病理切片的制作過程

1、病理切片的制作過程1.7.1 修整組織將手術切取的乳腺腫瘤切成一個平整面，各組織塊不宜太大，以便固定劑穿透和組織脫水等操作，通常以10mnrK10mnrK3mm£5mrK5mrK3mm為宜。找到不同的部位切取2塊，以備后用。1.7.2 組織洗滌組織經(jīng)修整后，組織中的福爾馬林等必須沖洗干凈，尤其是含有重金屬的物質(zhì)存在。因為殘留在組織中的福爾馬林，有的不利于染色，有的產(chǎn)生沉淀或結(jié)晶影響觀察，所以組織修整后應沖洗12h左右。1.7.3 組織脫水組織經(jīng)洗滌后，組織中含有大量水分，由于水與石蠟不能互溶，所以必須將組織中的水分除去。80%乙醇溶液:2h95%乙醇溶液:1h95%乙醇溶液:1h%乙

2、醇溶液:30min100100%乙醇溶液:30min1.7.4 組織透明由于乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟，所以脫水后還要經(jīng)過二甲苯以過渡。當組織中全部被二甲苯占有時，光線可以透過，組織呈現(xiàn)出不同程度的透明狀態(tài)。二甲苯?:30min1.7.5 組織浸蠟浸蠟的目的是除去組織中的透明劑(如二甲苯等)，使石蠟滲透到組織內(nèi)部達到飽和程度以便組織包埋。浸蠟時間根據(jù)組織的透蠟時間較長，需3h左右。浸蠟應在恒溫箱內(nèi)進行，并保持箱內(nèi)溫度在55?左右，注意溫度不要過高，以免組織發(fā)脆。石蠟?:1h石蠟?:1h。石蠟?:1h1.7.6 組織包埋將經(jīng)過透蠟的組織連同熔化的石蠟，一起倒入容器內(nèi)，然后

3、立即投入冷水中，使其立刻凝固成蠟塊的過程。包埋時，將紙盒放在溫箱旁邊，用鑷子夾取組織平放于紙盒底部，再用溫鑷子輕輕撥動組織，從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，沿壁倒入包埋用的紙盒中，速度要慢。待石蠟凝固(約30min)后放入冰箱保鮮層內(nèi)以備后用。包埋時應根據(jù)組織材料、切片厚度、氣候條件等因素，選擇不同熔點的石蠟，新的石蠟一般要熬頓幾次，以免石蠟固定后有氣泡，影響切片。用于包埋的石蠟的熔點在5060?之間。1.7.7 組織切片(1) 從冰箱里拿出蠟塊，進行修快(2) 將已固定和修好的石蠟塊臺木裝在切片機的夾物臺上。(3) 將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。(4) 搖動推動螺旋，使石蠟塊與刀口貼近，但不

4、可超過刀口。(5) 調(diào)整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15度左右。(6)調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到所需的切片厚度，先調(diào)約為25um待切平后改為5um(7) 一切調(diào)整好后方可以開始切片。此時右手搖動轉(zhuǎn)輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉(zhuǎn)速度不可太急，通常以40-60r/min。(8) 切成的蠟帶到10-20cm長時，右手用另一支毛筆輕輕地將蠟帶挑起，以免卷曲，并牽引成帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上。(9) 感覺效果較好的蠟片一小段，用單面刀片切取，再放入約43?的水浴鍋中展片，觀察切片是否良好。(10) 切片工作結(jié)束后，應將切片刀取下用氯仿擦去刀上

5、沾著的石蠟，把切片機擦拭干凈妥為保存。1.7.8貼片(1) 取清潔的載玻片一片，滴一滴粘片劑于玻片中央，然后用洗凈的手指加以涂抹，便成均勻薄層。(2) 然后用載玻片直接去濾已經(jīng)展開的蠟片，將蠟片貼在均勻的粘片劑薄層上。注意蠟片光亮平整的一面貼于玻片上，并使之處于稍偏玻片的一端，一端便于后面的染色步驟，另一端便于粘貼標簽。1.7.9 烘片把載玻片擺好片位置，放在平盤上置于60?溫箱烘干，經(jīng)過5小時干燥后即可取出存放于切片盒待染。1.7.10 脫蠟染色液多數(shù)為水溶液，因此，染色前必須將蠟脫去，使切片中的材料由有機相進入到水相。一般采用二甲苯脫蠟，逐級復水與脫水浸蠟過程正好相反，但是，由于蠟片較薄，

6、所需時間比脫水浸蠟要短的多。(1) 石蠟切片經(jīng)二甲苯?脫蠟10min;(2) 石蠟切片經(jīng)二甲苯?脫蠟10min;1.7.11滲水放入100%、95%、80%等各級酒精溶液中浸泡，再放入蒸餾水中，使水滲進切片組織。(1) 無水乙醇浸泡1min;(2) 無水乙醇浸泡1min;(3)95%乙醇浸泡2min;(4)95%乙醇浸泡2min;(5)80%乙醇浸泡2min;(6)自來水洗2min;1.7.12 染色切片放入蘇木精中染色約7min。染色時間應根據(jù)染色劑的成熟程度及室溫高低，適當縮短或延長。室溫高時促進染色，染色時間可短些，否則可適當延長時間，冬季室溫低時可放入恒溫箱中染色。1.7.13 水洗用

