銅綠假單胞菌疫苗研究進(jìn)展.docx

1、文章編號：1002-2694(2010)12-1157-03銅綠假單胞慵疫苗研究進(jìn)展來佑明.羅永艾中圖分類號:R378.99-1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaPa)是常見的非發(fā)醉糖(；專性需H小桿菌.廣泛存在于土壤、水、污物、植物和動物中.常定植于健康人的上呼吸道、腸道和皮膚等處.是免疫抑制個體重要的機(jī)會致病偏。銅綠假單胞菌感染一旦發(fā)生.多為慢性病程.引起肺實質(zhì)損傷.常導(dǎo)致患者死亡。由于銅綠假單胞菌膜對藥物滲透障礙.引起多種抗生多天然耐藥。在治療過程中，通過基因突變發(fā)生耐藥,使銅綠假單胞函感染治療卜分棘F(xiàn).死亡率高，疫苗是預(yù)防感染性疾病發(fā)牛的有效方法本文

2、介紹了6種Pa疫苗構(gòu)建及其免疫機(jī)制等方而的研究進(jìn)展1滅活疫苗滅活疫苗(inactivcdvaccine)乂稱為死疫苗是病原休大量培養(yǎng)以后.經(jīng)理化方法滅活后制成OCripps等應(yīng)用lioehringer-Ingelheim制備的低壓冷凍甲醛滅活的15385株(2血清型、21/44/109/1IOX/1214噬御體型腸溶口服疫苗Pseudostat.每粒150mg.含2Xl()n(、FU°1d、28d給予健康志愿者15()mg服免疫.末次免疫后觀察2w.安全性艮好。在免疫14d后.血清特異性的IgA抗體明顯增加,持續(xù)到42d：血清持異性的IgM抗體也明顯增加.28d恢復(fù)正常；在整個觀察期

3、IgG無明顯變化.提示疫苗不能很好誘導(dǎo)Thl型免疫反應(yīng)：免疫血清能明顯增加巨喋細(xì)胞的調(diào)理吞噬作用。2減毒活疫苗減推活疫苗(live-attcnualedvaccine)是用減毒或無毒力的活病原微生物制成。aroA基因編碼5-烯醇酮芥草酸三磷酸合成的.是植物和細(xì)閑合成芳香族敏瑞酸的關(guān)鍵前。Prichc等m用l0MCFU,5X10TFU和lOH'FUPAOlAaroA減毒活疫苗依次遞增鼻腔免疫C3HHcN和BALB/c小鼠，1次/w.共3次，未出現(xiàn)茬性反應(yīng).一1d后肺部是無菌的。末次免疫3w后用ExoUPAO1和()2/05血清型PAO1攻擊.全部小鼠存活.3d后對照組全部死亡：用不同血清

4、型攻擊疫苗組.未能得到好的保護(hù)率；不同類近交小鼠產(chǎn)生的保護(hù)率不同；與對照組相比在疫苗蛆ExoUPAO1引起的氣道急性炎癥明顯減輕.能維持正常的肺泡結(jié)構(gòu)：腹腔注射1n*來源于卵腔接種0.25mg疫苗小鼠的IgG抗體,在低于主動免疫PAOlAaroA疫苗免疫劑量組有高水平的保護(hù)力。Zaidi等用同樣減毒活疫苗依次遞增鼻腔免疫C3H/HeN小鼠.1次/'w.共3w°末次免疫4w后.用4000倍ID："50%infectiousdose,IDG的不同血清型和不同毒力的銅綠假單胞菌攻擊均沒有觀察到眼睛的病理損傷直至7w仍有顯著保護(hù)力。在被動免疫研究中,不同血清型和不同毒力的銅

5、綠假單胞萌劃傷感染眼結(jié)膜，在感染前18h和感染后2h腹腔注射鼻腔免疫PaOlAaroA減毒活疫苗的血清，均獲得顯著保護(hù)性：用不同血清型銅綠假單胞菌1.4XIO；CFU角膜感染后3d,腹腔注射鼻腔免疫PaOlAaroA減毒活疫苗的小鼠血清.仍能明顯減輕角膜的病理損傷；證實Pa()1AaroA減毒活疫苗血清不僅有抗菌活性,而且能阻止銅綠假單胞菌進(jìn)入角膜上皮細(xì)胞，研究結(jié)果提示減毒活疫苗是安全有效的.同-疫苗對不同部位的S感染，保護(hù)力不同。3結(jié)合疫苗結(jié)合疫苗(conjugatevaccine)是將多糖等T細(xì)胞非依賴性抗原與蛋白載體結(jié)合制成。黏液胞外多糖(mucoidexopolysaccharide.

