運(yùn)城職業(yè)技術(shù)學(xué)院

1、運(yùn)城職業(yè)技術(shù)學(xué)院課程教學(xué)設(shè)計(jì)實(shí)施方案項(xiàng) 目3.細(xì)菌的檢驗(yàn)任 務(wù)2.飲料中菌落總數(shù)檢驗(yàn)授課教師成少寧、喬冬授課地點(diǎn)綜B106 授課方法理實(shí)一體化課 時(shí)2.0教學(xué)內(nèi)容國標(biāo)的查找方法、所需滅菌物品數(shù)量的確定方法、方案的制定方法實(shí)施步驟1.“六個(gè)一”企業(yè)案例（微生物快速檢測系統(tǒng)）介紹 5min 微生物快速檢測系統(tǒng)，可以檢測固態(tài)、液態(tài)、表面、膏狀、漿狀樣本；樣品檢測時(shí)無需任何的前處理過程，直接丟入檢測瓶即可，檢測后的檢測瓶自帶殺菌功能；檢測樣品只需0.1-1mL(0.1-1g);靈敏度高達(dá)可檢測1目標(biāo)微生物，特異性高達(dá)99.999%;操作步驟簡單，只需三個(gè)操作步驟，無需專業(yè)技術(shù)人員；儀器便攜式，可直接連

2、電腦出定量分析檢測報(bào)告。檢測范圍：活菌總數(shù)、大腸桿菌、大腸菌群、腸道桿菌科、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌、李斯特菌、腸球菌、乳酸桿菌、亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、霉菌（曲霉屬真菌、曲霉菌）、酵母菌，共13種菌。應(yīng)用范圍：食品、廚房、工具、表面、水質(zhì)、疾病控制、進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫、藥品及化妝品。可以在咖啡館、餐廳、農(nóng)產(chǎn)品及相關(guān)的加工公司、分析實(shí)驗(yàn)室、藥廠、藥房、化妝品廠、環(huán)境檢測機(jī)構(gòu)、水配送公司、制水廠等。2.下發(fā)任務(wù)書，布置任務(wù)： 5min 學(xué)生分組，每5-6人為一組進(jìn)行飲料中菌落總數(shù)檢驗(yàn)國標(biāo)的查找、討論實(shí)驗(yàn)方案、制定實(shí)驗(yàn)實(shí)施方案。3.教師介紹國標(biāo)的查找方法，學(xué)生查找國標(biāo)（課前完

3、成） 5min食品伙伴網(wǎng)標(biāo)準(zhǔn)下載輸入關(guān)鍵詞“食品 菌落總數(shù)”點(diǎn)擊“搜索”“現(xiàn)行有效”與“已作廢”選擇 “現(xiàn)行有效”標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行下載4.學(xué)生分組討論實(shí)驗(yàn)方案，每組寫出一份實(shí)驗(yàn)實(shí)施方案 50min要求：（1）確定需滅菌的玻璃器皿的種類與數(shù)量，需要從實(shí)驗(yàn)步驟中進(jìn)行提煉（共需內(nèi)裝9毫升生理鹽水的試管4支、1毫升吸管4支、25毫升吸管1支、內(nèi)裝225毫升生理鹽水的三角瓶1個(gè)，培養(yǎng)皿8套）；（2）根據(jù)培養(yǎng)皿的套數(shù)計(jì)算所需的培養(yǎng)基的量，并相應(yīng)計(jì)算培養(yǎng)基中各個(gè)成分的含量；（3）計(jì)算需配制生理鹽水的量，并計(jì)算氯化鈉的含量；（4）根據(jù)實(shí)際操作過程寫出詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)實(shí)施方案。5.學(xué)生分組上交實(shí)驗(yàn)實(shí)施方案，教師對每組的方案進(jìn)

4、行評價(jià)和補(bǔ)充 25min（1）共需內(nèi)裝9毫升生理鹽水的試管4支、1毫升吸管4支、25毫升吸管1支、內(nèi)裝225毫升生理鹽水的三角瓶1個(gè)，培養(yǎng)皿8套；（2）培養(yǎng)基250ml，其中胰蛋白胨1.25 g；酵母浸膏0.625 g；葡萄糖0.25 g；瓊脂3.75g；蒸餾水250mL；（3）生理鹽水500ml，氯化鈉4.25克；（4）實(shí)際操作過程：培養(yǎng)基制備生理鹽水制備玻璃器皿包扎滅菌稀釋樣品倒平板培養(yǎng)注：本次任務(wù)未結(jié)束，在任務(wù)結(jié)束后布置作業(yè)。設(shè)備、工具及材料教案，教學(xué)設(shè)計(jì)方案，課程標(biāo)準(zhǔn)，教學(xué)案例考 核備 注運(yùn)城職業(yè)技術(shù)學(xué)院課程教學(xué)設(shè)計(jì)實(shí)施方案項(xiàng) 目3.細(xì)菌的檢驗(yàn)任 務(wù)2.飲料中菌落總數(shù)檢驗(yàn)授課教師成少寧