7、自來水流水沖洗約2min。沖洗過程中使切片顏色發(fā)藍，此操作要注意流水不能過大，以防切片脫落，并可以隨時用顯微鏡檢查見顏色變藍為止。1.7.14 分化就是將細胞質(zhì)著的色褪去，使細胞核著色更加鮮明，也稱分色。將切片放入1%鹽酸乙醇液(鹽酸1份+70%乙醇100份)中褪色，見切片變紅，顏色較淺即可，約數(shù)秒至數(shù)十秒鐘。這一步驟是H.E.染色成敗的關鍵，如分化不當會導致染色不勻，或深或淺，得到的切片染色效果差。如果染色適中，可取消此步驟。本次實驗操作在0.5%鹽酸乙醇中浸泡30s;1.7.15 漂洗切片再放入自來水流水中使其恢復藍色。低倍鏡檢查見細胞核呈藍色、結(jié)構(gòu)清楚;細胞質(zhì)或結(jié)締組織纖維成分無色為標準

8、。然后放入蒸餾水中漂洗一次2min。1.7.16 反藍在飽和碳酸鋰中浸泡2min;再用自來水洗2min;1.7.17 復染用0.5%尹紅乙醇液對比染色25min。伊紅主要染細胞質(zhì)，著色濃淡程度應與蘇木精染細胞核的濃淡程度相配合，如果細胞核染色較濃，細胞質(zhì)也應濃染，以獲得鮮明的對比。反之，如果細胞核染色較淺，細胞質(zhì)也應淡染?？稍谝良t乙醇液中滴加數(shù)滴冰醋酸助染，促使細胞質(zhì)容易著色，并且經(jīng)乙醇脫水時不易褪色。本次操作伊紅染色6min;1.7.18 逐級脫水(1)80%乙醇脫水30s;(2)90%乙醇脫水30s;(3)95%乙醇脫水1min;(4)95%乙醇脫水1min;(5) 無水乙醇脫水2min;

9、(6) 無水乙醇脫水2min;1.7.19 透明將經(jīng)過脫水后的切片放入純二甲苯？、？中各35min。二甲苯應盡量保持無水,應經(jīng)常更換，或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸內(nèi)吸收水分。切片如在二甲苯中出現(xiàn)白霧現(xiàn)象，說明脫水未盡，應退回乙醇中重新脫水，否則切片難以鏡檢。本次操作為:(1) 二甲苯?5min;(2) 二甲苯?10min;1.7.20 封藏:中性樹膠封存切片經(jīng)染色、脫水、透明后，即可用封藏劑將其封藏起來，目的是永久保存切片，便于鏡檢。常用的封藏劑一類為干性封藏劑如中性樹膠、加拿大樹膠等，另一類為濕性封藏劑如甘油明膠等。如果切片是經(jīng)二甲苯透明，則用樹膠作為封藏劑，樹膠可以用二甲苯稀釋至合適的稠

10、度。如果切片是直接從水中或水溶液中取出，則常用甘油明膠作為封藏劑，可用于短期保存標本。封藏的方法:封片前應根據(jù)材料的大小，選用不同規(guī)格的蓋玻片。材料透明后，按照下列方法進行封藏。在桌上放一張潔凈的吸水紙，將含材料的載玻片從二甲苯中取出放在紙上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴樹膠（千萬不能待二甲苯干燥后再進行），用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側(cè)，稍為傾斜使其左側(cè)與封藏劑接角，然后再緩慢地將蓋玻片放下，這樣就可以減少或避免產(chǎn)生氣泡。如膠液不足，可以用玻棒再滴一滴樹膠從蓋玻片邊緣補足。如膠液過多，可在干燥以后用刀刮去，并用紗布蘸二甲苯拭去殘留的樹膠。1.7.21鏡檢在光鏡下觀察染色結(jié)果，細胞核被蘇木素染成藍色，細胞質(zhì)被伊紅染色呈粉紅色。組織切片過程中的注意事項1) 固定組織所用的固定液要充足,至少相當于標本總體積的5倍以上，標本容器及其口徑有適當大小，使標本能原形進行固定，避免使標本遭受擠壓。2) 組織塊透明在制片中是很重要的環(huán)節(jié)，如果組織不能透明，其原因可能有脫水未盡、組織太厚、透明時間不夠以及與某些組織本身性質(zhì)有關等。所以從多方面考慮，盡可能使組織達到透明目的，通常根據(jù)透明時間與眼觀相結(jié)合判斷透明程度。3) 凡是陳舊、腐敗或干枯的組織不易制成好切片，所以制片過程中要保護好組織。4) 固定失時或固定不當?shù)慕M織，染色時常出現(xiàn)核染色質(zhì)著色淺、輪廓不清，出現(xiàn)