第二章遺傳圖繪制

1、第二章遺傳圖繪制基因組測(cè)序?yàn)槭裁匆L圖？基因組測(cè)序策略克隆重疊群法克隆重疊群法全基因組鳥(niǎo)槍法全基因組鳥(niǎo)槍法minimal tiling path 克隆重疊群法（clone contig approach) 先繪制高密度分子標(biāo)記遺傳圖和大分子DNA克隆重疊群覆蓋的基因組物理圖，然后整合遺傳圖和物理圖，繪制基因組整合圖，挑選大分子DNA克隆逐個(gè)測(cè)序，最后進(jìn)行序列組裝。up to downup to down contig: contig:構(gòu)成一段連續(xù)的構(gòu)成一段連續(xù)的DNADNA序列的一組相互重疊的序列的一組相互重疊的DNADNA克隆克隆 全基因組鳥(niǎo)槍法(whole genome shotgun a

2、pproach) 在獲得一定的遺傳及物理圖譜信息的基礎(chǔ)上，繞過(guò)BAC克隆逐個(gè)排序的過(guò)程，全基因組被打斷進(jìn)行隨機(jī)測(cè)序，根據(jù)序列之間的重疊組裝成一系列連續(xù)的序列，再根據(jù)連續(xù)的序列上帶有的標(biāo)記將其錨定在染色體上。 down to updown to up繪制圖譜的原因基因組很大，每次測(cè)序最長(zhǎng)不超過(guò)1kb,因此基因組需要被打斷成小片段測(cè)序，而克隆重疊群法測(cè)序需要根據(jù)圖譜選擇要測(cè)序的DNA片段，減少重復(fù)測(cè)序當(dāng)利用全基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序時(shí)，小片段測(cè)序后需要組裝成完整的基因組序列，尤其是當(dāng)基因組存在大量重復(fù)順序,會(huì)干擾排序，而利用圖譜可以將測(cè)序的小片段準(zhǔn)確定位于染色體上 2.1 遺傳圖與物理圖 2.1.1 遺傳

3、圖 遺傳圖是應(yīng)用遺傳學(xué)分析方法（雜交實(shí)驗(yàn)或者家系分析）將基因或其他DNA分子標(biāo)記標(biāo)定在染色體上構(gòu)建的連鎖圖。遺傳圖距單位為厘摩(cM), 每單位厘摩定義為1%交換率。 2.1.2 物理圖物理圖是應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)直接將DNA分子標(biāo)記、基因或克隆標(biāo)定在基因組實(shí)際位置。物理圖的距離依作圖方法而異，如輻射雜種作圖的計(jì)算單位為厘鐳(cR), 限制性片段作圖與克隆作圖的圖距為DNA的分子長(zhǎng)度，即堿基對(duì)(bp, kb or Mb)2.2 遺傳作圖標(biāo)記 遺傳標(biāo)記（genetic marker) 遺傳圖有特征性的位置標(biāo)記，用于表示基因組中特定順序所在的位置。這些標(biāo)記按孟德?tīng)柗绞竭z傳，標(biāo)記位點(diǎn)應(yīng)是多態(tài)的遺傳標(biāo)

4、記的類型 基因標(biāo)記 DNA標(biāo)記 2.2.1 基因標(biāo)記（性狀標(biāo)記）肉眼可分辨表型的遺傳標(biāo)記基因 比如第一張果蠅遺傳圖譜顯示了負(fù)責(zé)身體顏色、眼睛顏色、翅膀形態(tài)等基因的位置缺點(diǎn)：可見(jiàn)表型性狀數(shù)目十分有限，并且往往多個(gè)基因影響同一性狀，因此分析很困難 2.2.1 基因標(biāo)記（性狀標(biāo)記）生化性狀基因 - -人類紅細(xì)胞人類紅細(xì)胞ABOABO血型位點(diǎn)標(biāo)記，白細(xì)胞血型位點(diǎn)標(biāo)記，白細(xì)胞HLAHLA位點(diǎn)標(biāo)記位點(diǎn)標(biāo)記 - -應(yīng)用于細(xì)菌和酵母的遺傳作圖應(yīng)用于細(xì)菌和酵母的遺傳作圖 2.2.1 基因標(biāo)記（性狀標(biāo)記） 基因標(biāo)記非常有用但并非理想，因?yàn)椋?高等生物，可用作標(biāo)記的基因十分有限 許多性狀都涉及多基因 高等生物基因組

5、中存在大量的基因間隔區(qū)，用基因標(biāo)記將在遺傳圖中留下大片的無(wú)標(biāo)記區(qū)段 并非所有等位基因可以通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)予以區(qū)分因此需要更有效的標(biāo)記！ 2.2.2 DNA 標(biāo)記 （DNA marker) 除基因外用于作圖的DNA片段稱為DNA標(biāo)記 DNA標(biāo)記也需要等位型成員 DNA標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)：數(shù)量多，容易識(shí)別，適合大規(guī)模開(kāi)展工作 包括三種類型： 1) 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 （restriction fragment length polymorphisms，RFLPs） 2)簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性 (simple sequence length polymorphisms,SSLPs) 3)單核苷酸多態(tài)性(singl

