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1、2014 年 _04_ 月 _22葉綠體分離與熒光染色觀察日姓名 系年級(jí)組別 同組者科目 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)題目 葉綠體分離與熒光染色觀察學(xué)號(hào)葉綠體分離與熒光染色觀察一. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 通過植物細(xì)胞葉綠體的分離與純化,了解細(xì) 胞器分離與純化的原理和方法。2. 熟悉熒光顯微鏡的使用方法,觀察葉綠體的 自發(fā)熒光和次生熒光。二. 實(shí)驗(yàn)原理1 葉綠體分離的原理勻漿破碎細(xì)胞,利用差速離心方法分離等滲 介質(zhì)中的懸浮顆粒,收集類葉綠體大小的顆粒, 得到葉綠體。差速離心:顆粒在離心場(chǎng)中的沉降速率取決 于顆粒的大小、形狀和密度,也同離心力以及懸 浮介質(zhì)的粘度有關(guān)。在一給定的離心場(chǎng)中,同一#2014 年 04 月 _
2、22日姓名 系年級(jí)組別 同組者科目 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)題目 葉綠體分離與熒光染色觀察學(xué)號(hào) 時(shí)間內(nèi),密度和顆粒大小不同的顆粒其沉降速率 不同。依次增加離心力和離心時(shí)間,就能使非均一 懸浮液中的顆粒按其大小、密度先后分批沉降在 離心管底部,分批收集即可獲得各種亞細(xì)胞組 分。葉綠體的分離應(yīng)在等滲溶液(0.35molL的 氯化鈉或0.4molL的蔗糖溶液)中進(jìn)行,以免 滲透壓的改變使葉綠體受到損傷。分離過程最好 在0-5 C的條件下進(jìn)行,如果在室溫下,要迅速 分離和觀察。2.差速離心特點(diǎn):介質(zhì)密度均一,速度由高到低,逐級(jí) 離心;32014 年 _04_ 月 _22日姓名 系年級(jí)組別 同組者科目 細(xì)胞生物學(xué)
3、實(shí)驗(yàn)題目 葉綠體分離與熒光染色觀察學(xué)號(hào)用途:分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器 ; 沉降順序:核-線粒體-溶酶體與過氧 化物酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與咼爾基體核蛋白體, 可將細(xì)胞器初步分離,常需進(jìn)一步通過密度梯度 離心再行分離純化。3. 熒光的概念光致發(fā)光:某些物質(zhì)在照射下,吸收光能進(jìn) 入激發(fā)態(tài),當(dāng)從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí),可以以電磁 輻射的形式釋放出吸收的光能,這種現(xiàn)象稱為“光致發(fā)光”。紫外輻射、可見光及紅外輻射均 可引起光致發(fā)光,如磷光與熒光。熒光:在光致發(fā)光中,如果一定波長(zhǎng)的短波 光(如紫外光)照射某種物質(zhì),這種物質(zhì)吸收光 能后進(jìn)入激發(fā)態(tài),并且立即退激發(fā)在極短的時(shí)間7日姓名 系年級(jí)組別 同組者科目 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)
4、驗(yàn)題目 葉綠體分離與熒光染色觀察學(xué)號(hào)內(nèi)能發(fā)射出比照射光波更長(zhǎng)的光(如可見光), 這種光就稱為熒光。一旦停止入射光,發(fā)光現(xiàn)象 也隨之立即消失。熒光分為自發(fā)熒光或誘發(fā)熒光 (次生熒光、續(xù)發(fā)熒光、間接熒光)。某些物質(zhì) 受激發(fā)光照射后可直接發(fā)出熒光, 如葉綠素、血 紅素的火紅色熒光或木質(zhì)素的黃色熒光的等,稱為自發(fā)熒光(直接熒光)某些物質(zhì)本身不發(fā)熒光, 但它經(jīng)熒光染料染色后,再通過紫外線照射同樣 也能發(fā)出熒光,這樣熒光稱為誘發(fā)熒光,如葉綠 體被咩啶橙染色后可發(fā)桔紅色熒光。4. 熒光顯微鏡的操作及注意事項(xiàng)(1)接通電源,打開啟動(dòng)裝置開關(guān) ;(2)按Starter按鈕3-5秒以啟動(dòng)激發(fā)光源。 注意Start
