線粒體與細(xì)胞凋亡研究進(jìn)展

1、細(xì)胞生物學(xué)·綜 述·線粒體與細(xì)胞凋亡研究進(jìn)展曾凱星11.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣州，510006【摘要】線粒體是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者。當(dāng)線粒體受到內(nèi)外環(huán)境因素的影響時(shí)，會(huì)造成線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔持續(xù)開放，細(xì)胞色素C的釋放、Caspase蛋白的激活以及活性氧的作用。本文闡述了三者變化的多種機(jī)制，同時(shí)也論述了Bcl-2家族和AIF因子在凋亡過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用機(jī)制，為尋找腫瘤靶點(diǎn)提供機(jī)遇?！娟P(guān)鍵詞】線粒體；細(xì)胞凋亡；線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔；細(xì)胞色素C；Caspase Study Progress of Mitochondria and ApoptosisKai-xing ZENG11.School

2、 of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-Sen University, Guangzhou, 51006, ChinaAbstract: Mitochondria are the executors of apoptosis. When the mitochondria are affected internal and external environmental factors, can cause mitochondrial permeability transition pore remain open, release of cytochrome C

3、 and activation of Caspase protein. This paper describes the various mechanisms of the three variations, but also discusses the Bcl-2 family and AIF factor regulating mechanism during apoptosis, these mechanisms provides an opportunity to find tumor targets.Keywords: Mitochondria; Cell apoptosis; mi

4、tochondrion permeability transition pore; Cytochrome C; Caspase7細(xì)胞凋亡是集體在生長(zhǎng)、發(fā)育和受到外來(lái)刺激時(shí)清除多余、衰老和受損傷的細(xì)胞以保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡和維持正常生理活動(dòng)過(guò)程中的一種基礎(chǔ)調(diào)節(jié)機(jī)制。這種調(diào)節(jié)機(jī)制的異常與多種疾病的發(fā)生有關(guān)，如癌癥的發(fā)生于細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)，而老年性癡呆與神經(jīng)細(xì)胞凋亡過(guò)度有關(guān)。目前對(duì)細(xì)胞凋亡的研究已經(jīng)涉及到腫瘤生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等方面。線粒體是真核細(xì)胞賴以生存的產(chǎn)能場(chǎng)所，而近十幾年來(lái)發(fā)現(xiàn)線粒體是調(diào)控細(xì)胞的重要細(xì)胞器。1 線粒體與細(xì)胞凋亡目前發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡主要經(jīng)過(guò)三條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，一條是外源性通路， 即由

5、死亡受體及配體系統(tǒng)激發(fā)的凋亡信號(hào)下傳，啟動(dòng) Caspase蛋白酶而引發(fā)細(xì)胞凋亡1; 另一通路稱為內(nèi)源性通路， 細(xì)胞外的某些信號(hào)或細(xì)胞內(nèi)DNA的損傷首先引起促凋亡的 Bcl -2 家族成員發(fā)生蛋白水解、脫磷酸化等修飾，由無(wú)活性狀態(tài)變?yōu)榛钚誀顟B(tài)， 從而由胞漿向線粒體膜移位，使PTP打開、DYm降低等變化， 細(xì)胞色素C 等凋亡信號(hào)分子進(jìn)入胞漿， 發(fā)揮激活Caspase等的作用， 從而導(dǎo)致凋亡的特征性改變2。；還有一條凋亡通路為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，其確切機(jī)制目前還不十分清楚。前兩種通路這兩條通路最后都匯集于下游的效應(yīng)Caspase，即凋亡蛋白酶Casapse的激活?；罨疌aspase在細(xì)胞中能切割400多種，

6、如Laminas、信號(hào)分子如蛋白激酶、骨架蛋白、DNA修復(fù)酶以及包括調(diào)控mRNA剪切、DNA復(fù)制的功能蛋白。這些重要蛋白質(zhì)的降解和核酸酶的激活最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。2 MPTP和DYm對(duì)細(xì)胞凋亡的作用線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(mitochondrion permeability transition pore， MPTP)是由位于線粒體外膜的電位依賴性陰離子通道( voltage dependent anion channel， VDAC)、線粒體內(nèi)膜的腺苷酸移位酶 ( adenine nucleotide translocate，ANT)、線粒體基質(zhì)的環(huán)孢菌素A結(jié)合蛋白D(cyclophilin D，

