專題五課題二多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA片段導(dǎo)學(xué)案

1、學(xué)習(xí)必備歡迎下載課題2:多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增 DNA片段導(dǎo)學(xué)案教學(xué)目標(biāo)1、了解PCR技術(shù)的基本操作2、理解PCR的原理3、討論P(yáng)CR的應(yīng)用一、課題背景1.多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的概念：2、 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的應(yīng)用：的診 斷、和DNA 等各方面。 二、基礎(chǔ)知識1、復(fù)習(xí)回顧DNA分子的組成成分和結(jié)構(gòu)(1) DNA 分子的基本組成單位是 共有 種，每個基本單位是由分子的 、分子的 、和分子的 構(gòu)成。(2) .DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)：反向平行基本骨架兩條鏈通過氫鍵連接(理解熱穩(wěn)定)2 PCR原理：回憶DNA的復(fù)制過程，填寫下列表格參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶DNA母鏈合成子鏈的原料DNA聚合酶引物閱讀課本P58

2、63,完成下列空格(1) DNA的兩條鏈?zhǔn)?的，通常將 DNA 的羥基末端稱為,而磷酸基團(tuán)的末端稱為 。DNA聚合酶不能 開始合成DNA ,而 只能,因此，DNA 復(fù)制需要引物。DNA 的合成方向總(2)在 DNA 的復(fù)制過程中，復(fù)制的前提是 。在體 外可通過控制 來實現(xiàn)。在 的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體， 雙鏈分開，這個過程稱為 。 PCR利用了 DNA的 原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合。由于PCR過程的溫度高，導(dǎo)致 DNA聚合酶失活，后來的DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，大大增加了PCR的效率。(3) PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中提供： , , , 同時通過控制溫度使 D

3、NA 復(fù)制在體外反 復(fù)進(jìn)行。思考(1)在DNA的復(fù)制過程中，參與的組分有哪些？分別起什么作用?(3) DNA聚合酶的特點(diǎn)？ DNA的合成方向？(4) 如何在體外將 DNA雙螺旋打開？什么是 DNA的變性和復(fù)性？(7) PCR怎樣控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合？(8) 怎樣解決高溫導(dǎo)致 DNA聚合酶失活的問題？(9) 總結(jié)PCR反應(yīng)所需要的條件。2. PCR的反應(yīng)過程(1) PCR 一般要經(jīng)歷 循環(huán)，每次循環(huán)可以分為 、和 三步。從第二輪循環(huán)開始， 上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由 延伸而成的 DNA單鏈會與 結(jié)合，進(jìn)行 DNA的延伸，這樣， DNA 聚合酶只 能,使這段固定長度的序列成指

4、數(shù)擴(kuò)增。2 PCR變性 復(fù)性 延伸tI變性：在 C時DNA軍旋復(fù)性：在 C時引物與DN呼鏈結(jié)合延伸：在 C時合成DNA?鏈(兩個引物間的序列)思考(1) PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為哪三步？(2)在循環(huán)之前，常要進(jìn)行一次預(yù)變性，目的是？(3)第一輪循環(huán)之后的結(jié)果是什么?(4)細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制和細(xì)胞外 PCR擴(kuò)增的比較DNA復(fù)制PCR擴(kuò)增不 同 點(diǎn)場所能量酶是否需要 加入引物是否需緩 沖液設(shè)備相 同 點(diǎn)原料復(fù)制原理模板引物3 .實驗操作在實驗室中，做PCR通常使用 ,它是一種薄壁塑料管。具體操作時，用微量移液器，按PCR反應(yīng)體系的配方在 中依次加入各組分，再參照課本P62表的設(shè)

5、置設(shè)計好PCR儀的循環(huán)程序即可。思考1緩沖液相當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的什么成分？ (1)在PCR反應(yīng)中，如何設(shè)置對照實驗？(2)如果沒有PCR儀，可以怎樣操作變性、復(fù)性和延伸這三個步驟?4 .操作提示(1)為避免外源 DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的 、以 及蒸儲水等在使用前必須進(jìn)行 。(2) PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在 儲存。使用前，將所需試 劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。在微量離心管中添加反應(yīng)成分時，移液管上的槍頭 要。思考(1)為避免外源 DNA等因素的污染，實驗中可以進(jìn)行怎樣的操作？(2) PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)怎樣儲存？使用前需要經(jīng)過怎樣的處理？(3)在微量離心管中添加反

6、應(yīng)成分時，應(yīng)怎樣使用槍頭？(5)寫出該實驗的操作步驟。5、結(jié)果分析與評價：(1)利用DNA的什么特點(diǎn)對 DNA含量進(jìn)行測定?(3) DNA含量的測定方法。(4) PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。課堂總結(jié)】多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DN片段 PCR原理DNA的復(fù)制需要酶、原料、能量、引物DNA的變性和復(fù)性受溫度影響,PCR過程 變性 復(fù)性延伸移入離心管T測定含量 r稀釋r調(diào)零t測定并讀數(shù) 什 計算典例解析一個由15N標(biāo)記的DNA分子總數(shù)的(A 1/10 BDNA分子,)1/5 C放在沒有標(biāo)記的環(huán)境中培養(yǎng)，利用1/16D1/25PCR循環(huán)5次后標(biāo)記的例如：PCR反應(yīng)中的目的片段一般以 2n的方式積累，其中n為反應(yīng)循環(huán)次

