微生物實驗操作基礎(chǔ)——滅菌及無菌操作

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上實驗十二 微生物實驗操作基礎(chǔ)滅菌及無菌操作一、目的要求 學(xué)習(xí)滅菌的方式方法，區(qū)別幾種滅菌方式的相同點和不同點。掌握實驗室無菌操作的操作方法和注意事項，體會無菌操作技術(shù)在微生物研究中的重要性。2、 知識介紹滅菌技術(shù)sterilization 為什么要滅菌？（雜菌污染的后果） 1.營養(yǎng)基質(zhì)或產(chǎn)物被消耗損失； 2.抑制生產(chǎn)菌的生長； 3.抑制產(chǎn)物的生物合成； 4.雜菌繁殖導(dǎo)致培養(yǎng)液性質(zhì)（如pH）改變，造成生物反應(yīng)異常。 滅菌原理與方法 滅菌(sterilization）是指利用物理或化學(xué)方法，殺滅或去除物料或設(shè)備中所有微生物的技術(shù)或工藝過程。滅菌方法有化學(xué)物質(zhì)滅菌、輻射滅菌

2、、過濾介質(zhì)除菌和熱滅菌等。 （一）、化學(xué)物質(zhì)滅菌 通過改變微生物細胞膜的滲透性，或者損傷細胞膜，影響微生物細胞的正常代謝。 不適合于培養(yǎng)基的滅菌，只適合于局部空間或某些器械的消毒。 1.無機酸、堿及鹽類 酸堿的殺菌能力主要由其電離度而定，電離出得氫離子或氫氧根離子濃度越高，殺菌力越強。 鹽溶液的殺菌力與其濃度成正比。（腌咸菜可以保藏很長時間而不染菌） 2.重金屬鹽 殺菌原理是重金屬鹽使細胞中蛋白質(zhì)失活。比如升汞。服食牛奶、雞蛋等高蛋白含量食物可解毒。 3.氧化劑 高錳酸鉀 4.有機化合物 乙醇：脫水、使蛋白質(zhì)變性和沉淀，7075%最有效。 (二)、輻射滅菌 1.紫外線：誘導(dǎo)胸腺嘧啶二聚體的形成

3、，從而抑制了DNA的復(fù)制；空氣在紫外線照射下產(chǎn)生臭氧，臭氧也具有一定的殺菌作用。 2.X射線、射線：能量極高，被菌體吸收后，菌體內(nèi)的水和有機物產(chǎn)生強烈的離子化反應(yīng)，形成OH-、過氧化氫和有機過氧化物，這些過氧化物阻礙微生物的代謝活動而導(dǎo)致菌體迅速死亡。 （三）、過濾介質(zhì)除菌工業(yè)上利用過濾的方法制備大量的無菌空氣，供好氧微生物的深層培養(yǎng)使用。 （四）、干熱滅菌 1.火焰灼燒法 2.干熱空氣滅菌法：140160維持23h。 （五）、濕熱滅菌 濕熱滅菌條件為121維持2030min。 巴氏殺菌（Pasteurization）低溫消毒法，主要應(yīng)用于生產(chǎn)酸奶乳制品。目前國際上通用的巴氏高溫消毒法主要有兩

4、種： 1.一種是將牛奶加熱到6265，保持30分鐘。采用這一方法，可殺死牛奶中各種生長型致病菌，滅菌效率可達97.3%99.9%，經(jīng)消毒后殘留的只是部分嗜熱菌及耐熱性菌以及芽孢等，但這些細菌多數(shù)是乳酸菌，乳酸菌不但對人無害反而有益健康。 第二種方法將牛奶加熱到7590，保溫1516秒，其殺菌時間更短，工作效率更高。但殺菌的基本原則是，能將病原菌殺死即可，溫度太高反而會有較多的營養(yǎng)損失。無菌操作 (一）基本原理 高溫對微生物具有致死效應(yīng)，在微生物接種時，一般在酒精燈旁進行，用火焰直接灼燒接種環(huán)，以達到滅菌的目的。 自然界中各種微生物混雜生活在一起，即使取很少量的樣品也是許多微生物共存的群體，要研

5、究某種微生物的特性，首先須使該微生物處于純培養(yǎng)狀態(tài)。從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。平板分離法常用的有：稀釋涂布平板法、稀釋混合平板法與平板劃線法。不同的微生物在固體、半固體和液體培養(yǎng)基中能表現(xiàn)出各自特有的培養(yǎng)特征，這些特征可以作為不同種類微生物的鑒別特征之一。 (二）、講授重點 1.倒平板：滅菌的培養(yǎng)基冷卻到55左右，搖勻。解開麻繩，去掉三角瓶口上蓋，右手持裝培養(yǎng)基的三角瓶在酒燈旁，瓶口對著火焰。左手持9cm無菌培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰旁打開一條縫，迅速倒入培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，平置于桌面上，使培養(yǎng)基均勻分布于皿底，待冷凝后即為平

6、板。 2.平板稀釋法和涂布平板法 三、實驗操作步驟滅菌：高溫蒸汽滅菌鍋20 MIN，120 標(biāo)記：用記號筆對待接試管斜面培養(yǎng)基進行標(biāo)記，寫上待接菌種名稱、接種日期、組別。稀釋菌：酒精燈附近進行混合菌液和熔化冷卻至培養(yǎng)50-60 （手觸可接受溫度）以下的培養(yǎng)基倒平板 培養(yǎng)：平板倒置培養(yǎng)基面在上放37 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-36小時。 四、實驗過程中的注意事項 1.無菌接種技術(shù)無菌操作需在火焰旁進行，手不可觸摸試管口端，以防燙傷；接種時接種環(huán)不要碰觸試管口邊，防止污染；塞蓋不可放在桌面上，應(yīng)該用右手手緣或右手指間夾住，或玻璃蓋放后火焰滅菌蓋上。操作臺及不可高溫蒸汽滅菌物品使用前和使用后用75%酒精消毒。 2平板分離技術(shù) 倒平板時，培養(yǎng)皿邊緣不要沾染培養(yǎng)基，搖勻培養(yǎng)基時要輕，以防培養(yǎng)液濺到皿蓋或溢出培養(yǎng)皿；平板培