腦海綿狀血管瘤遺傳家系永生細(xì)胞株的建立

1、    【關(guān)鍵詞】  血管瘤,海綿狀中樞神經(jīng)系統(tǒng)；皰疹病毒4型,人；B淋巴細(xì)胞；細(xì)胞系Establishment of immortal lymphoblastoid cell lines in a pedigree of cerebral cavernous malformations【Abstract】 AIM: To establish immortal lymphoblastoid cell lines in a pedigree of cerebral cavernous malformations(CCM). METHOD

2、S: The cell lines were constructed by means of adding EpsteinBarr virus and Cyclosporine A onto peripheral B lymphocytes. RESULTS: We successfully established 7 immortal lymphoblastoid cell lines in the family, and 5 of them suffered from CCM. CONCLUSION: These immortal lymphoblastoid cell lines wou

3、ld preserve the unique genome of CCM.【Keywords】 hemangioma, cavernous, central nevvous system; herpesvirus 4, human; B lymphocytes; Cell line【摘要】 目的： 建立腦海綿狀血管瘤家系永生細(xì)胞株. 方法： 利用EB病毒轉(zhuǎn)化外周血B淋巴細(xì)胞，同時加入環(huán)孢霉素A的方法. 結(jié)果： 成功建立了該疾病家系7名成員永生細(xì)胞株，其中5名為患者. 結(jié)論： 腦海綿狀血管瘤家系永生細(xì)胞株成功建立.【關(guān)鍵詞】 血管瘤，海綿狀中樞神經(jīng)系統(tǒng)；皰疹病毒4型，人；B淋巴細(xì)胞；細(xì)胞系0引言

4、腦海綿狀血管瘤(cerebral cavernous malformation, CCM)是一種常見的腦血管先天性發(fā)育異常疾病，在臨床上可分為家族性遺傳和散發(fā)性遺傳兩大類. 該病發(fā)病率高，病因復(fù)雜，對人危害很大，是醫(yī)學(xué)和分子遺傳學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一1. 利用EB病毒(EpsteinBarr virus, EBV)轉(zhuǎn)化外周血B淋巴細(xì)胞，使其成為能連續(xù)分裂永久生存的類淋巴母細(xì)胞(lymphoblastoid)，以進(jìn)一步建立各種疾患者群的永生細(xì)胞株(immortalized cell lines)，可永久保存每種疾病個體的完整基因組，且基因組的生化和分子生物學(xué)特性不會發(fā)生變化，因而是進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)和

5、分子遺傳學(xué)研究極好的材料. 我們以EBV加環(huán)孢霉素A （cyclosporine A,CyA）的轉(zhuǎn)化技術(shù)，對采自內(nèi)蒙古左旗地區(qū)一個遺傳性CCM家系外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，成功建立了該家系7名成員（5名為患者）的永生細(xì)胞株，從而為永久保存該疾病遺傳資源以及今后進(jìn)一步研究該病的發(fā)病機(jī)制提供了可靠的實驗材料.1材料和方法1.1材料RPMI1640（Gibco）,  Hepes（Gibco）用去離子水配成1 mol/L的溶液，胎牛血清（FCS, Hyclone，美國），淋巴細(xì)胞分離液(天津)，環(huán)孢霉素A（Cyclosporine A, CyA，瑞士）用RPMI1640液稀釋成0.

6、2  g/L的儲存液，植物細(xì)胞凝集素（phaseolus vulgaris, PHA, Gibco）用去離子水配成0.2  g/L的溶液，二甲基亞砜（Sigma），青、鏈霉素（雙抗，寧夏啟元藥業(yè)）用去離子水配成10g/L的溶液，L谷氨酰胺（Sigma）用去離子水配成0.2 mol/L的溶液，非洲狨猴958細(xì)胞株（購自中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所），37 CO2培養(yǎng)箱（Shellba,美國）等. 全培養(yǎng)液按照每1L含762 mL RPMI1640, 200 mL胎牛血清，16 mL Hepes, 12 mL L谷氨酰胺，以及10 mL雙抗的比例配制；凍

7、存液按950 mL/L胎牛血清和50 mL/L二甲基亞砜的比例配制，4保存?zhèn)溆?EBV液來自B958細(xì)胞株，提取時先復(fù)蘇并培養(yǎng)B958細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞處于指數(shù)生長期時，收集全部細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融3次，再轉(zhuǎn)移至離心管中，3000 r/min離心15 min，將上清液用0.22 m濾膜過濾后分裝，-80保存.血液樣本7份，均來自內(nèi)蒙古左旗地區(qū)一個CCM遺傳病家系，家系背景清楚. 其中5人經(jīng)核磁共振檢查確診為腦海綿狀血管瘤患者. 在征得患者及其家屬知情同意的情況下，無菌采集其新鮮外周血4 mL至含0.5 mL肝素的抗凝試管中，輕搖防止血液凝固，室溫靜置24 h（CCM家系見圖1）. 本實驗所采集7份樣本

