飼料中粗蛋白測定

1、實驗二 飼料粗蛋白的測定飼料粗蛋白測定的意義： 蛋飼料中含氮物質包括蛋白質和非蛋白質含氮化合物，兩者蛋飼料中含氮物質包括蛋白質和非蛋白質含氮化合物，兩者總稱為粗蛋白?？偡Q為粗蛋白。 蛋白質是畜禽日糧中最主要的物質之一，蛋白質是生命的物蛋白質是畜禽日糧中最主要的物質之一，蛋白質是生命的物質基礎。測定飼料中蛋白質的含量，對于初步評價飼料的營質基礎。測定飼料中蛋白質的含量，對于初步評價飼料的營養(yǎng)價值、合理開發(fā)利用飼料蛋白資源、提高產品質量、優(yōu)化養(yǎng)價值、合理開發(fā)利用飼料蛋白資源、提高產品質量、優(yōu)化飼料配方、指導經(jīng)濟核算及生產過程控制均具有極重要的意飼料配方、指導經(jīng)濟核算及生產過程控制均具有極重要的意義

2、。義。蛋白質測定方法：1 1直接法直接法根據(jù)蛋白質的物理、化學性質直接測定蛋白質含量雙縮脲法Folin酚試劑法（Lowry法）紫外吸收法（最常見的280nm）考馬斯亮蘭法（Bradford法）染料結合法2 2間接法間接法通過測定樣品中總含氮量推算蛋白質含量（根據(jù)：每種蛋白質的含氮量是恒定的，N6.25）。凱氏定氮法杜馬斯燃燒定氮法強堿直接蒸餾法飼料中粗蛋白的測定凱氏定氮法凱氏定氮法是9世紀建立的經(jīng)典方法，結果可靠但操作費時。在經(jīng)典法基礎上選擇催化劑，加快分析速度，改進儀器裝置。是目前飼料中粗蛋白分析最常用的方法。適應范圍：本方法適用于配合飼料、濃縮飼料精料補充料和單一飼料。測定原理：飼料的有機

3、物質在催化劑（如CuSO4，K2SO4或Na2SO4或Se粉）的幫助下，用濃硫酸進行消化作用，使蛋白質和氨態(tài)氮（在一定處理下也包括硝酸態(tài)氨）都轉變成氨，并被濃硫酸吸收成為硫酸銨；而非含氮物質，則以CO2，H2O，SO2狀態(tài)逸出。消化液在濃堿的作用下釋放出氨，通過蒸餾，氨隨汽水順著冷凝管流入硼酸吸收液中，并與其結合成硼酸銨，然后以甲基紅溴甲酚綠作混合指示劑，用鹽酸標準溶液滴定，求出氨的含量，再乘以一定的換算系數(shù)，即得出試樣中粗蛋白的含量。測定原理： 樣品消化樣品消化 2NH2(CH)2COOH 13H2SO4 (NH4)2SO4 6CO2 12SO2 16H2O 氮的蒸餾氮的蒸餾 2NaOH (

4、NH4)2SO4 2NH3 Na2SO4 2H2O NH3 + H3BO3=NH4H2BO3 滴定滴定 NH4H2BO3+HCl=NH4Cl+H3BO3濃硫酸的脫水性與強氧化性儀器設備： 分析天平：感量0.0001g 消煮爐或電爐 酸式或通用滴定管：25mL，50mL 消化管或者凱氏燒瓶：250mL 開始蒸餾裝置：常量直接蒸餾或半微量蒸餾式 三角瓶：150mL，250mL 容量瓶：100mL 定氮儀：以凱氏原理制造的各類型半自動和全自動蛋白質測定儀。試劑與溶液： 濃硫酸：化學純 混合催化劑：0.4g硫酸銅（CuSO45H2O），6g無水硫酸鉀或無水硫酸鈉，磨碎混勻。 400g/L氫氧化鈉溶液：