7、CypD) 及其他分子構(gòu)成的一種復(fù)合結(jié)構(gòu)，DYm的穩(wěn)定有密切關(guān)系。MPTP是跨越線粒體外膜和內(nèi)膜的通道，M PTP周期性開放， 以維持線粒體內(nèi)電化學(xué)平衡及穩(wěn)定狀態(tài)。多種因素對(duì)MPTP具有調(diào)節(jié)作用，pH下降、環(huán)孢菌素A、Mg2 +、磷酸酯酶抑制劑等因素對(duì)MPTP的開放具有抑制作用，而pH升高、Ca2 +、無(wú)機(jī)磷酸鹽、過(guò)氧化物等因素對(duì)MPTP開放具有促進(jìn)作用。正常情況下MPTP間歇性開放，分子質(zhì)量小于1.5 ku的物質(zhì) ，如質(zhì)子 、Ca2+、谷胱甘肽等可選擇性通過(guò)，這些物質(zhì)對(duì)維持線粒體膜電位和Ca2 +平衡具有重要作用。當(dāng)MPTP持續(xù)開放時(shí)DYm降低甚至完全崩解，而DYm的崩解是細(xì)胞凋亡的特異性早

8、期指標(biāo)之一。線粒體基質(zhì)的三羧酸循環(huán)酶系通過(guò)底物脫氫氧化生成還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸( NADH ) 。NADH通過(guò)線粒體內(nèi)膜呼吸鏈氧化，生產(chǎn)大量的ATP。與此同時(shí)，導(dǎo)致跨膜質(zhì)子移位形成DYm。線粒體內(nèi)膜上的ATP合成酶利用DYm 能量合成 ATP。DYm的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰絲氨酸暴露于細(xì)胞表面。而一旦DYm 耗散，線粒體可釋放AIF和細(xì)胞色素C，細(xì)胞就會(huì)進(jìn)入不可逆的凋亡過(guò)程。線粒體解開呼吸鏈會(huì)產(chǎn)生大量活性氧，氧化線粒體內(nèi)膜上的卵磷脂。線粒體通透性改變( mitochondrial permeability transition , M PT ) 即 P T P 的非特異性 開

9、放。M P T的作用有自我放大的效應(yīng)。M PT 誘導(dǎo)DYm耗散,而反過(guò)來(lái) mClCCP 使 DYm去極化會(huì)導(dǎo)致 M PT 。一些 P T P 的結(jié)果例如DYm耗散, 活性氧的生成本身也會(huì)導(dǎo)致 M P T 。這就說(shuō)明 M PT 有正反饋, 從而在細(xì)胞凋亡中有自我摧毀的作用。反過(guò)來(lái), 如果能防止DYm的耗散, 就能避免氧化還原不平衡、磷酯酰絲氨酸的暴露與蛋白酶和核酸酶的激活。然而,某些細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放可能比DYm早, 說(shuō)明線粒體釋放的細(xì)胞色素C可能還依賴于非PT P開放的其他途經(jīng)，下面會(huì)繼續(xù)討論細(xì)胞色素C的釋放途徑及作用機(jī)理。線粒體的結(jié)構(gòu)、功能與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切, 其中PT P的作用極其重要

10、, 如果線粒體有大量 PTP形成, 細(xì)胞ATP濃度很快下降, 則在致凋亡的蛋白酶被活化前細(xì)胞就壞死了。而DYm耗散產(chǎn)生的超氧陰離子也導(dǎo)致細(xì)胞死亡。3 細(xì)胞色素C、Casapse家族以及活性氧對(duì)細(xì)胞凋亡的作用3.1 細(xì)胞色素C細(xì)胞色素C不僅可作為呼吸鏈電子傳遞的物質(zhì)，也是調(diào)控細(xì)胞凋亡的一種主要蛋白。在線粒體損傷后，細(xì)胞色素C作為應(yīng)做傳感器被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而引發(fā)細(xì)胞執(zhí)行凋亡程序。細(xì)胞色素C由2個(gè)沒有促凋亡活性的前體分子血紅素和脫輔基細(xì)胞色素C在膜間組裝而成，具有促凋亡構(gòu)象3。目前細(xì)胞色素C釋放的機(jī)制有很多,主要有三種：一是PTP開放導(dǎo)致外膜破裂，釋放細(xì)胞色素C；二是Bax和Bak等正常情況下能

