辛伐他汀對大鼠骨髓基質細胞成骨分化的影響

1、    辛伐他汀對大鼠骨髓基質細胞成骨分化的影響            作者：姚樹生,張柳,鄭杰 時間：2007-11-22 11:30:00                     【關鍵詞】  辛伐他?。?骨髓基質細胞；,骨質

2、疏松；,成骨細胞；,核心結合因子Effect  of  simvastatin   on   osteoblastic  differentiation  of  bone  marrow   stromal  cells  in  rats【Abstract】  AIM: To study the effect on osteoblastic differentiation and proliferation of bone marr

3、ow stromal cells in vitro by administration of simvastatin in vivo and to elucidate the mechanism of the anabolic osteogenetic  effect  of  simvastatin. METHODS:  Thirty 3monthold virgin female SD rats, weighting 250-300 g were randomly divided into 3 groups: Group 1, control, 10

4、 rats; Group 2, given simvastatin 10 mg/(kgd), 10 rats; Group 3, given simvastatin 20 mg/(kgd), 10 rats. All of the animals were given the agents through gastric tube for 28 d. At 29th day all the rats were sacrificed. Bone marrow stromal cells in femur and tibia were cultured in vitro. After treate

5、d with same condition for 14 d ALP activity of bone marrow stromal cells in supernatant was determined. The mRNA level of cbfa1 was detected by RTPCR, and cbfa1 protein expression was analyzed by Western blot. Cell count kit (CCK8) was used to examine the cell proliferation. RESULTS: After the rats

6、were administrated with differentdose simvastatin in vivo for 28 d, and then the bone marrow stromal cells were cultured for 14 d in vitro, the level of cbfa1 mRNA was increased, and the expression of cbfa1 protein also increased in a dosedependent manner, and supernatant ALP activity increased in a

7、 dosedependent manner. Ttest showed that the proliferation of bone marrow stromal cells in Group 2 had significant difference, but no significant difference in Group 3, when compared with control group. CONCLUSION: Simvastatin leads to the high expression of cbfa1 in bone marrow stromal cells and in

8、creased ALP activity, which may be parts of the mechanisms underlying the anabolic osteogenetic effect of simvastatin.【Keywords】 Simvastatin;   bone marrow stromal cell;   osteoporosis;   osteoblast;  cbfa1【摘要】  目的：研究辛伐他汀體內給藥后對大鼠骨髓基質細胞在體外培養(yǎng)過程中成骨分化和增殖的影響，探討其刺激成

9、骨的作用機制. 方法：30只SD雌性大鼠，隨機分為3組，每組10只. G1組（C）為對照組；G2組（SIM10）給予辛伐他汀10 mg/(kgd)；G3組（SIM20）給予辛伐他汀20 mg/(kgd). 連續(xù)給藥28 d后，取大鼠的骨髓細胞體外培養(yǎng)，誘導14 d后用RTPCR和Western  blot分別檢測cbfa1 mRNA和蛋白表達的變化；收集上清液，檢測細胞堿性磷酸酶；應用cell counting kit(CCK8) 測定細胞增殖情況.  結果：辛伐他汀體內干擾28 d后，再經過骨髓細胞體外培養(yǎng)誘導14 d后，cbfa1因子的mRNA及蛋白表達水平均增高，呈劑

10、量依賴關系. 上清液堿性磷酸酶表達增高，呈劑量依賴關系. 實驗組與對照組比較，G2組（10 mg）組促進細胞增殖，而G3組（20 mg組）未見顯著性差異.  結論： 辛伐他汀可促進骨髓基質細胞中cbfa1 mRNA和蛋白的表達，堿性磷酸酶活性增高，辛伐他汀刺激成骨的作用機制可能與此有關.【關鍵詞】 辛伐他汀； 骨髓基質細胞； 骨質疏松； 成骨細胞； 核心結合因子0引言他汀類藥物是競爭性3羥基3甲基戊二酰輔酶A（HMGCoA）還原酶抑制劑，能夠降低肝內膽固醇的生物合成. 是近20 a來發(fā)展起來的一類新型調脂藥，目前廣泛用于治療高膽固醇血癥. 1999年Mundy等1經過動物實驗篩選了3