5、、喬冬授課地點(diǎn)綜B106 授課方法理實(shí)一體化課 時(shí)2.0教學(xué)內(nèi)容培養(yǎng)基的制備方法和滅菌方法實(shí)施步驟1.“六個(gè)一”企業(yè)案例（微生物快速檢測方法）介紹 5min 此類方法是在比相應(yīng)的傳統(tǒng)方法在短的時(shí)間內(nèi)可以得出結(jié)果。此類方法的典型例子是：膜過濾一微菌落一熒光法。具體方法是將一定量的樣品(或樣品稀釋液)經(jīng)膜過濾(過濾膜045m)，再將過濾膜放在培養(yǎng)基上或放在浸過液體培養(yǎng)基的厚紙板上，在適宜溫度條件下培養(yǎng)一段時(shí)間，然后將膜放在浸過0.1ANS(8一苯胺基萘磺酸鎂)溶液的紙片上作用10分鐘，將膜揭下，在80條件下干燥 510分鐘，最后在100倍的熒光顯微鏡(入=340 380nm)下計(jì)數(shù)藍(lán)綠色菌落的數(shù)目

6、。 對于不同樣品，膜過濾一微菌落一熒光法使用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)時(shí)間不同。檢驗(yàn)?zāi)橹薪湍妇鷷r(shí)，可采用含瓊脂的固體培養(yǎng)基，也可放在2ml雙料液體培養(yǎng)基浸潤的紙片上培養(yǎng)1524小時(shí)。檢驗(yàn)食品中需氧性細(xì)菌數(shù)時(shí)，可用瓊脂計(jì)數(shù)平板，也可用營養(yǎng)肉湯或酪蛋白胨一豆粉蛋白胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)8小時(shí)。食品中酵母和霉菌的選擇性檢測可使用添加100ppm氯霉素的麥芽汁提取物瓊脂培養(yǎng)基，或添加100ppm氯霉素的雙料麥芽汁提取物液體培養(yǎng)基。糖果中耐滲透酵母的檢測可采用50%葡萄糖液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)(菌數(shù)>10個(gè)克)72小時(shí)(菌數(shù)10個(gè)克)。2. 下發(fā)任務(wù)書，布置任務(wù)：學(xué)生每5-6人為一組按照制定的實(shí)驗(yàn)實(shí)施方

7、案進(jìn)行培養(yǎng)基的制備和需滅菌相關(guān)物品的準(zhǔn)備和包扎。3.學(xué)生討論任務(wù)流程，進(jìn)行任務(wù)分工 20min任務(wù)流程：秤取藥品-溶化-調(diào)節(jié)pH值-分裝-加塞-包扎；配制生理鹽水分裝包扎；吸管包扎4.學(xué)生分組按照實(shí)施方案進(jìn)行培養(yǎng)基的熬煮、分裝、包扎以及相應(yīng)的玻璃器皿的包扎 60min（1）、秤取藥品：配方：胰蛋白胨5.0 g；酵母浸膏2.5 g；葡萄糖1.0 g；瓊 脂15.0 g；蒸餾水1000 mL、pH 7.0±0.2，按照培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地秤取酵母浸膏、胰蛋白胨、葡萄糖放入燒杯中。注意事項(xiàng)：酵母浸膏比較粘稠，秤取時(shí)可先在稱上減去燒杯和藥匙的重量，再用藥匙去蘸取酵母浸膏，一起放到稱上秤取

8、。胰蛋白胨秤取時(shí)要迅速，因蛋白胨很容易吸潮。（2）、溶化：將燒杯中加入水，加熱溶化后加入瓊脂，繼續(xù)加熱，瓊脂溶化后，補(bǔ)足損失水分。注意事項(xiàng)：瓊脂溶化過程中，應(yīng)控制火力，小火加熱，以免培養(yǎng)基溢出；不斷攪拌，以防培養(yǎng)基燒焦；配制培養(yǎng)基時(shí)，不要用銅或鐵鍋加熱，以免離子進(jìn)入培養(yǎng)基中，影響細(xì)菌生長。（3）、調(diào)節(jié)pH值先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH值，如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/L氫氧化鈉，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測其pH值，直到pH值達(dá)到7.0±0.2，若偏堿，則用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)。注意事項(xiàng)：pH值不要調(diào)過頭，以免回調(diào)影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。（4）、分裝分裝試管