6、MEP).又稱為藻酸鹽.是由I)-甘露糖醛酸和1廠占洛糖酸酸通過阡4糖甘連接形成的多聚物9Pier等'發(fā)現(xiàn)MEP免疫小鼠后能夠產(chǎn)生調(diào)理性抗體.有利于呼吸道清除銅綠假單胞菌.但是,單純的MEP疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體不足10%。Theilacker161成功制備KLH-MEP結(jié)合疫苗.最佳免疫劑雖是1邱/只.免疫03H/HcN小鼠,誘導(dǎo)出高濃度MEP特異的IgM和Ig(；抗體，也(；在第2次免疫7d后開始增加.第3次免疫后顯著增加，35d達(dá)高峰、持續(xù)到63d。高劑量:的MEP和KLH混合物免疫后僅產(chǎn)生MEP特異的也M和KLH特異的IgG抗體，并不產(chǎn)生MEP特異的lg(；抗體,提示KLH是良好的T

7、細(xì)胞非依賴性抗原結(jié)合載體。陸淼泉等將MEP與R群腦膜炎球菌外通訊作者:費(fèi)永艾.Email:luoyongai19-12(«作者單位：正慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)澆府唆內(nèi)科.重慶400016膜蛋白復(fù)合物(OMPC)通過Hurwitz方法交聯(lián)成功制備MEP-OMPC結(jié)合疫苗。1d、7d和14d免疫小鼠3次每次50昭/只.2Id和28d誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平抗MEP的調(diào)理性IgG抗體；29d用1X10，CFU黏液型銅綠假單胞菌腹腔攻擊的保護(hù)率85%.能有效預(yù)防銅綠假單胞菌的全身感染。4DNA疫苗DNA疫苗(DNAvaccine)是將編碼病原體有效免疫原基因插入質(zhì)粒構(gòu)建重組體.經(jīng)過注射等途徑進(jìn)入機(jī)體.轉(zhuǎn)染

8、宿主細(xì)胞，表達(dá)保護(hù)性蛋白抗原.誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫。陳建國等將銅綠假單胞圜OprF3個中和性3細(xì)胞表位和1個外源通用T細(xì)胞表位串聯(lián)，采用重蒲PCR方法合成DNA./E此序列前插入組織纖溶酶原激活物(tPA)的信號肽基因?qū)@得的片段與MyD88基因分別克隆到PIKES載體的兩個多克隆位點.構(gòu)建苴核雙表達(dá)重組質(zhì)粒pIRES-tPA-()prF-MyI)88o將該疫苗50“g/次，間隔2w.免疫3次，末次免疫2w后采血檢測抗體，疫苗組產(chǎn)生高水平的OprF特異性抗體，機(jī)體清除銅綠假單胞【有的能力明顯增強(qiáng)。Price等w將長度為977bp的oprF基因亞克隆入頁核表達(dá)質(zhì)粒PVR1020纖溶醉原信號序列的F

9、游.在大腸桿萌中擴(kuò)增，成功構(gòu)建|)VR1020/oprF基因疫苗。于0d、14d和28d,pVR1020/oprF基因疫苗(2pg/只)免疫ICR小鼠.末次免疫2w后收集血清檢測，主要是lgGl0Ig(；l/IgG2a為10.33.提示是Th2型免疫反應(yīng),有利于抗體產(chǎn)生：用瓊脂包埋7X10-CFU銅綠假單胞菌FI)4.接種在左支氣管.評價疫苗對慢性感染的保護(hù)力.空載體對照蛆存在嚴(yán)重肺損傷小鼠比率是76.2%.細(xì)菌定tt(>5X10s)的比率是69%而疫苗組分別是43.2%和40.9%,提示保護(hù)力不高O5重組抗原疫苗重組抗原疫ft'(recombinantantigenvaccin

