生化實(shí)驗(yàn)分析

1、生化實(shí)驗(yàn)分析果蔬成分生化分析果蔬成分的分析主要分為四個(gè)方面：維生素C含量的測(cè)定、總糖和還原糖含量的測(cè)定、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定、過(guò)氧化物酶的分析?？傮w從實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)試劑、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析的角度進(jìn)行分析一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、掌握微量測(cè)定維生素C的方法和技術(shù)。2、了解果蔬中維生素C含量。3、掌握總糖和還原糖含量的測(cè)定方法。4、掌握蛋白質(zhì)測(cè)定的方法和技術(shù)。5、了解果蔬中蛋白質(zhì)的含量。6、了解聚丙烯酰胺凝膠的制作過(guò)程及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。二.實(shí)驗(yàn)原理：1 .還原型維生素C可被氧化型2,6-二氯酚靛酚（下面簡(jiǎn)稱(chēng)染料）所氧化，成為氧化型維生素C。氧化型染料在中性或堿性溶液中呈藍(lán)色，在酸性溶液中呈紅色。成為還原型后為

2、無(wú)色。用氧化型染料來(lái)滴定還原型維生素C,當(dāng)?shù)沃寥窟€原型維生素C被氧化后，在稍滴一點(diǎn)呈微紅色為終點(diǎn)。滴定用去染料量與樣品中還原型維生素C量成正比。（此法雖簡(jiǎn)單迅速，但氧化型染料亦能使其他還原型物質(zhì)氧化，所以有一定缺點(diǎn)。）2 .慈酮比色法是一個(gè)快速而簡(jiǎn)便的定糖方法。其原理：糖類(lèi)在較高溫度下可被硫酸脫水成棣醛或糠醛衍生物，再與慈酮縮合成藍(lán)色化合物，在620nm處有最大吸收。多糖為非還原糖，可用酸將沒(méi)有還原性的多糖和寡糖徹底水解成具有還原性的單糖，再利用還原糖的性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，這樣就可分別求出總糖和還原糖的含量。3 .考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)-染料結(jié)合的原理，定量的測(cè)定微量蛋白濃度的快

3、速、靈敏的方法?？捡R斯亮藍(lán)G-250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色?？捡R斯亮藍(lán)G-250在酸性游離狀態(tài)下呈棕紅色，最大光吸收在465nm,當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，最大光吸收在595nm.在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物在波長(zhǎng)為595nm處的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，通過(guò)測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。蛋白質(zhì)和考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合，在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速，其結(jié)合物在室溫下1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù),使得在測(cè)定蛋白質(zhì)濃度時(shí)靈敏度很高，可測(cè)微克級(jí)蛋白質(zhì)含量。4 .2 / 12生化實(shí)驗(yàn)分析用聚丙烯酰胺

4、凝膠電泳法分離鑒定蛋白質(zhì)，主要依賴(lài)于電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。再與標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)照即可確定各區(qū)帶的成分。5.在有過(guò)氧化氫存在下，過(guò)氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質(zhì)，該物質(zhì)在470mn處有最大吸收，可用分光光度計(jì)測(cè)量470nm的吸光度變化測(cè)定過(guò)氧化物酶活性。三.實(shí)驗(yàn)試劑：現(xiàn)草酸溶液、2%草酸溶液、維生素C標(biāo)準(zhǔn)液、氧化型0.遙2,6-二氯酚靛酚溶液、各種果蔬、意酮試劑、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液(0.Img/mL)、6mol/LHCl溶液、20Ma0H溶液、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液、考馬斯亮蘭G-250染料試劑、0.05mol/LTris-HC1緩沖液(pH6.8),0.Imol/L磷酸緩沖液PH7.6、反應(yīng)混合液。四

5、.實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析：L果蔬中維生素C的定量測(cè)定操作：1、制備新鮮果蔬液：如洗凈新鮮橘子，擦干表面水分，剝?nèi)ネ馄?，稱(chēng)20.0g橘子放入50mL量筒中,加2%草酸液至40mL刻度處(即稀釋1倍)。用玻璃棒攪拌，靜置10分鐘,過(guò)濾，濾液即是(若樣品中含大量鐵，可用8%醋酸溶液提取，可在一定程度上延緩Fe?+還原染料)。2、染料液裝入滴定管中：應(yīng)驅(qū)除滴定管中的氣泡，調(diào)整好零點(diǎn)。3、滴定維生素C標(biāo)準(zhǔn)液：吸取1.0mL維生素C標(biāo)準(zhǔn)液放入錐形瓶中，加9mL1%草酸溶液，搖勻，用染料液滴定至微紅色保持15秒不褪色即為終點(diǎn)。記下所用去染料液數(shù)量，可算出1mL染料相當(dāng)于多少mg維生素Co4、滴定樣品液：吸取10.0

