方法學(xué)驗(yàn)證的相關(guān)內(nèi)容學(xué)習(xí)

1、方法學(xué)驗(yàn)證的相關(guān)內(nèi)容學(xué)習(xí)日期：2008-09-17來(lái)源：中國(guó)藥品生物制品檢定所作者：wangchen序體：大 中小本文由 wangchen 根據(jù)藥物所張金蘭教授的授業(yè)內(nèi)容整理而成 內(nèi)容提要：（方法學(xué)驗(yàn)證的應(yīng)用、依據(jù)、類型、一般參數(shù)、要求） 驗(yàn)證應(yīng)用： 方法驗(yàn)證是對(duì)測(cè)定方法的評(píng)價(jià)，是建立新方法的研究?jī)?nèi)容和依據(jù)。（新建方法、已建立方法的修訂驗(yàn)證、已建方法的復(fù)現(xiàn)）驗(yàn)證依據(jù)： 方法應(yīng)用領(lǐng)域?qū)Ψ椒?yàn)證要求的 “指導(dǎo)原則 ”驗(yàn)證類型： 全部驗(yàn)證 Fall validation 、部分驗(yàn)證 Partial validation 、交叉驗(yàn)證 cross validationlFull validation ：

2、第一次新建方法； 一個(gè)已建方法， 但增加分析對(duì)象 （精密、 回收）。lPartial validation ：（已建方法的部分改變）1）分析方法改變（檢測(cè)器改變）；2）生物樣品（抗凝劑改變）；3）基質(zhì)改變（血尿）；4）前處理方法改變；5）生物樣品種屬改變（ rat 大鼠 mouse 小鼠）；6）儀器改變工作軟件改變；7）稀有生物樣品，取樣量有限。lCross validation ：樣品分析在不同場(chǎng)所或?qū)嶒?yàn)室進(jìn)行時(shí)，不同實(shí)驗(yàn)室需進(jìn)行加樣生物樣品或?qū)嶋H樣品分析，建立實(shí)驗(yàn)室間的重現(xiàn)性數(shù)據(jù)。當(dāng)分析數(shù)據(jù)由不同檢測(cè)技 術(shù)產(chǎn)生時(shí) LC MS vs ELSD 需交叉驗(yàn)證部分驗(yàn)證：準(zhǔn)確度，精密度（都做） 交叉

3、驗(yàn)證：加樣準(zhǔn)確度，實(shí)際樣品分析（任一）一般參數(shù)：精密度 precision:同一勻質(zhì)樣品的一組測(cè)量值，彼此符合的程度。1) SD 標(biāo)準(zhǔn)偏差 standard deviation2) % RSD 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 relative SD , CV 變異系數(shù)n>8標(biāo)準(zhǔn)差 SD=開(kāi)方(求和(xi x均值)/ (n 1)% RSD = SD/x 均值 X100 %l日內(nèi)精密度(intraday precision ):同一次測(cè)定，710份，按方法做。測(cè)定，SD值，RSD限度(生物制品 5 %，藥品2 %)。l日間精密度(in terday precision ):不同一次測(cè)定，710份，按方法做。測(cè)

4、定,SD值，RSD限度(生物制品15 %，藥品5 %)。準(zhǔn)確性 accuracy :l結(jié)果與真值的接近程度，表示分析方法測(cè)定的正確性，通常用回收率實(shí)驗(yàn)表示(加樣回收率)。l回收率=(測(cè)定液測(cè)定值原樣液含測(cè)值)/加入量值X100 %靈敏度：l 檢測(cè)限(limit of detection LOD ):分析方法能從背景信號(hào)中區(qū)分出藥物，所需樣 品中藥物的最低濃度，LOD反映方法與儀器的靈敏度和噪音也表明樣品經(jīng)處理后本 底值的高低。S/N>3l 定量限(limit of quantitation LOQ )在保證具有一定可靠性(一定準(zhǔn)確度和精密 度)分析方法能夠測(cè)定出樣品中藥物的最低濃度。反映