5、er鍵不能超過5秒。啟動(dòng)2-3分鐘后2014 年 04 月 _22日姓名 系年級(jí)組別 同組者科目 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)題目 葉綠體分離與熒光染色觀察學(xué)號(hào) 方可穩(wěn)定,啟動(dòng)15分鐘內(nèi)不得關(guān)閉電源,一旦 關(guān)閉汞燈,3分鐘內(nèi)不得重啟,用完后關(guān)閉main SWitCh ;(3)選擇相對(duì)應(yīng)的激發(fā)慮片、阻斷慮片和雙色鏡。放置樣品,先在普通光鏡下選擇好要觀察的視野;(4)關(guān)閉普通光源后,撤開UV擋板,即可觀察 到樣品的螢光情況,需要照相時(shí),要及時(shí)拍照, 否則可能拍不到螢光照片;(5)觀察結(jié)束后,關(guān)閉 main SWitCh ,切斷電 源。三. 實(shí)驗(yàn)材料1 .材料新鮮菠菜。11日姓名 系年級(jí)組別 同組者科目 細(xì)胞生物
6、學(xué)實(shí)驗(yàn)題目 葉綠體分離與熒光染色觀察學(xué)號(hào) 2 試劑(1) 0.35molL 的 NaCl 等滲溶液;(2) 0.01%吖啶橙(acridine Orange )稱 取0.1g吖啶橙加蒸餾水100ml做母液,儲(chǔ)存于 棕色瓶,置4C冰箱保存。臨用前取1mL母液加 1/15mol/L 磷酸緩沖液(pH4.8) 9mL3.器材普通或高速離心機(jī)(九陽豆?jié){機(jī))、熒光顯 微鏡、研缽、滴管、漏斗、離心管,天平,量筒, 紗布。四. 實(shí)驗(yàn)步驟1. 選取新鮮嫩綠的菠菜葉,去葉梗及其粗脈, 洗凈擦干,稱取 30g放于150ml0.35M.的NaCl 溶液中;日姓名 系年級(jí)組別 同組者科目 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)題目 葉綠體分
7、離與熒光染色觀察學(xué)號(hào)2. 將葉和液體同時(shí)裝入組織搗碎機(jī)中(豆?jié){機(jī) 中),勻漿 3-5min ,轉(zhuǎn)速 5000rmin ;3. 將勻漿用紗布(6層)過濾于500ml燒杯中;4. 將濾液4ml在1000rmin下離心2min;5. 取上清液在3000rmin下離心5min (沉淀為葉綠體和細(xì)胞核混合物);6. 將沉淀用2-3ml0.35M.的NaCl液懸浮;7. 取一滴懸液滴片,加蓋玻片后顯微鏡下觀察;8 另外取一滴懸液滴片,再加一滴0.01%的吖 啶橙染料混勻,蓋上蓋玻片,在熒光顯微鏡 下觀察。五實(shí)驗(yàn)結(jié)果1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖所示:日姓名 系年級(jí)組別 同組者科目 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)題目 葉綠體分離與熒光
8、染色觀察學(xué)號(hào)圖1普通光鏡下葉綠體形態(tài)(10× 40)2014 年 04 月 _22日姓名 系年級(jí)組別 同組者科目 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)題目 葉綠體分離與熒光染色觀察學(xué)號(hào)圖2熒光顯微鏡下葉綠體的自發(fā)熒 光13日姓名 系年級(jí)組別 同組者科目 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)題目 葉綠體分離與熒光染色觀察學(xué)號(hào)圖3( 1)熒光顯微鏡下葉綠體的次 生熒光2014 年 _04_ 月 _22日姓名 系年級(jí)組別 同組者科目 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)題目 葉綠體分離與熒光染色觀察學(xué)號(hào)H ° - I骨4W 41* Jt Jr r MIBfP '_JJ1£ Ml.LS T 1* ' +*4g N'
9、;'>* 4Jh * _i! fc章r *業(yè) IJLP."r 1."4 RJ-P -I . W# Ihl >*,B-n + .flFI *JalPL4-"</再彳IIrf« B *f*魚It*u p. i*dJiS- *.*_k"圖3(2)熒光顯微鏡下葉綠體的次 生熒光葉綠體在熒光顯微鏡下觀察到的圖樣, 圖2為 葉綠體的自發(fā)熒光,為火紅色;圖 3( 1)、( 2) 為葉綠體的次生熒光,為橘紅色。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析152014 年 04 月 _22日姓名 系年級(jí)組別 同組者科目 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)題目 葉綠體分離與熒光染色觀察