11、與抑凋亡蛋白分子Bcl-2/ Bcl-xL/Mcl-1相互結(jié)合。而僅含BH3結(jié)構(gòu)域的Bcl-2家族促凋亡蛋白tBid、Bim等能與Bcl-2/ Bel-xL/ Mel-l 相互作用，使Bax / Bak等從抑制凋亡蛋白游離，進(jìn)而形成多聚體，促使線粒體膜通透，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放；三是Bax 或 Bak與電壓依賴性離子通道VADC結(jié)合后，可 以調(diào)節(jié)線粒體的膜電位，并導(dǎo)致細(xì)胞色素C從 Bax / Bak和VDAC 共同形成的大通道釋放。細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)后可使細(xì)胞凋亡，其主要是通過(guò)Caspase發(fā)揮凋亡作用4。3.2 Casapse家族Caspase全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cyste

12、ine aspartate specific proteinase)。caspase是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中具有類似結(jié)構(gòu)的蛋白酶。根據(jù)Caspase在凋亡中的作用和 N末端的長(zhǎng)度，將其分為2類: 一類為起始型Caspase(initiator Caspase)，另一類為效應(yīng)型Caspase( effector Caspase) 。前者包括Caspase 8、9、10 等，具有長(zhǎng)的N末端，能啟動(dòng)凋亡和調(diào)節(jié)后者，后者包括Caspase 1、3、6、7等，有短的 N末端，是凋亡的終結(jié)者。在線粒體中，有兩種Caspase釋放及作用機(jī)制。Caspase被死亡信號(hào)激活后，其激活第二 信使如 Ca2+、Bcl

13、-2、神經(jīng)酰胺、活性氧等，作用于線粒體，線粒體釋放的proCaspase 2、3、9被激活后，又能激活 Caspase3、6、7。激活的Caspase3、6、7 再作用于p38激酶，誘導(dǎo)M PT進(jìn)一步提高，促進(jìn) Caspase 2、3、9的釋放，實(shí)現(xiàn)死亡信號(hào)級(jí)聯(lián)放大，加快細(xì)胞凋亡。同樣細(xì)胞色素 C也能在釋放到胞質(zhì)后，與 Caspase 9結(jié)合，激活 Caspase 9再激活Caspase 3，從而激活 Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)， 使細(xì)胞凋亡。參與凋亡的Caspase 9、Caspase 2 也是從線粒體中釋放的5。3.3 活性氧（ROS）ROS對(duì)線粒體的影響在線粒體中，ROS的產(chǎn)生與細(xì)胞色素C

14、的釋放是一個(gè)相互促進(jìn)的過(guò)程 細(xì)胞色素C是呼吸鏈中傳遞電子的重要載體 在凋亡初期，細(xì)胞色素C從線粒體釋放入胞漿，線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C減少，使得線粒體中一些電子不能被及時(shí)傳遞并從呼吸鏈中逃逸出來(lái)，與O2 作用產(chǎn)生O2，大量的O2進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌黂OS8同時(shí)，大量的ROS不僅會(huì)損傷缺乏組蛋白保護(hù)的線粒體DNA( mtDNA) 引起凋亡，而且會(huì)引起脂質(zhì)體過(guò)氧化破壞線粒體膜，使膜的流動(dòng)性降低線粒體內(nèi)外膜蛋白過(guò)氧化，蛋白質(zhì)交聯(lián)，造成線粒體通透性改變( MPTP) MPTP又具有自我放大效應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)線粒體跨膜電位( m) 耗散，使線粒體釋放細(xì)胞色素C 細(xì)胞色素C自線粒體釋放后與Apaf21及caspas

15、e29共同組 成了凋亡體，又稱為誘導(dǎo)死亡信號(hào)復(fù)合體( DISC)，當(dāng)Apaf21與細(xì)胞色素C dATP /ATP結(jié)合后便可經(jīng)募集區(qū)活化caspase2、9，再作用于其下游靶標(biāo) caspase2、3酶原，活化的caspase2、3作為效應(yīng)子作用于不同的靶細(xì)胞，經(jīng)蛋白水解作用導(dǎo)致細(xì)胞凋亡6。ROS與JNK介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑: ROS對(duì)c-jun氨基端激酶( JNK) 的激活作用能誘發(fā)外在或內(nèi)在的細(xì)胞凋亡信號(hào)JNK的上游是對(duì)氧化還原反應(yīng)敏感的MAPKKK，ASK1 氧化還原蛋白( Grx，Trx1) ， 熱休克蛋白( Hsp90，Hsp72) ， 14-3-3能抑制ASK1的活性，而TRAF蛋白Da