5、分析方法測(cè)定含藥物的低濃 度樣品時(shí)的可靠性。選擇性(selectivity )：分析方法從其他成分中區(qū)分并定量目標(biāo)成分的能力l 專屬性(specificity ):指一種方法僅對(duì)一種分析成分產(chǎn)生唯一信號(hào)l 選擇性(selectivity ):指一種方法可對(duì)多種成分產(chǎn)生不同響應(yīng)，主要成分響應(yīng)可與其他成分區(qū)分選擇性的區(qū)分選擇內(nèi)容:n化藥：雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、相關(guān)化合物、制劑輔料（可通過(guò)空白比較和添加法所得分析結(jié)果比較確定）n體內(nèi)藥物：內(nèi)源性物質(zhì)、代謝物、分解產(chǎn)物、分析中的相伴物、內(nèi)源性代謝物n體內(nèi)藥分的選擇性內(nèi)容：空白生物樣品（血尿、膽汁等）、至少六個(gè)來(lái)源的生物樣品（非 MS方法）、每個(gè)空白樣品均測(cè)定

6、干擾和LOQ 。線性（liner ）：I給定范圍內(nèi)獲取與樣品中供試物濃度成正比的試驗(yàn)結(jié)果的能力I線性范圍是指利用一種方法取得精密度、準(zhǔn)確度均符合要求的試驗(yàn)結(jié)果，而且呈線性的供試物濃度的變化范圍其最大、最小量間的間隔。I濃度范圍包括5-8個(gè)濃度點(diǎn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)覆蓋樣品濃度范圍。1. 藥物一般80-120% （但低限不低于LOQ）2. 體內(nèi)藥物、濃度上線高于樣品最高濃度，下限為 LOQ3. 相關(guān)系數(shù)（r）表示了線性度岸0.9900重現(xiàn)性（Repeatibility ）相同方法在正常條件下多次重復(fù)測(cè)定同一勻質(zhì)樣品所得分析結(jié)果的重現(xiàn)程度。穩(wěn)定性（Stability ）l生物樣品中藥物的穩(wěn)定性涉及儲(chǔ)存條件

7、、藥物理化性質(zhì)、基質(zhì)、容器系統(tǒng)。l Stability評(píng)價(jià)包括：樣品收集與前處理、短期儲(chǔ)存、長(zhǎng)期儲(chǔ)存、凍融、處理后穩(wěn)定性。穩(wěn)定性試驗(yàn)要求l Stability考察條件應(yīng)反映實(shí)際測(cè)定過(guò)程的實(shí)驗(yàn)條件。l 應(yīng)包括Stocking solution 穩(wěn)定性的考察l凍融穩(wěn)定性至少高、中、低三個(gè)濃度、三個(gè)凍融過(guò)程在真實(shí)實(shí)驗(yàn)條件下保存樣品，室溫化凍，至少保存 24小時(shí)，第二、三次相同條件下至少保存12-24小時(shí)，在第三個(gè)circle時(shí)分析。l如果樣品不穩(wěn)定，應(yīng)在-70 C下保存l短期穩(wěn)定性：樣品化凍后室溫 4-24 小時(shí) 考察穩(wěn)定性l長(zhǎng)期穩(wěn)定性： 應(yīng)包括第一樣品 >最后樣品分析結(jié)束的全過(guò)程 （三個(gè)濃度

8、、 足夠樣品）l處理后穩(wěn)定性分析過(guò)程 一個(gè)方法經(jīng)建立、驗(yàn)證、正常應(yīng)用后進(jìn)行分析。分析包括： 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、 分析法與過(guò)程建立、 驗(yàn)證后方法應(yīng)用與建立分析結(jié)果認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)。 藥物定量方法： LC 、 GC 、生化免疫、同位素標(biāo)示。驗(yàn)證要求：1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線至少 6 個(gè)點(diǎn)，包括 LLOQ （標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度）、 ULOQ （最高 濃度） Upper limit of quantification2. 精密度 precision 和準(zhǔn)確度 accuracy ：三個(gè)濃度，每個(gè)濃度進(jìn)樣 5 次，測(cè) 定與理論差 < 15%、LLOQ外w 20%。三個(gè)濃度的分布要求：lowQC sample=3*LLOQ middleQC= 中間點(diǎn) highQC 接近曲線最高點(diǎn)3. 穩(wěn)定性： 2 個(gè)濃度的三次凍融 （每個(gè) 2 次？） 生物樣品的室溫穩(wěn)定性、 處 理后的穩(wěn)定性。分析數(shù)據(jù)的可接受標(biāo)準(zhǔn)1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線除 LLOQ ， CV 在 15% 以內(nèi)2. QCsample 在分析過(guò)程中合理分布3. QCsample 至少 67%-><15%最多 33%->>15% 可接受4. 每樣品周期中 QC 樣品至少 5%中藥指紋圖譜方