WesternBlotting實驗報告

1、Western Blotting 本次試驗的目的是使同學們掌握Western Blotting法鑒定目標蛋白的原理和熟悉Western Blotting的方法，并了解抗原抗體結合反應的影響因素。 Western Blotting的 blotting譯為印跡法，是指將樣品轉移到固相載體上，而后利用相應的探測反應來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNARNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質進行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白

2、質分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。 Western既可以定性，又可以半定量，是初步鑒定蛋白質最方便也是最通用的方法。它通常分為兩種方法：Western Blotting方法一: 直接法方法二: 間接法優(yōu)點：1.快速（一種抗體）2.沒有二抗交叉反應引起的非特異性條帶1. 免特異性不受標記影響2. 信號放大靈敏度高（多個二抗結合位點）3. 多種標記的二抗可供選擇4. 可選擇不同的Marker缺點：1.免疫反應性降低2.無信號二級放大3.抗體標記費時昂貴,使用不方便1. 交叉反應引起的非特異性條帶2. 額外的二抗孵育以及條件優(yōu)化同時W

3、estern又具有多種識別蛋白質的顯色方法，主要有以下幾種：i. 放射自顯影 ii. 底物化學發(fā)光ECL iii. 底物熒光ECF iv. 底物DAB呈色 現(xiàn)常用的有底物化學發(fā)光ECL和底物DAB呈色。一、實驗原理Western Blotting（蛋白質免疫印跡法）是將經聚丙烯酰胺凝膠電泳奮力的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質為抗原，與之對應的第一抗體發(fā)生免疫結合反應，一抗再與酶或同位素標記的第二抗體發(fā)生免疫結合反應，經過底物顯色活放射自顯影以檢查電泳分離的提議目的蛋白成分。

4、蛋白質印跡技術結合了凝膠電泳分辨力高和固相免疫測定特異性高、敏感等諸多優(yōu)點，能從復雜混合物中對特定抗原進行鑒別和定量檢測。 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(Acr)、N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)和催化劑(AP)、加速劑(TEMED聚合成的三維網孔結構(凝膠）。據有無濃縮效應可將電泳分為兩類：i. 連續(xù)系統(tǒng)：緩沖液pH值、凝膠濃度相同，帶電粒子靠電荷及分子篩效應區(qū)分。ii. 不連續(xù)系統(tǒng)：緩沖離子成分、 pH值、凝膠濃度不同，帶電粒子在電場中由電效應、 分子篩效應、濃縮效應區(qū)分。SDS-PAGE的原理是：依靠SDS帶有大量負電荷來掩蓋蛋白質表面的凈電荷：同時由于在電泳溶液中加入了SD

5、S和巰基乙醇，因此它還可以改變蛋白質構象：在實驗中要注意：印跡法需要較好的蛋白質凝膠電泳技術，是蛋白質樣品達到良好的分離效果，而且要注意膠的質量，是蛋白質容易轉移帶固相支持物上，另外蛋白質在電泳過程中分離得到的條帶被保留在膜上，在隨后的寶物階段不丟失和擴散。免疫印跡分析之需要很小體積的時間，較短的時間過長，操作容易，適用于理論和應用上的研究。本實驗采用人血清為材料，人類Ig根據其重鏈穩(wěn)定區(qū)的分子結構和抗原特異性的不同，分為五類：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。其中 IgG占血清免疫球蛋白總量的75%80%。人的IgG由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，它們之間以二硫鍵相連。在加SDS的電泳條件下

6、，分子中的二硫鍵被還原成游離的巰基，四條鏈分開，重鏈遷移速度較慢，輕鏈遷移速度較快，可跑出兩條帶。對此樣品進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，用電轉移法將蛋白質轉印到硝酸纖維素薄膜上，用兔抗人IgG為第一抗體，用辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG為第二抗體，在過氧化物酶第五存在的情況下，檢測人的IgG。二、試劑，器材和實驗材料【試劑】1. 30丙烯酰胺貯備液：29.2g 丙烯酰胺，0.8g 甲叉雙丙烯酰胺，加重蒸水至100ml。2. 濃縮膠緩沖液：0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8。3. 分離膠緩沖液：3mol/L Tris-HCl，pH8.9。4. 10過硫酸銨(w/

7、v)：臨用前用蒸餾水配制。5. 10SDS(w/v)。6. 10TEMED。7. 電極緩沖液：甘氨酸 11.28g, SDS 0.4g, Tris 2.4g, 加水至800ml，pH8.3。8. 樣品緩沖液：0.1mol/L Tris-HCl緩沖液，pH6.8，20甘油，4SDS，10巰基乙醇，0.005溴酚蘭。9. 考馬斯亮藍R250染色液：考馬斯亮藍R250 0.25g，30%乙醇，10%冰乙酸。10. 脫色液：乙醇6ml，冰乙酸2ml，加水至20ml。11. TBS（Tris-HCl,NaCl）緩沖液：20mmol/L Tris-HCl,12. 500mmol/L NaCl，pH7.5，