7、數(shù)。一個DNA 片段在30次循環(huán)后反應(yīng)物中大約有 10億個這樣的片段。(230)(4)在操作中離心10s的目的是什么?疑難點(diǎn)撥1 .PCR技術(shù)簡介DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時DNA含量太低而難以PCR是一種體外迅速擴(kuò)增內(nèi)復(fù)制出上百萬份的 DNA拷貝。這項技術(shù)有效地解決了因為樣品中對樣品進(jìn)行分析研究的問題，被廣泛的應(yīng)用于遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測定等各方面。2 .細(xì)胞內(nèi)參與DNA復(fù)制的各種組成成分及其作用解旋酶：打開DNA雙鏈 DNA母鏈：提供DNA復(fù)制的模板 4種脫氧核甘酸： 合成子鏈的原料 DNA聚合酶：催化合成 DNA子鏈 引物：使

8、DNA聚合酶能夠從 引物的3,端開始連接脫氧核甘酸 (引物是一小段 DNA或RNA,它能與DNA母鏈的一段堿 基序列互補(bǔ)配對。用于 PCR的引物長度通常為 2030個核甘酸)學(xué)習(xí)必備歡迎下載課題2:多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增 DNA片段練習(xí)課堂基礎(chǔ)訓(xùn)練1、DN的子復(fù)制時，解旋的兩條鏈中（）A.僅一條鏈作為復(fù)制模板B.兩條鏈作為模板并復(fù)制出兩個不同的 DN吩子C.兩條鏈作為模板并復(fù)制出兩個相同的 DN吩子D.兩條鏈作為模板，各自合成一條子鏈，然后兩條母鏈重新結(jié)合為原來的雙螺旋分子，兩條新鏈結(jié)合成一個全新的 DN的子2、DNA勺合成方向總是（）延伸。A.從DNA子的左端向右端B.從DN6子的右端向左端C.

9、從子鏈的5'端向3'端 D.從子鏈的3'端向5'端3、下列關(guān)于DNAM制過程的正確順序是（D ）互補(bǔ)堿基對之間氫鍵斷裂互補(bǔ)堿基對之間形成氫鍵DNA子在解旋酶的作用下解旋以解旋后的母鏈為模板進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對子鏈與母鏈盤旋成雙螺旋狀結(jié)構(gòu)A. B. C. D.4、要使PC阪應(yīng)在體外的條件下順利地進(jìn)行，需要嚴(yán)格的控制（ C ）A.氧氣的濃度 B.酸堿度 C.溫度 D.大氣的濕度5、實驗室內(nèi)模擬生物體 DNA勺復(fù)制必需的一組條件是（D ）酶游離的脫氧核甘酸ATF® DNA分子mRNAtRNA©適宜的溫度適宜 的酸堿度A.B. C. D.課后拓展訓(xùn)練1、

10、下列各項過程中，遵循“堿基互補(bǔ)配對原則”的有（）DNAM制RNAM制轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄A. B. C. D.2、DN的子經(jīng)PC即應(yīng)循環(huán)一次后，新合成的那條子鏈的脫氧核甘酸的序列應(yīng)A.模板母鏈相同B.非模板母鏈相同C.兩條模板母鏈相同D.兩條模板母鏈都不相同3、利用PC叱術(shù)，把一個雙鏈DN的子當(dāng)作第一代，經(jīng)過3次循環(huán)，在第四 代DN吩子中，有幾條第一代脫氧核甘酸的長鏈？（）A.2B.4C.8D.164、假設(shè)PCRS應(yīng)中，只有一個DNA勺片段作為模板，請計算在30次循環(huán)后,反應(yīng)物中大約有多少這樣的DNAt段（）A.215B.230C.260D.2315、PCR技術(shù)是把某一 DNA片段在實驗條件下，合成

11、許許多多相同片段的一種方法，利用這種技術(shù)能快速而特異的擴(kuò)增任何要求的目的基因或者DNA分子片段，“人類基因組計劃”的研究中常用到這種技術(shù)。請結(jié)合有關(guān)知識，回答有關(guān)此技術(shù)的一些問題：PCR技術(shù)能把某一 DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，依據(jù)的原理是： 在實驗條件下，DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增，除了所要擴(kuò)增的 DNA片段處，還需 要、和、等條件。某DNA片段有160個堿基，其中有腺喋吟35個，若讓該DNA分子擴(kuò)增三 次（即復(fù)制三次）至少需要腺喋吟脫氧核甘酸和鳥喋吟脫氧核甘酸的數(shù)目分別是 和 個。6、將大腸桿菌置于含15N的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。這樣，后代大腸桿菌細(xì)胞中的DNA 雙鏈均被15N標(biāo)記。然后將被15N標(biāo)記的大腸桿菌作為親代轉(zhuǎn)到普通培養(yǎng)基中， 繁殖兩代。親代、第一代、第二代