6、mL樣品液放入錐形瓶中，同上操作進(jìn)行滴定?？勺鰞煞?，求平均值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：Vc標(biāo)液用去2,6-二氧靛酚0.3ml蘿卜:20.06g,定容到40ml,每10ml消耗2,6-二氧靛酚：0.85ml;結(jié)果得：每一百克樣品中維生素C含量磋£物1里W盤(pán)菜：21.26g,定容到40mL每10ml消耗2,6-二氧靛酚：1.0ml;結(jié)果得：每一百克樣品中維生素C含量里W結(jié)果分析：不同果蔬中的維生素的含量不相同，如盤(pán)菜和蘿卜中的Vc含量有差異，造成這種差異的原因可能是：1 .沒(méi)有將果蔬充分的碾碎，維生素沒(méi)有完全釋放出來(lái)，或者一部分殘留在實(shí)驗(yàn)儀器上；2 .在過(guò)濾多的時(shí)候，沒(méi)有過(guò)濾完全，存在殘?jiān)? .在移

7、液時(shí)，常常把液體從一個(gè)容器移到另一個(gè)容器中，使實(shí)驗(yàn)的誤差較大:3 / 12生化實(shí)驗(yàn)分析4 .在滴定時(shí)，沒(méi)有明確液體剛變紅的概念，可能滴得太多；5 .滴定的時(shí)間花費(fèi)太長(zhǎng)，還原性的物質(zhì)發(fā)生了氧化。6 .總糖和還原糖含量的測(cè)定操作：1、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制，以吸光度為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)液濃度（mg/n1L）為橫坐標(biāo)做圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。2、樣品中還原糖的提取和測(cè)定稱(chēng)取1g實(shí)驗(yàn)材料，加水約3mL,在研缽中磨成勻漿，轉(zhuǎn)入三角燒瓶中，并用約30mL蒸溜水沖洗研缽23次，洗出液也轉(zhuǎn)入三角燒瓶中。于50C水浴中保溫約0.51（使還原糖浸出），取出，冷卻后定容至100mL。過(guò)濾后冰箱保存。不同果蔬需進(jìn)行不同程度稀釋。葡萄

8、：取濾液0.5mL-*100mL：梨：取濾液1mL-*100mL；盤(pán)菜、蘿卜取濾液10mL-100mL。取1mL最終稀釋液置于試管中，浸于冰浴中冷卻，再加入4mL恿酮試劑，沸水浴中煮沸l(wèi)Omin,取出冷卻后比色，其他條件與做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相同。測(cè)得的吸光度值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查算出樣品液的糖含量。3、樣品中總糖的提取、水解和測(cè)定稱(chēng)取1g實(shí)驗(yàn)材料，加水約3mL,在研缽中磨成勻漿，轉(zhuǎn)入三角燒瓶中，并用約12mL蒸馀水沖洗研缽23次，洗出液也轉(zhuǎn)入三角燒瓶中。再向三角燒瓶中加入6mol/L鹽酸10mL,攪拌均勻后在沸水浴中水解0.5h,冷卻后用20%NaOH溶液中和至pH呈中性。然后用蒸儲(chǔ)水定容至100mL,過(guò)濾后

9、冰箱保存。不同果蔬需進(jìn)行不同程度稀釋。葡萄：取濾液0.5mL-*200mL；梨：取濾液5mL->100mL；盤(pán)菜、蘿卜:取濾液10mL-H00mL,取1mL總糖的最終稀釋液同上法進(jìn)行還原糖測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：012345標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液/mL00.10.20.30.40.5蒸馀水1.00.90.80.70.60.5置冰水浴中5min藤:酮試劑4.04.04.04.04.04.0煮沸10',冷卻后室溫放置10',在620nm處比色A620nm00.0430.1820.2570.4090.456葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)還原糖：由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的溶液的濃度為：計(jì)算結(jié)果：蘿卜0.246