16、xx JASP/JIP3 ASK1相關(guān)蛋白則能激活A(yù)SK1，ASK1-JNK信號(hào)通路在TNFR1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中具有重要作用 TNF- 產(chǎn)生抗凋亡還是促凋亡作用依賴于被ROS激活的JNK的濃度和作用時(shí)間 JNK短暫少量的激活能夠促使NF-B介導(dǎo)的抗凋亡基因的表達(dá)并使細(xì)胞存活，而JNK持續(xù)大量的激活與ASK1信號(hào)途徑所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān) 因此理論上講，如果能夠控制JNK的激活程度與持續(xù)時(shí)間，就能使特異性靶細(xì)胞存活或死亡，這為腫瘤的治療提供了新思路。圖1 ROS對(duì)線粒體的影響7圖1是目前對(duì)ROS通過(guò)ASK1/JNK信號(hào)途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡理解的總結(jié) 這一模型提出ROS能夠介導(dǎo)Trx1和AS

17、K1氨基端結(jié)構(gòu)域的相互作用，阻止ASK1的激活以及下游凋亡信號(hào)的傳遞 只有當(dāng)Trx1與ASK1的結(jié)合減少時(shí)，Trx1/ASK1復(fù)合物( 被稱作ASK1信號(hào)體) 才起到氧化還原開關(guān)的作用，能夠在氧化條件下感知細(xì)胞內(nèi)的ROS濃度并被激活 細(xì)胞內(nèi)高濃度的ROS能誘導(dǎo)被氧化的Trx1從復(fù)合體上解離下來(lái)，并使ASK1通過(guò)氨基末端結(jié)構(gòu)域的卷曲螺旋實(shí)現(xiàn)寡聚化使其具有完整的ASK1蛋白激酶活性有功能的ASK1信號(hào)復(fù)合體的形成需要TRAF2/6的募集，這一過(guò)程會(huì)加速ASK1的自磷酸化和JNK的激活 ASK2是ASK家族的另一個(gè)成員，它在細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核以及線粒體中均能與ASK1結(jié)合并使其穩(wěn)定，這個(gè)過(guò)程無(wú)論在調(diào)節(jié)AS

18、K1/JNK信號(hào)通路還是細(xì)胞凋亡過(guò)程中都具有重要作用。4 凋亡調(diào)節(jié)因子與細(xì)胞凋亡4.1 Bcl-2家族Bcl-2、Bcl-xL等細(xì)胞凋亡負(fù)調(diào)因子在許多類型的細(xì)胞受到外界刺激時(shí)能保護(hù)細(xì)胞免于凋亡。它們主要定位在核膜的胞質(zhì)面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體外膜上。其疏水性C末端定位于細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)上，而N末端朝向細(xì)胞質(zhì)。與膜的結(jié)合對(duì) 于其發(fā)揮功能是極其重要的。實(shí)驗(yàn)表明,失去膜定位能力的Bcl-2蛋白的抗凋亡能力減弱了許多8,9。BH4結(jié)構(gòu)域是Bcl-2等抗凋亡蛋白所特有的(Bcl-xL除外)。雖然BH4不是形成二聚體所必需的區(qū)域,但它的缺失或使蛋白質(zhì)喪失功能,或產(chǎn)生一個(gè)促凋亡而 不是抗凋亡的突變體10。這說(shuō)明BH4

19、對(duì)Bcl-2或Bcl-xL發(fā)揮其抗凋亡功能是必需的。線粒體膜上的Bcl-2至少在三個(gè)水平上發(fā)揮功能來(lái)抑制凋亡:主要通過(guò)與Bax/Bak 相互作用來(lái)抑制細(xì)胞凋 亡; Bax是一種可溶性的蛋白分子,主要位于細(xì)胞質(zhì)中，但當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時(shí)它能從胞漿轉(zhuǎn)移到線粒體并與線粒體膜相結(jié)11。實(shí)驗(yàn)證明,位于線粒體膜上的Bcl-2能與Bax相互作用,而后者也必須在線粒體上才能發(fā)揮其誘導(dǎo)凋亡的作用。同時(shí)把微量的重組Ba x加入到分離的線粒體 中能夠誘導(dǎo)細(xì)胞色素C 的釋放和Caspase激活,而只 含有Bax的BH3結(jié)構(gòu)域的多肽則沒有這種功能。Bax與Bcl-2相反,能促進(jìn) P T P 開放,并促進(jìn)線粒體促凋 亡 因子的釋

