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1、蛋白表達(dá)不同檢測(cè)方式的比較和分析免疫組化法(immunohistochemistry)原理:免疫組化,是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理抗原抗體反應(yīng),即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì)),對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究,稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。特點(diǎn):是融合了免疫學(xué)原理(抗原抗體特異性結(jié)合)和組織學(xué)技術(shù)(組織的取材、固定、包埋、切片、脫蠟、水化等),通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色
2、,來對(duì)組織(細(xì)胞)內(nèi)抗原進(jìn)行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。樣本是細(xì)胞或組織,要在顯微鏡下觀察結(jié)果,可能出現(xiàn)膜陽性、質(zhì)陽性和核陽性。蛋白免疫印跡( Western Blot)原理:蛋白質(zhì)印跡法是將電泳分離后的細(xì)胞或組織總蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物NC膜或PVDF膜上,然后用特異性抗體檢測(cè)某特定抗原的一種蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)。特點(diǎn):先要進(jìn)行SDS-PAGE,然后將分離開的蛋白質(zhì)樣品用電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移到固相載體上,而后利用抗原-抗體-標(biāo)記物顯色來檢測(cè)樣品,可以用于定性和半定量。ELISA檢測(cè)原理:酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法,簡(jiǎn)稱酶聯(lián)免疫法,或者ELISA法,它的中心就是讓抗體與酶復(fù)合物結(jié)合,然后通過顯色來檢
3、測(cè)。特點(diǎn):用到了免疫學(xué)原理和化學(xué)反應(yīng)顯色,待測(cè)的樣品多是血清、血漿、尿液、細(xì)胞或組織培養(yǎng)上清液,因而沒有用到組織包埋、切片等技術(shù),這是與免疫組化的主要區(qū)別,操作上 開始需要將抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面,從而使后來形成的抗原-抗體-酶-底物復(fù)合物粘附在載體上,這就是“吸附”的含義。 免疫組化和elisa所用到的原理 大致相同,只是因?yàn)樗鶛z測(cè)的樣品不同,從而在操作方法上有所不同。Elisa多用于定量分析,其靈敏度非常高。3種蛋白檢測(cè)水平的比較蛋白檢測(cè)方式免疫組化法Western blot法ELISA試劑盒法相同點(diǎn)原理:抗體-抗原結(jié)合反應(yīng)不同點(diǎn)樣品類型組織或細(xì)胞組織或細(xì)胞血清、血漿、尿液、細(xì)胞或組
4、織培養(yǎng)上清液分析方式定位、定性及定量的研究(主要是定位,定位敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Western blot法)可以用于定性和半定量,定量較免疫組化法準(zhǔn)確多用于定量分析,其靈敏度非常高觀察結(jié)果免疫組化圖(膜陽性、質(zhì)陽性和核陽性)電泳圖(著色的位置和著色深度)蛋白濃度優(yōu)點(diǎn)特異性強(qiáng)、敏感性高、定位準(zhǔn)確、形態(tài)與功能相結(jié)合分析容量大、敏感度高、特異性強(qiáng)靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定、易于自動(dòng)化操作及節(jié)省實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)應(yīng)用范圍惡性腫瘤的診斷與鑒別診斷;確定轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的原發(fā)部位;對(duì)某類腫瘤進(jìn)行進(jìn)一步的病理分型;軟組織腫瘤的治療一般需根據(jù)正確的組織學(xué)分類,因其種類多、組織形態(tài)相像,有時(shí)難以區(qū)分其組織來源,應(yīng)用多種標(biāo)志進(jìn)行
5、免疫組化研究對(duì)軟組織腫瘤的診斷是不可缺少的;發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶,有助于臨床治療方案的確定,包括手術(shù)范圍的確定。為臨床提供治療方案的選擇。是檢測(cè)蛋白質(zhì)特性、表達(dá)與分布的一種最常用的方法。組織抗原的定性定量檢測(cè);多肽分子的質(zhì)量測(cè)定;病毒的抗體(或抗原)檢測(cè);疾病早期診斷是分泌性蛋白檢測(cè)首選方法之一。免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位;研究抗酶抗體的合成;顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。定量檢測(cè)體液中抗原或抗體成份?!径喾N病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷】各組檢測(cè)方法之間的差別及特點(diǎn):以下是western和ELISA的區(qū)別:1. western blotting 可以看到特異性的條帶,但
6、是定量比較煩2. ELISA可以直接讀出濃度,但是如果抗體有非特異性結(jié)合,那得到的數(shù)值就不可信。3. WB只能半定量,但是可以檢測(cè)細(xì)胞膜蛋白,這點(diǎn)ELISA做不到4. ELISA可用定量方法檢測(cè)蛋白,也就是說可以觀察不同濃度刺激物對(duì)目的蛋白的影響 5. WB所檢測(cè)的一般是抗原,而ELISA抗原抗體都可以檢測(cè)。6. WB所檢測(cè)的抗原可以知道其分子量的大小,或是否是多聚體、降解產(chǎn)物等,一句話,WB可以確定所用抗體是與那種蛋白起作用的;而ELISA無能為力。7. WB所適用的一抗一般是線性位點(diǎn)的,ELISA線性或構(gòu)象型抗體都可以使用。從另一個(gè)意義上講,WB可以做抗體是線性位點(diǎn)還是構(gòu)象型位點(diǎn)
7、的補(bǔ)充判定,而ELISA不行。8. WB一次處理量就是一塊膠版,10-20個(gè)樣品最多了。ELISA一塊96孔板一次可以處理96個(gè)樣本,可以設(shè)置多個(gè)復(fù)孔、對(duì)照、梯度樣等來提高檢測(cè)的可信度。9. WB操作常見的非特異性條帶,膜本底差,顯色不好等缺點(diǎn)在ELISA上表現(xiàn)得要好得多。 HMGB1、MMP-9和CEA在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及臨床意義中英文實(shí)例分析:一、免疫組化(免疫組化圖陽性表達(dá)率) 二、western blotting三、ELISAImplication of Leptin-Signaling Proteins and Epstein-Barr Virus in Gastric Carcinomas一、免疫組化(免疫組化圖陽性表達(dá)率)二、western blottingeffect of varying doses of tamoxifen on ovarian his
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