6、e nucleotide polymorphisms,SNPs) 2.2.2 DNA 標(biāo)記 （DNA marker)1)RFLPs 最早發(fā)現(xiàn)的分子標(biāo)記，被稱為第一代分子標(biāo)記 使用限制性內(nèi)切酶消化某個(gè)DNA分子后出現(xiàn)的長(zhǎng)度多態(tài)性 DNA序列上的微小變化，甚至1個(gè)核苷酸的變化，也能引起限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的丟失或產(chǎn)生，導(dǎo)致酶切片段長(zhǎng)度的變化RFLPs的產(chǎn)生RFLPs的檢測(cè)方法RFLPs的特點(diǎn)：i) 處于染色體上的位置相對(duì)固定; ii) 同一親本及其子代相同位點(diǎn)上的多態(tài)性片段特征不變; iii)同一凝膠電泳可顯示不同多態(tài)性片段，表現(xiàn)為共顯性； iv) 通常只有兩種等位形式 2.2.2 DNA標(biāo)記2）SS

7、LPs 是由于簡(jiǎn)單序列的重復(fù)次數(shù)不同，表現(xiàn)出DNA序列長(zhǎng)度不同而產(chǎn)生的多態(tài)性 具多等位性（multiallelic) 第二代分子標(biāo)記SSLPs可分為兩種類型：小衛(wèi)星DNA（minisatellite DNA)又稱為可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)（variable number of tandem repeat,VNTRVNTR)。重復(fù)單位長(zhǎng)度為15-65個(gè)左右的核苷酸,一般長(zhǎng)度不超過(guò)20kb微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA）又稱簡(jiǎn)單序列重復(fù)（simple sequence repeat，SSRSSR），或稱短串聯(lián)重復(fù)（short tandem repeat，STR），重復(fù)單位長(zhǎng)度為2-6

8、個(gè),一般重復(fù)10-60次微衛(wèi)星比小衛(wèi)星更常用做DNA標(biāo)記 小衛(wèi)星在基因組中分布不均勻，更常見(jiàn)于染色體末端和著絲粒區(qū)。微衛(wèi)星序列在整個(gè)基因組中分布均勻，而且密度高；小衛(wèi)星不適用于PCR分型，因?yàn)樗闹貜?fù)單位較長(zhǎng)，可以形成20kb長(zhǎng)的聚集區(qū)，而微衛(wèi)星區(qū)較短，通常小于150bp，用PCR擴(kuò)增時(shí)反應(yīng)快又精確。人類基因組約有6.5105個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記由于重復(fù)單位的不同，微衛(wèi)星存在著多種不同的類型,并且出現(xiàn)的頻率也有差異 -在人類基因組中，最豐富的微衛(wèi)星是(AC)n、(AAAN)n、(AAN)n和(AG)n。(AG)n是作圖中應(yīng)用最廣的重復(fù)序列 -(AT)n是植物基因組中最豐富的微衛(wèi)星 STR/SSR的檢測(cè)

9、SSLP的特點(diǎn) i)染色體上的位置相對(duì)固定; ii) 操作簡(jiǎn)單，可以用PCR分型; iii) 同一凝膠電泳可顯示不同多態(tài)性片段, 表現(xiàn)為共顯性； iv）有多種等位形式由于SSLP標(biāo)記多態(tài)性頻率高，分布均勻，易于檢測(cè)，是目前流行的分子標(biāo)記 2.2.2 DNA標(biāo)記 3) SNPs 第3代分子標(biāo)記SNP就是基因組DNA序列中由于單個(gè)核苷酸的突變而引起的多態(tài)性點(diǎn)突變分為轉(zhuǎn)換和顛換，比例為2：1SNP不再以DNA片段的長(zhǎng)度變化作為檢測(cè)手段，而直接以序列變異作為標(biāo)記SNP的特點(diǎn) i)理論上同一堿基位置SNP等位型式最多為4，但多數(shù)為2； ii) 數(shù)量極大, 人類基因組大約有1000萬(wàn)個(gè)SNP； iii)