11、0 000多種天然或人工化合物后發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可引起成骨細胞系的骨形成蛋白2（BMP2）的高表達，并能有效地刺激骨形成. 繼Mundy之后，同樣的發(fā)現(xiàn)，通過灌胃法口服給藥（辛伐他?。?，正常及去勢大鼠2 皆可見小梁骨量增加. 并伴隨成骨作用有破骨細胞數(shù)量的減少. 在臨床的回顧性研究中也發(fā)現(xiàn)，服用他汀類藥物可以增加血清中骨鈣素（osteocalcin,OCN）的水平3. 并降低股骨頸骨折的發(fā)病率4-5. 但具體作用機制尚不清楚，辛伐他汀對骨髓基質細胞向成骨細胞分化的作用如何，目前國內外少見報道. 本研究采用體內給藥然后體外對骨髓基質細胞培養(yǎng)誘導的方法，旨在觀察辛伐他汀對骨髓基質細胞（BMSc）成

12、骨分化的影響，以探討其促進骨形成，治療骨質疏松的機制.1材料和方法1.1材料1.2方法統(tǒng)計學處理： 實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件包進行分析. 不同給藥劑量的實驗組與對照組進行方差分析及Dunnettt檢驗，P0.05，具有統(tǒng)計學意義.2結果2.1倒置相差顯微鏡下細胞形態(tài)觀測骨髓細胞接種后68 h，骨髓基質細胞（BMS）開始貼壁. 隨培養(yǎng)時間延長，未貼壁的懸浮細胞死亡或隨細胞液丟棄. 培養(yǎng)瓶中只有貼壁的骨髓基質細胞，骨髓基質細胞呈典型梭形或多角形的成纖維細胞. 培養(yǎng)約56 d后，細胞融匯至0.8左右.2.2RTPCR骨髓基質細胞在辛伐他汀給藥組中cbfa1的mR

13、NA水平較對照組升高，G3組（20 mg組）水平更高（P<0.01,表1，圖1）.表1不同組別cbfa1 mRNA的表達(略)2.3Western  blot結果顯示辛伐他汀給藥組G2 和G3組較對照組核蛋白cbfa1表達增高，而G3組（20 mg組）表達更高(P<0.01,表2，圖2).表2不同組別cbfa1蛋白的表達(略)2.4上清液ALP活性辛伐他汀給藥組ALP活性高于對照組. G3組（20 mg組）增加更顯著(P<0.01, 圖3）.2.5細胞增殖與對照組比較，辛伐他汀給藥組中，G2組（10 mg組）與對照組比較有統(tǒng)計學差異（P<0.01），可促進骨髓

14、細胞增殖，而G3組（20 mg組）未見統(tǒng)計學差異(P>0.05, 圖4).3討論通過本實驗我們發(fā)現(xiàn)辛伐他汀促進大鼠成骨細胞相關因子ALP及cbfa1基因的表達，從而促進骨髓基質細胞的成骨分化，10 mg組有促進成骨細胞增殖的作用.骨髓基質細胞作為一種多能干細胞，在特定條件下不僅可分化為成骨細胞，還可分化為脂肪細胞，成軟骨細胞，甚至神經細胞等7. 而在骨組織工程學和骨質疏松治療學方面，如何能有效的刺激BMSc定向誘導分化為成骨細胞，具有重要的理論和應用價值. ALP是成骨細胞的特異表型，ALP的活性在一定程度上反映成骨細胞分化程度和功能狀態(tài). 其活性越高，說明前成骨細胞向成熟成骨細胞分化越

15、明顯. 宋純理等8-9發(fā)現(xiàn)在辛伐他汀對骨髓基質細胞體外培養(yǎng)干擾過程中，ALP活性明顯增高，BMP2高表達并呈現(xiàn)劑量依賴關系OCN，骨橋蛋白（osteopontin，OPN）表達水平增高，呈現(xiàn)劑量依賴關系. 本研究結果與其一致，提示辛伐他汀有促進骨髓基質細胞向更多成骨細胞分化的潛質，并且可能具有刺激分化成熟的成骨細胞的成骨功能.新近研究表明，核結合因子a1 即cbfa1轉錄因子是調節(jié)成骨細胞生成的關鍵因子，屬于Runt結構域家族，因此又稱Runx2（Runt  related  gene  2）. Cbfa1是成骨細胞分化早期的標志物，它可調節(jié)OCN基因表達. Du