10、e)是利用DNA頁組技術(shù)制備僅含保護(hù)性抗原的純化疫苗。Mansouri等將oprF-oprl基因亞克降入大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒.構(gòu)建pTrcIlisFI重組質(zhì)粒.成功表達(dá)和純化獲得分子覺為33kl)()prF炒卜:“廠()prI-K3融企蛋白疫苗°用20ug50/xgJOOMg或500倒分別免疫健康志愿者.1次/4w,共3次，觀察6個月。所有疫苗組Ig(；l抗體均顯著增加.50()沖組在第1次免疫后就有增加，其余組在第2次免疫后增加.提示抗體產(chǎn)生與接種疫苗劑量有關(guān)。實驗證實疫苗組血清能增加73%接種者的調(diào)理吞噬活性。DOring等進(jìn)行了Pa二價糧毛疫苗3期臨床試驗.該疫苗由20亞型為awa

11、ia2和20“g亞型為b鞭毛蛋白組成。肌肉注射疫苗3次.每月1次.1年后加強(qiáng)注射1次.產(chǎn)生高滴度的IgGJgA和SigA抗體；能減少66%的囊性纖維化病人感染銅綠假單胞菌。Weimer等:將Hie.oprF和oprl基因亞克隆入大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET29a,成功表達(dá)OprF.,11.311-()prl-flageilins融合蛋白經(jīng)實驗證實，()prF.uIJ,-()prl-flagellins融合蛋白既有利于PA的清除.又能減輕繼發(fā)性肺部損傷，是較理想的候選疫苗。Peluson等用來源于PAOI菌株天然OprF(native()prF,n-()prF)和pET28a-()prF在大腸桿菌B1

12、.21表達(dá)重組OprF(histidin-conjugatedOprF,His-OprF)體外剌激小鼠DCs(dcndriiiccells)，評價抗PA保護(hù)力和炎癥反應(yīng)。n-()prF和His-OprE刺激DCs誘導(dǎo)相似的共刺激分子(CD間和CU，,)和細(xì)胞因于的表達(dá)，產(chǎn)生高水平的】I”2p70,和低水平的IL-10以及11廠6,提示以Thl型免疫反應(yīng)為主?；剌敱淮碳Cs給C57BL/6.1W后.經(jīng)鼻腔感染3X107CFUPAOI和囊性纖維.化病人分離的黏液型PA,在PAO1感染4d和7d后.n-()prF組根據(jù)細(xì)菌計數(shù)結(jié)果表明有顯著保護(hù)力.His-OprF組在第4d顯著減少，對照組無細(xì)偏的

13、清除；與對照組比較.局部肺組織勻漿TNF-a顯著誠少JL-l2p70和IL-10增加，局部淋巴結(jié)IFN-y增加，11,-4和IL-10減少.支持局部炎癥反應(yīng)減輕的組織病理學(xué)的表現(xiàn)。在黏液型已，感染7d后，細(xì)菌清除延遲有大量細(xì)菌存在，但明顯抑制細(xì)菌的生長；盡管與對照組比較,I112p70/lFN-7增加.IL-4減少，但TNFa無顯著降低,炎癥反應(yīng)減輕程度也不及非黏液型1壽()】感染后。由此可見.疫苗的保護(hù)力與病原體的清除.炎癥病理的輕重.引流淋巴結(jié)是否以Thl型免疫反應(yīng)為主有關(guān).抗體可以保護(hù)機(jī)體免受PA感染,Thl型免疫反應(yīng)有利于Pa的清除。6重組載體疫苗重組載體疫苗(recombinantv