8、分別為1, 3, 5, 7, 2, 3, 4等；其中1, 3, 5, 7, 3為該疾病確診患者.圖1遺傳性腦海綿狀血管瘤家系圖（略）1.2方法將RPMI1640液2 mL加入到所采集的抗凝血液中，充分混勻，然后將其緩慢地沿管壁移入預(yù)裝有4 mL已預(yù)熱（37）淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，室溫3000 r/min離心25 min. 用吸管小心吸取中間的淋巴細(xì)胞層，將其移入另一支15 mL離心管中，并加入不完全培養(yǎng)基10 mL，將淋巴細(xì)胞團(tuán)吹散，使其在液體中均勻分布. 繼而依次2500, 2000 r/min和1500 r/min分別離心15 min，并于每次離心后棄上清，再以不完全培養(yǎng)液10 mL吹

9、散淋巴細(xì)胞. 每份全血分離出的細(xì)胞用2 mL完全培養(yǎng)液重懸，然后依次加入EBV 1.2 mL, CyA 0.4 mL和PHA 30 L，輕輕搖勻. 將細(xì)胞懸液等份轉(zhuǎn)入2個25 cm2一次性培養(yǎng)瓶中，置37，含50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后，觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況，根據(jù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和聚集情況進(jìn)行加液或半量換液，當(dāng)細(xì)胞數(shù)達(dá)到36×109/L時即可對其進(jìn)行凍存. 利用本實驗室人員建立的染色體G顯帶技術(shù)條件，比較轉(zhuǎn)化后B淋巴細(xì)胞與來自同一個體的新鮮外周血淋巴細(xì)胞的染色體的G帶，從而判斷轉(zhuǎn)化后的B淋巴細(xì)胞的染色體是否發(fā)生變異.2結(jié)果2.1轉(zhuǎn)化結(jié)果按照EBV加CyA的方法對7份血液樣本進(jìn)

10、行轉(zhuǎn)化，于轉(zhuǎn)化后第10天觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況：在顯微鏡下可看到散在的成團(tuán)細(xì)胞（圖2A），該細(xì)胞透明發(fā)亮，體積明顯增大，外壁有不規(guī)則的毛刺狀突起，即為淋巴母細(xì)胞樣B細(xì)胞；同時可以看到一些皺縮退化的細(xì)胞，此為被CyA抑制死亡的T 淋巴細(xì)胞. 約3 wk后，轉(zhuǎn)化細(xì)胞明顯增多，顯微鏡下可看到大量的永生細(xì)胞團(tuán)（圖2B），表明轉(zhuǎn)化成功.A： 轉(zhuǎn)化初期的B淋巴細(xì)胞（×200）；B： 轉(zhuǎn)化成功×200.圖2轉(zhuǎn)化細(xì)胞形態(tài)（略）2.2轉(zhuǎn)化結(jié)果鑒定采用我室建立的永生細(xì)胞染色體G顯帶技術(shù)條件和常規(guī)染色體G顯帶技術(shù)，比較永生B淋巴細(xì)胞與來自同一個體新鮮外周血中淋巴細(xì)胞的染色體的G帶（圖3A,B），未發(fā)現(xiàn)

11、有任何變異，表明轉(zhuǎn)化后的B淋巴細(xì)胞保留了正常的染色體核型，未發(fā)生畸變.A： 外周血淋巴細(xì)胞的染色體G顯帶（×100）；B轉(zhuǎn)化后（×100）.圖3染色體核型分析結(jié)果（略）2.3細(xì)胞株穩(wěn)定性的驗證當(dāng)已經(jīng)轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞培養(yǎng)至密度達(dá)到3×109/L以上時，即可對其進(jìn)行凍存，并分別于凍存后1/3 mo, 1 mo和6 mo后進(jìn)行了復(fù)蘇、培養(yǎng)和鑒定，該細(xì)胞株依然保持旺盛的增殖特性，且染色體核型未發(fā)生變異，表明建株成功，即成功獲得了CCM遺傳家系的永生細(xì)胞株.3討論以EBV加CyA感染并轉(zhuǎn)化人外周血淋巴細(xì)胞的方法所建立的永生細(xì)胞株具有永久生存和增殖的特性，而且該細(xì)胞株還可以穩(wěn)定