16、cy等10在小鼠和大鼠骨鈣素基因啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了與cbfa1的Runt結構域特異性結合的連接基序，即成骨細胞特異性作用元件2（OSE2）. 隨后又發(fā)現(xiàn)在型膠原（COI1）， OPN,骨結蛋白（ON）等成骨細胞標志基因中也存在這種啟動子元件，cbfa1通過調節(jié)這些基因在成骨細胞的表達，來促進成骨細胞的分化和成熟. 當非成骨細胞異位表達cbfa1時，可使這些細胞表達骨鈣素，而缺乏cbfa1基因的小鼠骨組織僅有軟骨細胞和軟骨，而無骨形成11. 人類常染色體顯性遺傳病鎖骨顱骨發(fā)育不良綜合癥就是由cbfa1一個等位基因突變引起12. OPG（osteoprotegerin）是由成骨細胞分泌的破骨細胞分化和

17、功能的抑制因子，其在體外培養(yǎng)細胞中的表達也同cbfa1密切相關13. 本實驗中可見到辛伐他汀促進了cbfa1因子mRNA和蛋白的表達，說明辛伐他汀可通過提高cbfa1因子的表達來促進BMS分化為成骨細胞，從而使成骨細胞表達增強.Cbfa1表達也受許多生長因子，激素以及轉錄因子的影響，Viereck等14報道cbfa1為成骨細胞分化成熟過程中BMP2, TGF和地塞米松的靶基因. 其中BMP是促進成骨細胞分化有效的細胞外因子，這類因子可通過Smads信號途徑誘導cbfa1表達，并可能通過調節(jié)cbfa1Osx和其他轉錄因子來影響成骨細胞分化15. 他汀類藥物進入體內后以前體藥物的形式對蛋白酶體有抑

18、制作用，進而抑制了BMP的下游信號調節(jié)蛋白Smad的降解，使BMP的含量增加. 但其明確，具體的作用靶點和途徑機制有待進一步研究和證實.目前已知與增殖激活有關的基因有cmyc, cfos, cjun, 與細胞周期有關的基因有組蛋白，細胞周期素基因. H4組蛋白的基因表達伴隨細胞內DNA的合成，與增殖密切相關. 本實驗中10 mg組促進細胞增殖，而20 mg組與對照組比較未見顯著性差異. 辛伐他汀對增殖作用的機制是與激活相關基因有關還是與細胞周期基因有關，是否存在雙向作用機制，即在較低劑量時促進成骨細胞增殖，而在較高劑量時抑制成骨細胞增殖尚待進一步研究證實.目前，辛伐他汀已成為治療骨質疏松的新型

19、藥物，對其成骨作用做了大量研究，但其臨床應用尚待進一步證實，同樣也有報道16，辛伐他汀可促進小鼠骨折愈合. 對骨折愈合的相關因子表達和具體作用機制未見其他報道. 因此，通過體內外實驗探討辛伐他汀對成骨作用的機制，為他汀類藥物用于臨床骨質疏松和骨折愈合治療提供依據(jù)，將更有意義.【參考文獻】1Mundy G, Garret R, Harris S, et al. Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins J. Science, 1999,286:1946-1949.2Maria P, Waldemar J, M

20、algorzata MM, et al. Effects of simvastatin on the development of osteopenia caused by ovariectomy in ratsJ. Pol J Pharmacol, 2003,55:63-71.3Chan MH, Mak TW, Chiu RW, et al.  Simvastatin inc分析法J. 第三軍醫(yī)大學學報, 2001，23：119-120.7Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potennial of adult

21、 human mesenchymal stem cellsJ. Science, 1999, 284:143-147.8宋純理,黨耕町,郭昭慶,等. 辛伐他汀對骨髓基質細胞骨形成蛋白2表達及對堿性磷酸酶的活性的影響J.中國修復重建外科, 2002, 16（6）：384-387.9宋純理, 黨耕町, 等.  辛伐他汀促進骨髓基質細胞的成骨分化 J. 北京大學學報（醫(yī)學版），2003, 35: 533-536.10Ducy P, Zhang R, Geoffroy A, et al. Osf2/Cbfa1:A transcriptional activator of osteoblast

22、 differentiationJ. Cell, 1997, 89:747-754.11Komori T, Yagi H, Nomura S, et al. Targeted disruption of cbfa1 results in a complete lack of bone formation owing to maturational arrest of osteoblasts  J. Cell, 1997, 89 (5):755-764.12Mundlos S, Otto F, Mundlos C, et al. Mutations involving the transcription factor CBFA1 cause cleidocranial dysplasia J. Cell, 1997, 89(5):773-779.13Thirunavukkarasu K, Halladay D L, Miles R R, et al. The osteoblastspecific