10、學(xué)號(hào)表1葉綠體普通觀察與熒光染色結(jié)果對(duì)比觀 察 方 式普通光學(xué)顯 微鏡熒光顯微鏡染色后熒光 觀察觀 察 結(jié) 果普通光鏡下, 可看到葉綠 體為綠色橄 欖形,在高倍 鏡下可看到 葉綠體內(nèi)部 含有較深的葉綠體自發(fā)熒 光為火紅色,呈 斑狀分布,其他 部分為黑色間接熒光為 橘紅色,占很 少一部分,其 他大部分為 綠色17日姓名 系年級(jí)組別 同組者科目 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)題目 葉綠體分離與熒光染色觀察學(xué)號(hào)綠色小顆粒, 即基粒。另外 還有一些其 他組織碎片結(jié) 果 分 析普通光學(xué)顯 微鏡下觀察 到葉綠體的 正常結(jié)構(gòu)。離 心不純導(dǎo)致 混有其他組 織碎片葉綠體經(jīng)激發(fā) 光波照射后,自 發(fā)熒光呈現(xiàn)火 紅色,因葉綠體 在其
11、懸液中呈 現(xiàn)點(diǎn)狀均勻分 布,且懸液其他 組分無自發(fā)熒 光反應(yīng),故觀察 到斑狀分布的葉綠體次生 熒光的來由, 橘紅色為葉 綠體的熒光 效果,葉綠體 的懸液中混 有的細(xì)胞核 碎片中的核 酸經(jīng)丫啶橙 染色熒光反2014 年 04 月 _22日姓名 系年級(jí)組別 同組者科目 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)題目 葉綠體分離與熒光染色觀察學(xué)號(hào)火紅色熒光效 果應(yīng)呈現(xiàn)綠色六.1.思考與討論 注意事項(xiàng)(1)要得到完整的、有活性的葉綠體,須在低 溫下迅速提取,涂片后立即觀察,注意離心時(shí)的 時(shí)間及強(qiáng)度。(2)利用熒光顯微鏡對(duì)可發(fā)熒光的物質(zhì)進(jìn)行觀 察室,會(huì)收到許多因素的影響,如溫度、光、淬 滅劑等。因此在進(jìn)行熒光觀察時(shí)應(yīng)抓緊時(shí)間,必
12、要時(shí)應(yīng)立即拍照。(3)在制作熒光顯微標(biāo)本時(shí)最好使用物熒光載 玻片、無熒光蓋玻片香柏油。2. 思考題192014 年 _04_ 月 _22日姓名 系年級(jí)組別 同組者科目 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)題目 葉綠體分離與熒光染色觀察學(xué)號(hào)(1)在熒光顯微鏡下觀察葉綠體的自發(fā)熒光時(shí), 更換濾片系統(tǒng),葉綠體的顏色是否有變化?有變化。因?yàn)槿~綠體的顏色取決于發(fā)出熒光能量 的高低,更換不同的濾片,激發(fā)光會(huì)不同,葉綠 體得到和輻射的能量就會(huì)不同,顏色也就會(huì)不一 樣(2)游離的葉綠體和完整細(xì)胞內(nèi)的葉綠體,在熒光顯微鏡下,顏色和熒光強(qiáng)度有無區(qū)別,為什 么?有區(qū)別。因?yàn)橥暾?xì)胞內(nèi)的葉綠體還要進(jìn)行光合 作用,這會(huì)消耗掉一部分所吸收的光
13、,所以最后 釋放的熒光能量就會(huì)比游離核糖體所釋放的小, 顏色和熒光強(qiáng)度就會(huì)有差別。(3)根據(jù)觀察到的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象,簡(jiǎn)述自發(fā)熒光和23日姓名 系年級(jí)組別 同組者科目 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)題目 葉綠體分離與熒光染色觀察學(xué)號(hào) 次生熒光的區(qū)別?自發(fā)熒光指不需染色,只需在激發(fā)光照射下即可 發(fā)熒光的現(xiàn)象,而次生熒光需要染色。因?yàn)榘l(fā)光 機(jī)制不同,所用的濾光片也會(huì)不同,最后發(fā)出的 熒光顏色也會(huì)不同。(4)葉綠體分離的原理是什么?操作過程應(yīng)注意什么?采用的方法是差速離心法,利用不同顆粒大小、 形狀不同導(dǎo)致沉降速率不同,把葉綠體大小的顆 粒沉降出來。葉綠體的分離應(yīng)在等滲溶液 (0.35molL氯化鈉 或0.4molL蔗糖溶液)中進(jìn)行,以免滲透壓的改 變使葉綠體受到損傷;分離過程最好在 04C 的條件下進(jìn)行;如果在室溫下,要迅速分
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