10、0.027mg/mlW=QYjQ%=2.7%m盤(pán)菜0.3370.037mg/mlW=3.7%總糖：蘿卜0.4270.047mg/mlW=4.7%盤(pán)菜0.3540.039mg/mlW=3.9%結(jié)果分析：在繪制他萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)，應(yīng)使圖上的點(diǎn)盡量聚集在直線(xiàn)附近，各標(biāo)準(zhǔn)液濃度與該溶液的吸光度呈線(xiàn)性關(guān)系，測(cè)定計(jì)算時(shí)可先根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液濃度查出該溶液的濃度，產(chǎn)生誤差的可能的原因有：1.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制不夠準(zhǔn)確：2 .實(shí)驗(yàn)過(guò)程中苞胴試劑加進(jìn)去后未搖勻;3 .總:胴加入的時(shí)間存在著間隔。3.果蔬中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定考馬斯亮蘭法操作：1、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制加入考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑后，搖勻,放置2min后,在595nm波長(zhǎng)

11、下比色測(cè)定,記錄A595o以各管相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量(Mg)為橫坐標(biāo)、AS95為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。2、樣品制備稱(chēng)取1g待測(cè)植物鮮樣置于冰浴上的研缽內(nèi)，加入lmLH9或0.05mol/LTris-HC1緩沖液(pH6.8)研成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，再用2mL水或緩沖液將附著在研缽壁上的研磨樣品洗下并全部轉(zhuǎn)入離心管，35OOrpm離心1520min,其上清液即為蛋白質(zhì)的提取液，供分析用。3、樣品測(cè)定試管中加自制蛋白質(zhì)樣品1.0mL,再加入5.0mL考馬斯亮藍(lán)G-25O試劑，搖勻，放置5min后,在595nni波長(zhǎng)下比色,記錄A595。根據(jù)所測(cè)A595從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得蛋白質(zhì)含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：試劑0123

12、45盤(pán)菜蘿卜lOOgg/mL牛血清白蛋白溶液/mL00.20.40.60.81.000蒸鐳水/mL1.00.80.60.40.2000考馬斯亮藍(lán)液/mL5.05.05.05.05.05.05.05.0A595nm0.0000.1780.3430.4800.6130.7250.1600.946蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可得：盤(pán)菜中蛋白質(zhì)含量為180ug;蘿卜中蛋白質(zhì)的含量為136ugo結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生誤差的原因可能是：1 .加入試劑后沒(méi)有在指定的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行比色反應(yīng)，蛋白質(zhì)失活較嚴(yán)重:2 .比色杯沒(méi)有沖洗干凈，存在一些殘留在上面。4 .過(guò)氧化物同工酶的分離（聚丙烯酰胺凝膠電泳）操作1 .貯液配制按

13、上表配制貯液，但應(yīng)注意（1）配好的貯液用棕色瓶盛裝置冰箱內(nèi)保存，可放12個(gè)月。（2）過(guò)硫酸鉉應(yīng)當(dāng)天配制。2 .電泳槽的安裝垂直板電泳槽的式樣很多，目前流行的是用有機(jī)玻璃做的兩個(gè)“半槽”組成的方形電泳槽，中間夾著凝膠模子，是由成套的兩塊玻璃板裝入一個(gè)用硅酮橡膠做成的模套而構(gòu)成，由硅胴橡膠套決定兩玻璃板之間距離約為1.5mm,形成一個(gè)“膠室”，膠就在這兩板之間的膠室內(nèi)聚合成平板膠。當(dāng)凝膠模子與兩半槽固定在一起后，凝膠槽子兩側(cè)形成前后兩個(gè)槽，供裝電極緩沖液和冷凝管用。將兩塊玻璃板用去污劑洗凈，再用蒸儲(chǔ)水沖洗，直立干燥（勿用手指接觸玻璃板面，可用手夾住玻璃板的兩旁操作），然后正確放入硅膠條中，夾在電泳

14、槽里，按對(duì)角線(xiàn)順序旋緊螺絲，注意用力均衡以免夾碎玻璃板。安裝好電泳槽用pH8.9緩沖液配制的1.5%瓊脂溶液封底，待瓊脂凝固后即可港制凝膠。3 .制膠將貯液由冰箱取出，待與室溫平衡后再配制工作液。（1）配制分離膠A3mLC6mL0.14%過(guò)硫酸鏤nL水3mLTEMED15pL將分離膠沿長(zhǎng)玻璃板加入膠室內(nèi)，小心不要產(chǎn)生氣泡，加至距短玻璃板頂端3cm處，立即小心地覆蓋231nm的水層，靜置待聚合（約40min）,當(dāng)股與水層的界而重新出現(xiàn)時(shí)表明膠已聚合。（2）配制濃縮膠B1.5mLD3mLEl.5mLF6mLTEMED18pL注：TEMED在灌膠前加，或者加完之后放在黑暗的環(huán)境中。先倒掉分離膠上的水