5、400g氫氧化鈉（化學純）溶于1000mL水中。 20g/L硼酸溶液：20g硼酸（化學純）溶于1000mL水中。 鹽酸標準滴定溶液：用基準物質碳酸鈉，按附錄八進行標定。c（HCl）=0.1mol/L：8.3mL濃鹽酸，注入1000mL水中（用于常量定氮法）c（HCl）=0.02mol/L:1.67mL濃鹽酸，注入1000mL水中（用于半微量定氮法） 混合指示劑：1g/L甲基紅乙醇溶液與5g/L溴甲酚綠乙醇溶液，兩溶液等體積混合，陰涼處保存期為三個月。 硫酸銨：分析純、干燥 蔗糖：分析純 硼酸吸收液（全自動定氮儀用）：10g/L硼酸溶液1000mL，加入1g/L溴甲酚綠乙醇溶液10mL，40g/

6、L氫氧化鈉溶液0.5mL混合，置陰涼處保存期為1個月。CuSO4的作用的作用防止飛濺防止飛濺實驗步驟： （1）試樣的消化 電爐消化：稱取0.20.4g試樣（含氮量580mg），準確至0.0002g,放入凱氏燒瓶中，加入6.4g混合催化劑，與試樣混合均勻，再加入濃硫酸10mL和2粒玻璃珠。將凱氏燒瓶放在通風柜里的電爐上或凱氏消化架上小心加熱。開始小火，待樣品焦化，泡沫消失，再加大火力，并消化直至溶液呈透明的藍綠色后，再加熱消化15min。 消化管消化：稱取0.20.4g試樣（含氮量580mg），準確至0.0002g,放入消化管中，加入6.4g混合催化劑與試樣混合均勻， 或加入2片商業(yè)消化片，再加

7、入濃硫酸10mL，于420下消化爐上消化6090min,取出后冷卻，用少量蒸餾水沖洗消化管帽。建議消化爐消化程序一般設定為：200，30min；420，6090min。消化時間不宜過消化時間不宜過長，會使測定結長，會使測定結果偏低果偏低防止水中氨態(tài)氮的逸失而影響測定值。實驗步驟：（2）氨的蒸餾半微量蒸餾法半微量蒸餾法使用凱氏定氮法定氮裝置。將試樣消煮液冷卻，加入20mL蒸餾水，轉入100mL容量瓶中。冷卻后用水稀釋至刻度，搖勻，作為試樣分解液。取20mL/g硼酸溶液35mL于錐形瓶中，加23滴混合指示劑，使半微量蒸餾裝置的冷凝管末端浸入此溶液。蒸汽發(fā)生器中的水應加入甲基紅指示劑數(shù)滴、硫酸數(shù)滴，

8、在蒸餾過程中保持此溶液為橙紅色，否則需補加濃硫酸。準確移取試樣分解液1020mL，注入蒸餾裝置的反應室內，用少量蒸餾水沖洗進樣入口，塞好入口玻璃塞，再加400g/L氫氧化鈉溶液10mL，小心拉起玻璃塞使之進入反應室，將玻璃塞塞好，且在入口處加水封好，防止漏氣，蒸餾4min，使冷凝管末端離開吸收液面，再蒸餾1min，用水沖洗冷凝管末端，洗液均流入錐形瓶內，然后停止蒸餾。使NH3全部吸收進硼酸 最后關閉電源，絕不能先關閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸！ 1電爐;2水蒸氣發(fā)生器(2L 燒瓶);3螺旋夾;4小玻杯及棒狀玻塞;5反應室;6反應室外層;7橡皮管及螺旋夾;8冷凝管;9蒸餾液接收瓶。凱氏半微量定氮

9、裝置冷凝管的水流冷凝管的水流方向？方向？實驗步驟：常量蒸餾法。 常量法蒸餾法使用凱氏半自動定氮儀。將試樣消煮液冷卻加入60-100mL水，搖勻，冷卻。將蒸餾裝置冷凝管的末端浸入盛有35mL硼酸吸收液和加2滴混合指示劑的錐形瓶內。然后小心地將消化管裝入儀器中，然后向消化管中加入400g/L氫氧化鈉溶液40mL(或至溶液顏色變黑，再加少許)使溶液混勻后再加熱蒸餾5min,或至蒸餾出液體積約為150mL。降下錐形瓶，使冷凝管末端離開液面，繼續(xù)蒸餾1min,并用水沖洗冷凝管末端，洗液均需流入錐形瓶內，然后停止蒸餾。開始半自動定氮儀使NH3全部吸收進硼酸校正藥品不純帶來的誤差溴甲酚綠甲基紅指示劑變色范圍

