoCTNoCT2010014-21-HNoCTNoCT生夏鹽水G1NoCTNoCTNormalsalineC-2.NoCTNoCT表3HCLV熒光定量RT-PCR方法與兔體反應(yīng)熱方法試驗(yàn)比較-2Table3Quantitativecomparisonbetweenreal-timeRT-PCRandfisverreactionmethodinrabbits-2Wm接勘兔牌活病lyl兔編號(hào)第停邱雷.RNAMRNA依Copies/LinRabbitnumberTotalRNAinthespleen(-)RNAinthespleenofinoculateofinocul

24、atedrabbitsinoculatedrabbits2010039-1L82x渺1.15x10sI052010039-2-H-5.32xKT4.61xlO42010039-35.34x10*1.10x10*20I003MH5.29x10*4.19x10*1002010039-5H6.53x10*1.22x102010039-6+7.56xIO41.03xlO52010039-7+6.43x10*6.81xi(r202010039-8+4.59x10*2.25x10,2010039-96.50xT4.23x10*2010039-102.01x!0*6.47x1/42010039-118.32

25、xlO52.32x10*2010039-126-MxlO4LI7X1042010039-13+1.22x10*4.53x1/22010039-14.NoCTNoCT2010039-153.30x10*5.68xKF2010039-16+4.21x105I.86XI0212010039-17NoCTNoCT2010039-183.75xI059.62xI022010039-19NoCTNoCT0.52010039-20NoCTNoCT2010039-21NoCTNoCT2010039-22NoCTNoCT0.252010039-23NoCTNoCT2010039-24NoCTNoCT生夏缺C-3

26、NoCTNoCTNormalsalineC4NoCTW3討論HCLV以其具有對(duì)不同日齡豬無(wú)殘余毒力、誘導(dǎo)免疫反應(yīng)快和可以保護(hù)豬只抵抗豬瘟強(qiáng)毒的攻擊等優(yōu)點(diǎn)，成為國(guó)際上公認(rèn)的最安全、有效的豬瘟疫苗。多年來(lái)，在國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用，對(duì)豬瘟的控制起到了重要的作用四。疫苗效價(jià)的高低是判定疫苗合格與否的關(guān)鍵指標(biāo)。HCLV效價(jià)判定常用方法兔體定型熱反應(yīng)法（兔熱法）存在的突出不足是：不能精確定量；檢測(cè)結(jié)果易受兔體個(gè)體差異和環(huán)境因素影響；實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)（至少4d）,費(fèi)時(shí)費(fèi)力；需要飼養(yǎng)和消耗動(dòng)物，成本高。因此，如何快速、準(zhǔn)確測(cè)定疫苗效價(jià)是豬瘟疫苗生產(chǎn)中面臨的主要技術(shù)難題之一。研究表明，采用微量細(xì)胞培養(yǎng)ELISAS和反向間接

27、血凝試驗(yàn)測(cè)定HCLV效價(jià)，可以縮短檢測(cè)時(shí)間，降低生產(chǎn)成本，但不能對(duì)毒價(jià)進(jìn)行準(zhǔn)確定量近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的熒光定量RT-PCR技術(shù)以其敏感、快速和特異等特點(diǎn)在基因表達(dá)譜分析、病原體的定性和定量檢測(cè)等方面得到廣泛應(yīng)用叫。與兔熱法相比，熒光定量RT-PCR方法敏感、穩(wěn)定、準(zhǔn)確，能有效克服家兔個(gè)體反應(yīng)性差異帶來(lái)的誤差，操作步驟簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高、檢測(cè)速度快，整個(gè)過(guò)程僅需3.5h,齒此它不但能快速對(duì)疫苗成品進(jìn)行準(zhǔn)確定量，而且能及時(shí)監(jiān)控疫苗生產(chǎn)中細(xì)胞產(chǎn)毒情況，及時(shí)淘汰不合格批次。熒光定3RT-PCR檢測(cè)所需樣品量和試驗(yàn)材料較少，大大降低了疫苗的生產(chǎn)成本，也大大減少了對(duì)家兔等生物資源的耗費(fèi)。本研究通過(guò)將熒光定量:

28、RT-PCR檢測(cè)方法與兔體發(fā)熱法進(jìn)行定性定量比較分析，將熒光定量RT-PCR檢測(cè)的HCLV成品、半成品系列稀釋后接種試驗(yàn)兔，兔體溫變化情況顯示，隨著樣品稀釋倍數(shù)的增高，兔體的發(fā)熱情況逐漸減輕，與熒光定量RT-PCR測(cè)定的結(jié)果呈正相關(guān)，即熒光定最RT-PCR測(cè)得的拷貝數(shù)在較低的稀釋度時(shí)在兔體上會(huì)出現(xiàn)典型的定型熱反應(yīng)，而稀釋較高的倍數(shù)會(huì)出現(xiàn)輕度發(fā)熱乃至不發(fā)熱，表明熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法與兔體發(fā)熱法的結(jié)果具有明顯的相關(guān)性c為證實(shí)兩者的相關(guān)性，重復(fù)檢測(cè)成品、半成品9批，結(jié)果一致。為進(jìn)一步確定兩者的最化關(guān)系，本研究采用測(cè)定了病毒拷貝數(shù)的疫苗稀釋后接種試驗(yàn)兔，觀察兔體溫變化，結(jié)果顯示，當(dāng)1mL疫苗稀

29、釋液中含有10個(gè)病毒拷貝數(shù)時(shí)兔體呈定型熱反應(yīng)，1mL稀釋液中含有IO個(gè)病毒拷貝數(shù)時(shí)兔體呈輕熱反應(yīng)，為證實(shí)該結(jié)果，重復(fù)檢測(cè)2批疫苗，結(jié)果一致。表明在HCLV檢驗(yàn)中，熒光定量RT-PCR方法與兔熱法存在正相關(guān)性。熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)的是病毒（包括失活的病毒）RNA含量，間接反映病毒含量，而兔體定型熱試驗(yàn)直接檢測(cè)的是活病毒含量，盡管可以通過(guò)檢測(cè)病毒負(fù)鏈RNA.間接反映活病毒的含量，但兩種檢測(cè)結(jié)果可能存在一定差異。因此，熒光定量RT-PCR方法可能并不能完全替代傳統(tǒng)的兔熱法用于HCLV半成品與成品的檢驗(yàn)，但可以作為兔熱法的有益補(bǔ)充。參考文獻(xiàn)：(H股震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)M.北京：科學(xué)出版社，】997：652-664.2王家富.張楚瑜，傅烈振.等.中國(guó)豬痕兔化弱毒NS2-3基因的序列分析J.病毒學(xué)報(bào).2000,16(2)：150-154.蔡寶祥.家畜傳染病學(xué)(M