15、層，用吸水紙將水層吸干，但不要弄壞分離膠。立即加入濃縮膠,插入梳子（即樣品槽模板），待膠凝后，小心取出梳子。將稀釋10倍的電極緩沖液倒入兩槽中，上槽（短板側(cè)）緩沖液要求沒(méi)過(guò)樣品槽，下槽（長(zhǎng)板側(cè)）緩沖液要求沒(méi)過(guò)電極，備用。4 .樣品的制備稱(chēng)取果蔬2g,剪碎，放入研缽中，加適量石英砂及5mL的樣品提取液研磨成勻漿，置于離心管中，研缽用少量提取液清洗，洗液并入離心管，以14000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min,取上清液定溶至10mL,貯存于低溫冰箱備用。5 .點(diǎn)樣先向上槽液中加入0.1%澳酚藍(lán)34滴，攪勻。用微量注射器（50卜1）吸取1020rL樣液，在濃縮膠上層點(diǎn)樣。點(diǎn)樣時(shí)須小心，防止樣品液擴(kuò)散。

16、6 .電泳接好電源線(xiàn)（上槽即加樣槽為負(fù)極）。打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)電流到20mA左右，樣品進(jìn)入到分離股后加大到30mA,維持恒流。待指示染料下行到距膠板末端1cm處，即可停止電泳。把調(diào)節(jié)旋扭調(diào)至零，關(guān)閉電源，電泳約311。7 .剝膠取出電泳膠板，去掉膠套，用微量注射器沿玻璃內(nèi)面注入一定量的水后即可掀開(kāi)玻璃，去掉濃縮膠（注意先進(jìn)行測(cè)量），將分離膠放入培養(yǎng)皿。8 .染色、記錄結(jié)果將配制好的染色液倒入培養(yǎng)皿，室溫下1lOmin后顯示藍(lán)色條帶，后變紅褐色。用去離子水漂洗，并拍照記錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖：蘿卜：Rf=1.6-J-7.6=0.21盤(pán)菜：Rfl=4.64-7.6=0.61Rf2=1.64-7.

17、6=0.21結(jié)果分析：有實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，盤(pán)菜有2條條帶，蘿卜只有1條，由Rfl>Rf可得盤(pán)菜的過(guò)氧化物酶電泳的速度快，可知盤(pán)菜中的過(guò)氧化物酶的分子量小，蘿卜中的分子量較大。盤(pán)菜中有兩條色帶,可知盤(pán)菜中至少有兩種過(guò)氧化物酶，但是蘿卜中只看到一天清晰的可能的原因是，蘿卜中只有一條過(guò)氧化物酶或者其他的過(guò)氧化物酶的含量較少。4.過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定（比色法）操作：1.取上述的樣品提取液2.5mL,定容至50mL刻度，備用。2.取光徑1cm比色杯2只，于1只中加入反應(yīng)混合液3mL和磷酸緩沖液1mL,作為對(duì)照,另1只中加入反應(yīng)混合液3mL和上述酶液1mL（如酶活性過(guò)高可稀釋之），立即開(kāi)啟秒表記錄時(shí)間，

18、于分光光度計(jì)上測(cè)量波長(zhǎng)470nm下吸光度值，每隔Imin讀數(shù)一次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1234L5對(duì)照0.0000.0000.0000.0000.000盤(pán)菜0.5740.5710.5710.5720.574蘿卜0.2900.4420.5590.6190.656計(jì)算結(jié)果:盤(pán)菜第1分鐘第2分鐘第3分鐘第4分鐘過(guò)氧化物酶活力150010過(guò)氧化物酶比活力7.502.55蘿卜第1分鐘第2分鐘第3分鐘第4分鐘過(guò)氧化物酶活力760585300185過(guò)氧化物酶比活力380292.515092.5結(jié)果分析:有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知：蘿卜的過(guò)氧化物酶活力比盤(pán)菜強(qiáng)，盤(pán)菜第2分鐘時(shí)酶的活性為0,可能的原因是盤(pán)菜制備的時(shí)間較長(zhǎng)，使得盤(pán)菜中的過(guò)氧化物酶的活性不夠，但是第3、4分鐘時(shí)酶的活性得到了恢復(fù)，可能的原因是外界的溫度使酶的活性發(fā)生了變化。蘿卜中過(guò)氧化物酶的活性隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而減弱，是符合酶的變化規(guī)律的，所以盤(pán)菜的實(shí)驗(yàn)誤差較大。實(shí)驗(yàn)小結(jié)上述五個(gè)實(shí)驗(yàn)的分析與討論，以及需要的注意點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)一：（1）整個(gè)操作過(guò)程要迅速，防止還原型抗壞血酸被