10、為5.0-5.2，pH5.0以下為暗紅色，pH5.1為灰綠色，5.2以上為綠色實驗步驟： （3）滴定。半微量蒸餾法或常量定氮法蒸餾后的吸收液，分別立即用0.02mol/L或0.1mol/L鹽酸標準滴定溶液滴定，溶液由藍綠色變?yōu)榛壹t色為終點。 （4）空白測定。稱取蔗糖0.5g，以代替試樣，按（1）試樣的消化測定步驟進行空白測定，消耗0.1mol/L鹽酸標準滴定溶液的體積不超過0.2mL。消耗0.02mol/L鹽酸標準滴定溶液的體積不超過0.3mL。 （5）蒸餾步驟的檢驗。精確稱取0.2g硫酸銨，代替試樣，按以上（1）和（2）測定步驟操作，測得硫酸銨含氮量為（21.190.2）%，否則應檢查加堿、

11、蒸餾和滴定各步驟是否正確。實驗步驟： （6）結果計算與表示 半微量定氮法和常量定氮法試樣中粗蛋白質質量分數(shù)分別按式下面兩式計算。 式中:c為鹽酸標準滴定溶液濃度，mol/L；m為試樣質量，g;V2為滴定試樣時所消耗鹽酸標準滴定溶液體積，mL; V0為試樣分解液蒸餾用移取體積，mL;0.014為與1.00mL鹽酸標準滴定溶液c(HCL)=1.000mol/L相當?shù)?、以克表示的氮的質量;6.25為氮換算成蛋白質的平均系數(shù)。 每個試樣取兩平行樣進行測定，以其算數(shù)平均值為結果。結果保留小數(shù)點后兩位。201V -V *c*VCP =*mV（） 0.014 6.25（）20V -V *c*0.014*6.

12、25CP =m（）（）實驗步驟： 7.重復性 當粗蛋白質含量在25%以上，允許相對偏差為1%;當粗蛋白質含量在10%25%，允許相對偏差為2%；當粗蛋白質含量在10%以下時，允許相對偏差為3%。注意事項： 消化時應經(jīng)常轉動凱氏燒瓶，以使消化得以快速而完全。 凱氏定氮蒸餾過程中，要求整套裝置呈密閉狀態(tài)，蒸餾前應檢查定氮儀各導管間的連接處是否密閉，以免產生泄露。 蒸餾完畢應先取下接收瓶，然后關閉電源，以免酸液倒流。 一次蒸餾后必須徹底洗凈堿液，以免再次使用時引起誤差。 含硝酸鹽較多的飼料，用凱氏定氮法測定粗蛋白時，很多硝酸鹽因還原而損失。 各種飼料的粗蛋白質中實際含氮量差異很大，其變異范圍在14.

13、7%19.5%，平均為16%。反飼料的粗蛋白質中氮含量尚未確定的，可用6.25平均系數(shù)乘以氮量換算成粗蛋白質量。反飼料中的粗蛋白質的含氮量已經(jīng)確定的，可用他們的實際系數(shù)來換算。實驗結果的討論與分析：根據(jù)測得的實驗數(shù)據(jù)，計算該樣本飼料中粗蛋白含量。標準滴定溶液的配制及標定一般規(guī)定 1 除另有規(guī)定外,本標準所用試劑的級別應在分析純(含分析純)以上,所用制劑及制品,應按GB/T603的規(guī)定制備,實驗用水應符合GB/T6682中三級水的規(guī)格。 2 本標準制備標準滴定溶液的濃度,除高氯酸標準滴定溶液、鹽酸-乙醇標準滴定溶液、亞硝酸鈉標準滴定溶液c(NaNO2)=0.5mol/L外,均指20時的濃度。在標

14、準滴定溶液標定、直接制備和使用時若溫度不為20時,應對標準滴定溶液體積進行補正(見附錄A)。規(guī)定“臨用前標定”的標準滴定溶液,若標定和使用時的溫度差異不大時,可以不進行補正。標準滴定溶液標定、直接制備和使用時所用分析天平、滴定管、單標線容量瓶、單標線吸管等按相關檢定規(guī)程定期進行檢定或校準,其中滴定管的容量測定方法按附錄B進行。單標線容量瓶、單標線吸管應有容量校正因子。 3 在標定和使用標準滴定溶液時,滴定速度一般應保持在6mL/min8mL/min。 4 稱量工作基準試劑的質量小于或等于0.5g時,按精確至0.01mg稱量;大于0.5g時,按精確至0.1mg稱量。 5 制備標準滴定溶液的濃度應

