抗(抑)菌試驗

1、抗(抑)菌試驗2.1.8.1 目的 測定抗(抑)菌產(chǎn)品對細菌和真菌的抗(抑)菌作用。 常使用的方法有抑菌環(huán)試驗、 最小抑制濃度測定試驗、 滯 留 抑 菌 效 果 測 定 試 驗 、洗衣粉抗菌效果測定試驗、振蕩燒瓶試驗、浸漬試驗與奎因試驗，可視 情況選用。2.1.8.2 抑菌環(huán)試驗2.1.8.2.1 原理利用抑菌劑不斷溶解經(jīng)瓊脂擴散形成不同濃度梯度， 以顯示其抑菌作用。 試驗通 過抑菌環(huán)大小以判斷其是否具有抑菌能力。 本試驗適用于抑菌劑與溶出性抗 (抑) 菌產(chǎn)品的鑒定。2.1.8.2.2 試驗器材(1) 金黃色葡萄球菌 (ATCC 6538) 、大腸桿菌(8099) 、白色念珠菌 (ATCC 1

2、0231) 菌懸液(見 2.1.1.2) 及根據(jù)抑菌劑特定用途所用的其他菌懸液。(2) 抑菌劑載體 (5 mm 直徑園形新華一號定性濾紙片，經(jīng)壓力蒸汽滅菌 處理后，置120C烤干2h,保存?zhèn)溆?。(3) 活菌培養(yǎng)計數(shù)所需器材 ( 見 2.1.1.3) 。 微量移液器(5卩l(xiāng)50卩l(xiāng)，可調(diào)式)。(5) 游標卡尺。(6) 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基與沙堡瓊脂培養(yǎng)基2.1.8.2.3 操作程序(1) 抑菌片的制備 : 對液體抑菌劑，取無菌并干燥的濾紙片。每片滴加實際使用濃度抑菌劑溶液20卩l(xiāng) ,然后將濾紙片平放于清潔的無菌平皿內(nèi)， 開蓋置 溫箱(37 C)中烤干，或置室溫下自然干燥后備用

3、。溶出性抗(抑)菌產(chǎn)品，可直接制成直徑為5mm厚不超過4mm圓片(塊)， 每 4 片 ( 塊 ) 一組。(2) 陰性對照樣片的制備 : 取無菌干燥濾紙片，每片滴加無菌蒸餾水 20卩l(xiāng)，干燥后備用。溶出性抗(抑)菌產(chǎn)品的陰性對照樣本，應取同種材質(zhì)不含抑菌成份的 樣品，制成與試驗組大小相同的樣片 (塊)。(3) 試驗菌的接種：用無菌棉拭子蘸取濃度為 5X 105cfu/ml5X 106cfu/ml試驗菌懸液，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板表面均勻涂抹 3次。每涂抹1 次，平板應轉(zhuǎn)動 60°，最后將棉拭子繞平板邊緣涂抹一周。蓋好平皿，置室溫 干燥 5min 。(4) 抑菌劑樣片貼放 ： 每次試驗貼放

4、 1 個染菌平板，每個平板貼放 4 片試 驗樣片， 1 片陰性對照樣片，共 5 片。用無菌鑷子取樣片貼放于平板表面。各 樣片中心之間相距25mm以上，與平板的周緣相距15mm以上。貼放好后，用無 菌鑷子輕壓樣片，使其緊貼于平板表面。蓋好平皿，置37C溫箱，培養(yǎng)16h18h 觀察結(jié)果。用游標卡尺測量抑菌環(huán)的直徑 ( 包括貼片 ) 并記錄。試驗重復 3次。測量抑菌環(huán)時， 應選均勻而完全無菌生長的抑菌環(huán)進行。 測量其直徑應 以抑菌環(huán)外沿為界。2.1.8.2.4 評價規(guī)定(1) 抑菌作用的判斷 ： 抑菌環(huán)直徑大于 7mm 者，判為有抑菌作用。抑菌環(huán)直徑小于或等于 7mm 者，判為無抑菌作用。(2) 3

5、 次重復試驗均有抑菌作用結(jié)果者，判為合格。(3) 陰性對照組應無抑菌環(huán)產(chǎn)生。否則試驗無效。2.1.8.2.5 注意事項(1) 每次試驗均應設(shè)置陰性對照， 不可省略。 在報告中亦必須將對照組的 結(jié)果列出。(2) 接種用細菌懸液的濃度應符合要求。 濃度過低， 接種菌量少， 抑菌環(huán) 常因之增大 ; 濃度過高，接種量過多，抑菌環(huán)則可減小。(3) 應保持瓊脂濃度的準確性，否則可影響抑菌環(huán)的大小。(4) 培養(yǎng)時間不得超過 18h 。培養(yǎng)過久， 部分細菌可恢復生長， 抑菌環(huán)變 小。(5) 抑菌環(huán)直徑可受抑菌劑的量、抑菌性能和干濕度影響。故抑菌劑濾紙片應在 試驗當天制備。2.1.8.3 最小抑菌濃度測定試驗(