9、的量不要超過管高的1/5，滅菌后制成斜面，分裝三角瓶的量不要超過三角瓶的1/2。注意事項(xiàng)：分裝時(shí)不要讓培養(yǎng)基沾在管口上，以免沾染棉塞而引起污染。（5）、加塞：在分裝好的試管和三角瓶上加上棉塞，阻止外界微生物的進(jìn)入而污染，并保證有良好的通氣性能。（6）、包扎在試管的棉塞外，三角瓶的棉塞外加上兩層報(bào)紙，防止滅菌時(shí)冷凝水潤濕棉塞，其外用棉繩扎好。5.學(xué)生在課下進(jìn)行培養(yǎng)基的滅菌。5. 教師在學(xué)生做的過程中進(jìn)行指導(dǎo)和評價(jià)，隨時(shí)指出和解決學(xué)生在操作過程中出現(xiàn)的問題注：本次任務(wù)未結(jié)束，在任務(wù)結(jié)束后布置作業(yè)。設(shè)備、工具及材料教案，教學(xué)設(shè)計(jì)方案，課程標(biāo)準(zhǔn)，教學(xué)案例，電爐、恒溫培養(yǎng)箱、試管、培養(yǎng)皿、移液管（移液槍

10、）、酒精燈、高壓蒸汽滅菌鍋、試劑考 核備 注運(yùn)城職業(yè)技術(shù)學(xué)院課程教學(xué)設(shè)計(jì)實(shí)施方案項(xiàng) 目3.細(xì)菌的檢驗(yàn)任 務(wù)2.飲料中菌落總數(shù)檢驗(yàn)授課教師成少寧、喬冬授課地點(diǎn)綜B106 授課方法理實(shí)一體化課 時(shí)2.0教學(xué)內(nèi)容菌落總數(shù)檢驗(yàn)的采樣方法、稀釋方法、接種方法、培養(yǎng)方法實(shí)施步驟1.“六個(gè)一”企業(yè)案例(微生物快速測定方法)介紹 5min Limulus測試法用于革蘭氏陰性菌脂多糖的測定。這種方法可以在30分鐘1小時(shí)內(nèi)定量測定食品中存在的死去的和活著的革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁組成部分。因?yàn)閮?nèi)毒素與革蘭氏陰性菌含量呈線性關(guān)系，所以可以根據(jù)革蘭氏陰性菌的污染程度確定內(nèi)毒素的含量。 這個(gè)方法可用于食品中內(nèi)毒素的快速檢測

11、，特別是新鮮易腐敗的如牛奶、肉、魚和蛋等食品，因?yàn)檫@些食品上的細(xì)菌多為革蘭氏陰性菌。此方法還用于鑒定加工食品原料中革蘭氏陰性菌（包括死菌在內(nèi)）的含量，蛋白制品的衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)質(zhì)量檢測、肉類食品的細(xì)菌學(xué)質(zhì)量檢測，以及醫(yī)學(xué)范圍內(nèi)的注射液質(zhì)量檢測等多個(gè)方面。2. 下發(fā)任務(wù)書，布置任務(wù)： 5min學(xué)生分組，每5-6人為一組進(jìn)行飲料（食品坊提供）中菌落總數(shù)檢驗(yàn)的飲料的選擇、取樣、稀釋和接種。要求：嚴(yán)格遵循無菌操作，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行操作。3.學(xué)生分組討論任務(wù)流程,進(jìn)行任務(wù)分工，教師檢查學(xué)生討論和分工情況 10min4.每三個(gè)組找一名學(xué)生進(jìn)行操作演示，其他學(xué)生指出操作過程的問題 15min5.教師補(bǔ)充,強(qiáng)調(diào)

12、操作過程中應(yīng)注意的問題 5min加熱培養(yǎng)基時(shí)電爐火一定要小,以防培養(yǎng)基溢出;稀釋樣品的過程中一定要注意同時(shí)往培養(yǎng)皿中加樣;一定要先做好標(biāo)記。6.學(xué)生分組無菌操作進(jìn)行飲料中菌落總數(shù)檢驗(yàn)的取樣、接種和培養(yǎng) 45min熔化培養(yǎng)基標(biāo)記稀釋樣品加樣倒平板混勻恒溫培養(yǎng)液體樣品：以無菌吸管吸取25 mL樣品置盛有225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。用1 mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混