10、SNP與人類易感性疾病有關(guān), 涉及藥物基因組學(xué)； iv) 編碼區(qū)SNP主要分布在密碼子的第3個(gè)堿基位置SNP的檢測(cè)可通過(guò)DNA 芯片技術(shù)或者直接測(cè)序幾種分子標(biāo)記特點(diǎn)的比較幾種分子標(biāo)記特點(diǎn)的比較標(biāo)記類型標(biāo)記類型 帶型帶型 等位型等位型 穩(wěn)定性穩(wěn)定性 技術(shù)難度技術(shù)難度 費(fèi)用費(fèi)用RFLPRFLP 共顯性共顯性 2 2 高高 難難 高高 SSLPSSLP 共顯性共顯性 多多 高高 易易 低低 SNP SNP 共顯性共顯性 2 2 高高 易易 高高 2.3 遺傳作圖的方法2.3.1 連鎖分析 遺傳作圖主要依賴于連鎖分析1905，Bateson，Saunder和Punnett；1911年Morgan揭示了

11、連鎖分析的意義 同一染色體上的兩個(gè)基因理論上應(yīng)該共同傳遞給下一代。但事實(shí)上同一染色體上的完全連鎖的想象只有極少數(shù)。大多數(shù)的基因是部分連鎖的摩爾根用減數(shù)分裂時(shí)染色體的行為解釋了同一染色體上的基因部分連鎖的現(xiàn)象部分連鎖的原因是基因之間發(fā)生了交換部分連鎖的原因是基因之間發(fā)生了交換 摩爾根學(xué)生Sturtevant提出如果交換是隨機(jī)發(fā)生的，一對(duì)并列的染色單體上任何兩點(diǎn)發(fā)生交換的機(jī)會(huì)是均等的，那么基因間因交換而去連鎖的概率與它們?cè)谌旧w的距離成正比 因此重組率可以成為測(cè)量?jī)蓚€(gè)基因之間相對(duì)距離的尺度 計(jì)算出不同基因間的重組率，就可以構(gòu)建出顯示基因在染色體上相對(duì)位置的圖。通過(guò)重組率作遺傳圖遺傳作圖的偏離染色體

12、上有重組熱點(diǎn)（recombination hotspot)，染色體上這些位點(diǎn)之間比其它位點(diǎn)間有更高的交換頻率，比如近端粒區(qū)和遠(yuǎn)著絲粒區(qū)有較高的的重組頻率 性別之間也有重組頻率的差異 兩個(gè)基因間的多次交換會(huì)造成距離減少的假象雖然遺傳作圖有偏離的缺點(diǎn)，但通常能正確推斷出基因的順序，而且對(duì)基因間距離估計(jì)雖然遺傳作圖有偏離的缺點(diǎn)，但通常能正確推斷出基因的順序，而且對(duì)基因間距離估計(jì)的精確度足以構(gòu)建出可為基因組測(cè)序計(jì)劃提供框架的遺傳圖的精確度足以構(gòu)建出可為基因組測(cè)序計(jì)劃提供框架的遺傳圖2.3.2 不同模式生物的連鎖分析有性雜交實(shí)驗(yàn) 可進(jìn)行有計(jì)劃的遺傳實(shí)驗(yàn)的材料，如果蠅、老鼠、水稻、玉米等系譜分析 不能進(jìn)行

13、有計(jì)劃的遺傳實(shí)驗(yàn)的材料，如人類、多年生樹(shù)木DNA轉(zhuǎn)移 不發(fā)生減數(shù)分裂的生物，如細(xì)菌和病毒有性雜交實(shí)驗(yàn)的連鎖分析 遺傳作圖的關(guān)鍵在于確定減數(shù)分裂產(chǎn)生的配子基因型，但一般情況下檢測(cè)配子基因型很困難 通常是進(jìn)行遺傳雜交實(shí)驗(yàn)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定分別來(lái)自于兩個(gè)親本的配子融合產(chǎn)生二倍體子代的基因型，標(biāo)準(zhǔn)方法是測(cè)交分析（test cross) 兩點(diǎn)雜交 多點(diǎn)雜交兩點(diǎn)雜交三點(diǎn)雜交這個(gè)實(shí)驗(yàn)可確定標(biāo)記C位于標(biāo)記AB之間用性狀為標(biāo)記作圖有很大的局限性，只能通過(guò)對(duì)下一代個(gè)體性狀的分離才能推測(cè)出上一代配子的基因型組成DNA分子標(biāo)記不以表型為參照，直接檢測(cè)個(gè)體基因型組成，具有共顯性特點(diǎn)，可提供當(dāng)代個(gè)體基因型的分離比 以DNA分子標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖的操作程序與經(jīng)典的遺傳作圖類似，只是統(tǒng)計(jì)的性狀是DNA標(biāo)記SSR分子標(biāo)記連鎖圖繪制SSR分子標(biāo)記連鎖圖繪制系譜分析作圖 系譜分析法即對(duì)某家庭性狀相關(guān)成員進(jìn)行 統(tǒng)計(jì)，分析性狀之間的連鎖關(guān)系，通過(guò)重組率進(jìn)行相關(guān)基因定位。人類系譜分析細(xì)菌的遺傳作圖 接合