6、瓊脂稀釋法)2.1.8.3.1 原理本試驗采用瓊脂稀釋法將不同濃度的抑菌劑混合溶解在瓊脂培養(yǎng)基中， 然后點種細菌，通過細菌的生長與否，確定抗(抑)菌物質(zhì)抑制受試菌生長的最 低濃度，即最小抑菌濃度(Mi ni mal In hibitory Co nee ntratio n, MIC)。本方法適用于不溶性抗(抑)菌產(chǎn)品。2.1.8.3.2 試驗器材(1) 菌株金黃色葡萄球菌 ATCC 6538 ，大腸桿菌 8099 或 ATCC 11229。 可根據(jù)抑菌劑的用途，選擇特定的菌株。(2) 水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(MH ,稱取38gMH瓊脂培養(yǎng)基，溶于1000ml水中， 加熱至沸騰溶解，然后121C高

7、壓滅菌15min,置45C50C水浴備用，此培養(yǎng) 基將用于對照試驗。( 3) 0.03mol/L 磷酸鹽緩沖液 pH7.2。(4) 加樣器(1卩l(xiāng)10卩l(xiāng) )。(5) 45C50 C水浴恒溫箱。( 6)吸管、試管、平皿。(7) 37 C培養(yǎng)箱。2.1.8.3.3 操作步驟(1) 抗(抑)菌溶液的配制：以無菌操作取 5ml或5g (固體研磨后)樣品，放 入 45ml 滅菌磷酸緩沖液中， 充分震蕩溶解， 配成 10%的均勻分散的溶液或懸液。(2) 含抗菌劑培養(yǎng)基配制：將已配成 10%勺抗(抑)菌溶液或懸液用 PBS做對 倍系列稀釋成不同濃度的受試液，置 45C50C水浴恒溫備用。(3) 雙倍濃度培

8、養(yǎng)基配制：稱取76gMH瓊脂培養(yǎng)基，溶于1000ml水中。加熱至 沸騰溶解。然后121C壓力蒸汽滅菌15min，置45C50C水浴備用。此培養(yǎng)基 將用于稀釋抗(抑)菌溶液或懸液。(4) 含抗(抑)菌液培養(yǎng)基的配制：分別取10ml系列稀釋的抗菌液加入平皿內(nèi)。 將在45C50C水浴中的雙倍MH瓊脂培養(yǎng)基10ml，加入平皿內(nèi)，邊加邊搖晃 平板，使抗(抑)菌液和培養(yǎng)基充分混勻，待凝固后備用。(5) 用加樣器取1卩l(xiāng)2卩l(xiāng) (含菌量約為107cfu/ml )菌懸液點種于含抗(抑) 菌液培養(yǎng)基的平皿，接種后所形成的菌液圈直徑約 5mm- 8mm(每個點菌量約為 104cfu )。(6) 以同樣方法接種不含

9、抗(抑)菌成分的MH瓊脂平板，作為陽性對照。(7) 將接種后的平板放置35C培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)18h24h，觀察結(jié)果。2.1.8.3.4 評判規(guī)定菌落生長被完全抑制的最低抗(抑)菌液濃度為該樣品對受試菌的MIC。單一菌落生長可忽略不計。2.1.8.3.5 注意事項( 1 )接種時，應由低抗(抑)菌劑濃度向高濃度平板依次接種，最后接種對照 平板。(2) 為了保證平板受熱均勻，培養(yǎng)時平板堆放不得超過4個。2.1.8.4 最小抑菌濃度測定試驗(營養(yǎng)肉湯稀釋法)2.1.8.4.1 原理本試驗將不同濃度的抑菌劑混合溶解于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中， 然后接種細菌， 通過 細菌的生長與否，確定抗(抑)菌劑抑制受試菌

10、生長的最低濃度，即最小抑菌濃 度(Minimal Inhibitory Concentration ,MIC)。本方法式用于可溶性抑菌產(chǎn)品。2.1.8.4.2 試驗器材(1)試驗菌株：金黃色葡萄球菌 ATCC 6538 ，大腸桿菌 8099 或 ATCC 11229。 可根據(jù)抑菌劑的用途，選擇特定的菌株。( 2)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，見附錄 A。( 3)稀釋液，見附錄 A。( 4)吸管、試管(5) 37 E培養(yǎng)箱。2.1.8.4.3 操作步驟( 1)按 2.1.1.2 所示方法制備的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌懸液( 2)含抗菌劑培養(yǎng)基配制：將抗(抑)菌溶液用蒸餾水做對倍系列稀釋成不同 濃度的受試液，取各稀釋度受試液 2.5ml 加入到含 2.5ml 雙倍濃度營養(yǎng)肉湯的試 管中。(3) 取 0.1ml 含菌量約為 108cfu/ml 菌懸液接種于含抗(抑)菌劑的營養(yǎng)肉湯 的試管中，作為試驗組樣本。(4) 以同樣方法接種不含抗(抑)菌劑的營養(yǎng)肉湯的試管中，作為陽性對照組 樣本。(5) 取 2 支含營養(yǎng)肉湯的試管中，作為陰性對照組樣本。(6) 將試驗組樣本、陽性對照組樣本及陰性對照組樣本放置37C培養(yǎng)箱中，培 養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。( 7)試驗中應將試驗用菌懸液進行活菌培養(yǎng)計數(shù)，其作用濃度應為565X 10 cfu/ml 5X 10