13、合均勻，制成1:100的樣品勻液。按以上操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1 mL無菌吸管或吸頭。根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2個(gè)3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞增稀釋時(shí)，吸取1 mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸取1 mL空白稀釋液加入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)作空白對照。及時(shí)將15 mL20 mL冷卻至46 的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46 ±1 恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36 ±1 培養(yǎng)48 h±2 h。水產(chǎn)品30 ±1

14、培養(yǎng)72 h±3 h。如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長的菌落時(shí)，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4 mL），凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按上述條件進(jìn)行培養(yǎng)。7.教師在學(xué)生做的過程中進(jìn)行指導(dǎo)和評價(jià)8.布置作業(yè)：查找飲料中菌落總數(shù)的合格范圍（每組一份，批改率100%）9.學(xué)生實(shí)驗(yàn)完成后清潔整理實(shí)驗(yàn)室 5min設(shè)備、工具及材料教案，教學(xué)設(shè)計(jì)方案，課程標(biāo)準(zhǔn)，教學(xué)案例，電爐、恒溫培養(yǎng)箱、試管、培養(yǎng)皿、移液管（移液槍）、酒精燈、高壓蒸汽滅菌鍋、試劑、飲料（食品坊提供）考 核備 注運(yùn)城職業(yè)技術(shù)學(xué)院課程教學(xué)設(shè)計(jì)實(shí)施方案項(xiàng) 目3.細(xì)菌的檢驗(yàn)任 務(wù)2.飲料中菌落總數(shù)檢驗(yàn)授課教師成少寧、喬冬授課

15、地點(diǎn)綜B106 授課方法理實(shí)一體化課 時(shí)2.0教學(xué)內(nèi)容飲料中菌落總數(shù)檢驗(yàn)的計(jì)數(shù)方法和報(bào)告方法實(shí)施步驟1.“六個(gè)一”企業(yè)案例(微生物快速測定方法)介紹 5min食品中微生物快速檢測的方法一般可以在1-3小時(shí)內(nèi)得出結(jié)果，其中較為典型的方法有：Limulus測試法，ATP測定法，直接表面熒光過濾技術(shù)以及氧氣消耗測定法等。 ATP測定法是利用生物發(fā)光法，應(yīng)用熒光素?zé)晒馑孛钢苿┻M(jìn)行的，在活細(xì)胞中ATP含量近乎是恒定的，利用特殊的酶試劑水解掉細(xì)菌膜，使ATP釋放，ATP與熒光素?zé)晒馑孛钢苿┓磻?yīng)變成AMP和光，產(chǎn)生的光強(qiáng)度與ATP成正比，通過測定光強(qiáng)度可確定細(xì)菌濃度。這種方法可用于鮮肉、鮮魚、牛奶、啤酒、礦

16、泉水以及無菌藥品的檢測等多種領(lǐng)域。 ATP+熒光素+熒光素酶（Mg2+）熒光素?zé)晒馑孛窤mP+焦磷酸 熒光素?zé)晒馑孛窤MP（O）氧化熒光素+熒光素酶+AMP+CO2+光2.下發(fā)任務(wù)書，布置任務(wù)： 5min學(xué)生分組，每5-6人為一組進(jìn)行飲料中菌落總數(shù)檢驗(yàn)平板的菌落計(jì)數(shù)和報(bào)告。要求：計(jì)數(shù)正確，報(bào)告方法正確3.平板計(jì)數(shù) 15min 學(xué)生組內(nèi)討論，對本組的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，選出代表進(jìn)行匯報(bào)，教師匯總，與學(xué)生共同評價(jià)。菌落計(jì)數(shù)方法：可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony-forming units，CFU）表示。選取菌落數(shù)在30 CFU3

17、00 CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30 CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300 CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。4.菌落總數(shù)的計(jì)算方法 35min學(xué)生組內(nèi)討論，對本組平板的菌落總數(shù)進(jìn)行計(jì)算，選出代表進(jìn)行匯報(bào)，教師匯總，與學(xué)生共同評價(jià)。 菌落總數(shù)計(jì)算方法：若只有一個(gè)稀釋度平板

18、上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按公式計(jì)算。若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300 CFU，則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30 CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30 CFU300 CFU之間，其中一部分小于30 CFU或大于300 CFU時(shí)，則以最接近30 CFU或300 CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。5.菌落總數(shù)的報(bào)告方法 10min 學(xué)生組內(nèi)討論，對本組平板的菌落總數(shù)進(jìn)行報(bào)告，選出代表進(jìn)行匯報(bào)，教師匯總，與學(xué)生共同評價(jià)。(1) 菌落數(shù)小于100 CFU時(shí)，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報(bào)告。(2) 菌落數(shù)大于或等于100 CFU時(shí)，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。(3) 若所有平板上為蔓延