14、cciorvaccine)是將編碼病原體有效免疫原的基因轉(zhuǎn)入載體(常見的是減毒病毒和細(xì)慎).并能在載體中表達(dá)，隨疫苗株在體內(nèi)繁殖使大量抗原得以表達(dá)而制成的疫苗。DiGiandomenico等將編碼PA()11血清型基因克隆入pLAFRl質(zhì)粒，改稱|)LPS2.經(jīng)過三親雜交轉(zhuǎn)入arcA突變鼠型腸沙門氏菌減毒株SL3261.成功構(gòu)建LPS沙門氏菌重組載體疫苗。用該疫苗免疫BALB/c小鼠分為口服和腹腔注射組?？诜M能誘導(dǎo)高水平的也G和lgA,IfiG2a和1«G3明顯高FIgGl和Ig(；2b.產(chǎn)生良好的黏膜免疫.在支氣管灌洗液中也能觀察到高水平的lg(i和IgA°腹腔注射組能

15、誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平特異的IgG抗體】gG3亞類最高.但未能觀察到也A的增高；也(；增高的水平是口服絹的2倍.族(；3增高的水平是口服組的4倍。Arnold等"將編碼Met-Ala-(His).t-()prFl3irOprLIJU融合蛋白基因插入pMW151、pMW209和PMW210質(zhì)粒Pg啟動子的下游后.轉(zhuǎn)入aroA突變鼠型腸沙門氏儡減毒株SL3261.口服途徑免疫小鼠.SL3261(pMW151)可誘導(dǎo)最高水平的蛋白表達(dá).但是未能誘導(dǎo)任何可檢查到的系統(tǒng)的或黏膜的抗體；SL3261(pMW210)在小鼠的腸相關(guān)淋巴組織中有最好的感染.誘導(dǎo)中等程度的免疫反應(yīng).產(chǎn)生高水平的IgA；Sl,3

16、261(pMW2()9)可誘導(dǎo)高水平的IgAJg(；和lg(；2aJgGl/IgG2a分析提示以Thl型免疫反應(yīng)為主。Worgall等1?將OprF蛋白的Epi1、Epi6和Epi8B細(xì)胞表位基因插入腺病毒5(Ad5)衣殼蛋白基因組中.成功構(gòu)建AdZ.Epil、AdZ.Epi6和AdZ.Epi8疫苗。用1X10"pu分別免疫小鼠28d后,AdZ.EPi8組產(chǎn)生比AdZ.Epil和AdZ.Epi1組更高水平的抗銅綠假單胞菌IgG.再次免疫可增加7倍IgG水平。用AdZ.Epi8免疫小鼠后5w.用致死劑量(oXIO'CEU)攻擊.80%的小鼠存活超過2w.對照組存活不超過48ho

17、AdZ.Epi8免疫不同的小鼠產(chǎn)生不同的I”；亞類.在C57HIJ6小鼠I：要是lg(；2h：在BALB/c小鼠中l(wèi)g(；2h水平比Ig(i2a高；在CBA鼠中Ig(；亞類水平依次是IRG2a>Ig(；2b>lg(；3.iiE明Epi8既是B細(xì)胞表位.乂是T細(xì)胞表位cAdZ.Epi8免疫C57BI76小鼠1()d后.在小鼠脾細(xì)胞中檢霞到Epi8特異性的】FN-y增加,與對照絹相比.Epi8特異性的('1)4T細(xì)胞增加】8%.('D8T細(xì)胞增加38%,證明AdZ.Epi8疫苗既誘導(dǎo)良好的體液免疫.又誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫是右.希望應(yīng)用于臨床的疫苗。綜上所述.迄今為止還沒有真

18、正的能阻止銅綠假單胞俯感染或能起治療作用的疫苗面世.而M幾乎所有的研究是在動物中進(jìn)行的.少數(shù)在人體進(jìn)行的臨床試驗也不盡人意.需要進(jìn)步研究安全性好、保護(hù)力高的疫苗。參考文獻(xiàn)：11.X'rippsAW.PzkKIkmklcyM.vtal.Safelyandimnuinogc-nicilyofanoraliiutciivaudwhole-rdlPseiulomoimsvarcinvcrciltohealthyhuinKiisubjcristJ3.Infvcl】mnum.2006.74(2)：968-974.C2'Priebe(»P.BrinigMM.IlatanoKvial

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