15、在規(guī)定濃度的5%范圍以內。 6 除另有規(guī)定外,標定標準滴定溶液的濃度時,需兩人進行實驗,分別做四平行,每人四平行標定結果相對極差不得大于相對重復性臨界極差CR0.95(4)r=0.15%,兩人共八平行標定結果相對極差不得大于相對重復性臨界極差CR0.95(8)r=0.18%。在運算過程中保留5位有效數(shù)字,取兩人八平行標定結果的平均值為標定結果,報出結果取4位有效數(shù)字。需要時,可采用比較法對部分標準滴定溶液的濃度進行驗證。 7 本標準中標準滴定溶液濃度的相對擴展不確定度不大于0.2%(k=2)。 8 本標準使用工作基準試劑標定標準滴定溶液的濃度。當對標準滴定溶液濃度的準確度有更高要求時,可使用標

16、準物質(擴展不確定度應小于0.05%)代替工作基準試劑進行標定或直接制備,并在計算標準滴定溶液濃度時,將其質量分數(shù)代入計算式中。 9 標準滴定溶液的濃度小于或等于0.02mol/L時(除0.02mol/L乙二胺四乙酸二鈉、氯化鋅標準滴定溶液外),應于臨用前將濃度高的標準滴定溶液用煮沸并冷卻的水稀釋(不含非水溶劑的標準滴定溶液),必要時重新標定。當需用本標準規(guī)定濃度以外的標準滴定溶液時,可參考本標準中相應標準滴定溶液的制備方法進行配制和標定。 10 貯存: a) 除另有規(guī)定外,標準滴定溶液在1030 下,密封保存時間一般不超過6個月;碘標準滴定溶液、亞硝酸鈉標準滴定溶液c(NaNO2)=0.1m

17、ol/L密封保存時間為4個月;高氯酸標準滴定溶液、氫氧化鉀-乙醇標準滴定溶液、硫酸鐵()銨標準滴定溶液密封保存時間為2個月。超過保存時間的標準滴定溶液進行復標定后可以繼續(xù)使用。 b) 標準滴定溶液在1030下,開封使用過的標準滴定溶液保存時間一般不超過2個月(傾出溶液后立即蓋緊);碘標準滴定溶液、氫氧化鉀-乙醇標準滴定溶液一般不超過1個月;亞硝酸鈉標準滴定溶液c(NaNO2)=0.1mol/L一般不超過15d;高氯酸標準滴定溶液開封后當天使用。 c) 當標準滴定溶液出現(xiàn)渾濁、沉淀、顏色變化等現(xiàn)象時,應重新制備。 11 貯存標準滴定溶液的容器,其材料不應與溶液起理化作用,壁厚最薄處不小于0.5m

18、m。 12 本標準中所用溶液以“%”表示的除“乙醇(95%)”外其他均為質量分數(shù)。標準滴定溶液的配制與標定配制及標定原理 配制原理：標定原理：K是反應系數(shù)nc =Vm=Vmn=M1122c V =k*c V以鹽酸標準滴定溶液為例：1、配制按照下表量取鹽酸，注入1000mL水中，搖勻。鹽酸標準滴定溶液的濃度鹽酸標準滴定溶液的濃度c(HCl)/(mol/L)鹽酸的體積鹽酸的體積V/mL1900.5450.19鹽酸標準滴定溶液的濃度鹽酸標準滴定溶液的濃度c(HCL)/（mol/L）工作基準試劑無水碳酸鈉的質量工作基準試劑無水碳酸鈉的質量m/g11.90.50.950.10.22、標定按照下表規(guī)定稱取于270300高溫爐中灼燒至恒重的工作基準試劑無水碳酸鈉，溶于50mL水中，加10滴溴甲酚綠甲基紅指示劑，用配制好的鹽酸溶液滴定至溶液由綠色變?yōu)榘导t色，煮沸2min，冷卻后繼續(xù)滴定至溶液