20、放,Ba x的促凋亡作用 能被Bcl-2所抑制。并且,只有定位于線粒體上的Bcl-2和Bcl-xL才能拮抗 Ba x蛋白和阻止細(xì)胞色素C 釋放、Caspase激活和凋亡,Bcl-2對(duì)DYm則無(wú)此功能（2）Bcl-2 能改變線粒體琉基的氧化還原狀態(tài)來(lái)調(diào)控線粒體膜電位從而調(diào)控細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中,線粒體的琉基可能組成了胞內(nèi)氧化還原電位的傳感器,Bcl-2可能是通過(guò)抑制谷胱甘肽 (GSH)的外泄,降低胞內(nèi)的氧化還原電位來(lái)抑制細(xì)胞凋亡的;(3) Bcl-2能通過(guò) 抑制PTP開放來(lái)抑制促凋亡蛋白從線粒體中釋放,從而保護(hù)細(xì) 胞免于凋亡;有證據(jù)顯示,Bcl-2還能將凋亡蛋白前體APaf-1等定位至線粒

21、體膜上,使其不能發(fā)揮促凋亡作用。4.2 凋亡誘導(dǎo)因子( AIF) 與細(xì)胞凋亡凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor , AIF)是一種分子質(zhì)量大小為57 ku的雙功能黃素蛋白，位于線粒體的雙層膜間區(qū) , 具有電子供體/ 受體功能。AIF在誘導(dǎo)凋亡的同時(shí)會(huì)激發(fā)線粒體膜通透性的改變 , 誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C和 Caspase 9 , 促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)?shù)蛲霰徽T導(dǎo)后, AIF從線粒體中釋放出來(lái) , 獲能后直接進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),獨(dú)立地將染色質(zhì)降解60ku左右的片段, 引起染色質(zhì)凝縮與片段化。與其它細(xì)胞死亡模式不同, 顯微注射 A I F 抗體可抑制細(xì)胞色素C的釋放和 Caspa

22、se 的級(jí)聯(lián)反應(yīng), 然而細(xì)胞色素C和Caspase抑制 劑并不能影響AIF的釋放, 可 見AIF在細(xì)胞色素C/ Caspase凋亡途徑上游發(fā)揮了促凋亡作用 , 而且也不依賴于 Caspase 和細(xì)胞色素C凋亡體。 線粒體膜上的 Bal - 2 家族控制著線粒體MPTP的大小 , 能阻止AIF的釋放, 但不影響AIF的活性。此外, AIF還可反饋放大MPTP 的滲透性, 誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C等凋亡蛋白, 促進(jìn)細(xì)胞凋亡。AIF自身并不具有核酸內(nèi)切酶活性, 許多研究結(jié)果表明 , AIF可能與EndoG或其他核酸內(nèi)切酶協(xié)同作用 , 但這一機(jī)制還需要進(jìn)一步研究 。5 結(jié)語(yǔ)線粒體在細(xì)胞凋亡中起最基本的

23、用 , 是凋亡的執(zhí)行者。它受到外部因素如Ca2+、Caspase、PH下降等刺激后，發(fā)生MPTP打開以及DYm耗散的現(xiàn)象后，導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放以及下游的Caspase的激活。除了MPTP打開的原因外，細(xì)胞色素C有多種釋放機(jī)制；同時(shí)Caspase也有其他與線粒體有關(guān)的激活機(jī)制，而且活性氧也在其中參與了細(xì)胞凋亡。同時(shí)Bcl-2家族與AIF起到了調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用。而本文除了論述MPTP到細(xì)胞色素C，再到Caspase這條導(dǎo)致細(xì)胞凋亡這一條主要途徑外，還闡述了其它與線粒體的作用機(jī)制和Caspase的凋亡機(jī)制。細(xì)胞凋亡與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，而大量細(xì)胞凋亡機(jī)制與線粒體有關(guān)，所以對(duì)這一機(jī)制的研究有助于尋找

24、抗腫瘤靶點(diǎn)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。References:1. John stone RW , RuefliAA, Lowe SW. Apoptosis: a link between cancer genetics and chemotherapy . Cell , 2002, 108( 2) : 153-164.2. Martinous JC, Desagher S, Antonsson B., Cytochrome c release from mitochondria all or nothing. Nat Cell Biol, 2000, 2(3) : 41 -433. Susin S

25、A , Lorenzo HZ , Zamzami N , et al. Molecules characterization of mitochondrial apoptosis inducing factor. Nature, 1999, 397( 6718) : 441-445.4. Shimizu S, Narita M. Tsuinmoto Y.,Bcl-2 family proteins regulate the release the release apoptogenic cytochrome c by the mitochondrial channel VDAC. Nature. 1999, 399(10): 487-75. 胡 碩，胡成平線粒體與細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展J 國(guó)際呼吸雜志，2006，26( 6) :4634666. 李捷萌，陳彥青，劉榮國(guó) 線粒體凋亡途徑與Bcl2家族蛋白研究進(jìn)展J