12、保持供血者原有細(xì)胞核型及各種遺傳信息和遺傳特性，并且凍存后的細(xì)胞可以隨時復(fù)蘇以作相關(guān)研究2. 因此，利用該技術(shù)建立疾病細(xì)胞株可避免因患者死亡或其他原因造成的實驗材料丟失以及反復(fù)采血所帶來的不便，從而為廣泛、深入研究疾病的病因、發(fā)病機(jī)制及防治等提供永久的實驗材料3. EBV主要是通過結(jié)合B淋巴細(xì)胞表面上的EBV受體（補(bǔ)體受體）CR2而感染B淋巴細(xì)胞. 被感染B細(xì)胞在EBV核抗原EBNA的刺激下轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞，其端粒酶活性提高，維護(hù)了細(xì)胞染色體端粒長度的穩(wěn)定，并能夠不斷分裂增殖，從而促使B淋巴細(xì)胞的永生性生長4. 對EBV基因組序列及其表達(dá)的研究主要是用B958株進(jìn)行的，B958細(xì)胞株是用

13、從患傳染性單核細(xì)胞增多癥患者B細(xì)胞內(nèi)提取的EBV感染非洲絨猴B淋巴細(xì)胞建立的5. 我們培養(yǎng)購自中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所的B958細(xì)胞株并提取EBV進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到了具有高效價的EBV，轉(zhuǎn)化一次成功率達(dá)到100%.由于絕大部分人都曾受到過EBV的感染，人體內(nèi)會產(chǎn)生出對EBV的免疫反應(yīng)，尤其是細(xì)胞免疫反應(yīng). 血清中抗EBV陽性個體的淋巴細(xì)胞中含有對EBV特異的記憶T細(xì)胞. 當(dāng)用EBV感染B細(xì)胞的同時，EBV特異的記憶T細(xì)胞也被激活，這導(dǎo)致對EBV轉(zhuǎn)化的自體B細(xì)胞產(chǎn)生特異的細(xì)胞毒作用6. 為了避免這種現(xiàn)象的產(chǎn)生，我們采用具有明顯選擇性抑制T細(xì)胞的CyA. CyA是一種由11個氨基酸組成的高脂溶

14、性多肽，它是一種新型的強(qiáng)效免疫抑制劑，在EBV轉(zhuǎn)化中可以有效地阻抑T細(xì)胞對B細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，防止轉(zhuǎn)化B細(xì)胞的退化，從而保證B細(xì)胞的增殖7.通常在細(xì)胞株的建立時，每4 mL全血分離的淋巴細(xì)胞中，CyA的終濃度以2 mg/L為宜. CyA加入的時間以在EBV感染后24 h內(nèi)效果較好，若在72 h后再加入則由于T淋巴細(xì)胞已經(jīng)增殖生長，使得CyA不能起到明顯的抑制作用8. PHA是從豆科植物種子中提取的凝集素，該凝集素能夠刺激淋巴細(xì)胞幼稚化和分裂增殖. 為了提高EBV轉(zhuǎn)化效率，在EBV感染之前常用PHA處理淋巴細(xì)胞，它能起到輔助細(xì)胞增殖的作用，從而可以明顯提高B淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率9. 本研究中，我們

15、采用轉(zhuǎn)化同時加入CyA和PHA的辦法，達(dá)到了滿意的轉(zhuǎn)化結(jié)果，全部標(biāo)本均一次轉(zhuǎn)化成功. 為今后進(jìn)一步研究CCM的遺傳機(jī)理提供了寶貴的實驗材料.【參考文獻(xiàn)】1 紀(jì)寶虎，王玉炯. 腦海綿狀血管瘤的研究進(jìn)展J. 國外醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分冊，2004，27（6）：384-387.2 Neitzel H. A routine method of the establishment of permanent growing lymphoblastoid cell linesJ. Hum Genet,1986,73:320-326.3 趙蘇瑛,張海軍,徐春宏，等. 非綜合征耳聾大家系永生細(xì)胞系的建立及幾種EB病毒轉(zhuǎn)化

16、外周血淋巴細(xì)胞建系方法的探討J. 遺傳,2005,27(3):447-450.4 Coben J. EpsteinBarr virus infectionJ. N Engl J Med, 2000,343(7):481-484.5 T sugel, Morish T, Kimura H, et al. Impaired cytoxic T lymphocyte response to EpsteinBarr virus infected NK cells in patients with sever chronic active EBV infectionJ. J Med Virol,2001,64(2):141-148.6 王養(yǎng)政,曹惠玲. 環(huán)抱霉素A滴眼液的制備原理及臨床應(yīng)用J. 中華醫(yī)藥雜志,2003,9(3):723-725.7 Mobyuddin A, Ayub Q, Sidiqi S, et al. Genetic instability in EBV transformed lymphoblastoid cell lineJ. Biochem Bi