8、每組配150ml。13. TTBS：取100mlTBS，加250l 20Tween-20。14. 封閉液及抗體稀釋液：3脫脂奶粉-TBS，每組配10ml。15. 底物溶液：2.5mg二氨基聯(lián)苯胺（DAB）+ 10mlTBS +10l H2O2，臨用前配制。16. 考馬斯亮藍R250染色液：考馬斯亮藍R250 0.25g，30%乙醇，10%冰乙酸，總體積500ml。17. 脫色液：乙醇6ml，冰乙酸2ml，加水至20ml?！酒鞑摹?. 夾心式電泳槽2. 轉移電泳槽3. 電泳儀【實驗材料】1. 人血清2. 硝酸纖維素膜3、 實驗步驟 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳1. 灌膠前的準備： 將兩塊玻璃板洗凈晾

9、干或用吹風機吹干，嵌入本體的凹槽中，長玻板朝外，短玻板朝內，兩塊玻璃板之間就形成了凝膠室。合上滑塊，擰螺栓鎖緊凝膠室，檢查凝膠室底部是否與本體底端重合。然后將以上組合放入制膠架，插入并旋轉凸輪，即可灌膠。2. 配制膠液膠液濃度% 分離膠 濃縮膠 12%4%30%貯備液(ml) 3.20.53分離膠緩沖液(ml) 2濃縮膠緩沖液(ml) 1.0重蒸水(ml) 2.662.3610%SDS(ul) 8040混勻后再加入以下試劑： 10%TEMED(ul) 804010過硫酸銨(ul) 4020總體積(ml) 843. 灌 膠：將配制好的分離膠液倒入兩塊玻璃板之間的凝膠室中，待膠液加至距短玻璃板 頂

10、端約1.5cm處時停止灌膠，然后在膠液表面上小心加入厚約0.5cm的水層，以保持分離膠面平整，同時隔絕空氣，空氣中的氧對凝膠的聚合有阻礙作用。待凝膠和水之間出現(xiàn)清晰界面時，說明分離膠已聚合 ，大約30min完成聚合。傾去分離膠上層的水，將配制好的濃縮膠液加到分離膠上，至接近短玻璃板的頂端 ，插上樣品梳，放置待其聚合。4. 配制電極緩沖液：甘氨酸 14.1g，SDS 0.5g，Tris 3g，加水至1000ml，pH8.3。每組配1000ml。5. 制 樣：5l人血清，加45l水，再加50l加樣緩沖液。沸水浴加熱8分鐘，10000rpm離心2分鐘,取上清液作為樣品。另按說明書制備好蛋白質分子量標

11、準樣品。 6. 加 樣：1、加入電極緩沖液；a) 拔出樣品梳；b）選3個樣品槽，用微量進樣器加樣，中間槽加入5l分子量標準蛋白樣品，兩旁槽各加入10l人血清樣品。 穩(wěn)壓120V電泳，當溴酚藍前沿到達距底部0.5cm左右時，停止電泳。7. 切 膠：根據切割線，先豎切后橫切，寬膠條為兩泳道，含人血清樣和分子量標準蛋白樣，考馬斯亮藍R-250全蛋白染色。窄膠條為一泳道，為人血清樣，轉印后對目標蛋白免疫染色。8. 膠條保存：將兩個膠條用保鮮袋包好，貼上標有自己名字的標簽-20 凍存。 轉印蛋白質到硝酸纖維素膜上1. 將帶有人血清和標準蛋白的寬膠帶用考馬斯亮藍R250染色、脫色：將寬膠條放到培養(yǎng)皿中，用

12、蒸餾水清洗后，加入約10ml考馬斯亮藍R-250染色液染色1小時左右，然后換成脫色液脫色，不時搖動。更換幾次脫色液，至背景無色透明，條帶清晰為止。2. 放置NC膜和膠條：a) .切割與膠尺寸相符的硝酸纖維素膜，用轉移緩沖液或水浸泡5min使之濕潤。b) .準備2張濾紙和海綿一起浸泡在轉移緩沖液中。c) 打開轉移轉移槽的膠板，依次放入：a.一張浸濕的海綿 b. 一張浸濕的濾紙c. 用轉移緩沖液沖洗過的膠，并小心地趕走濾紙和膠之間的氣泡d. 硝酸纖維素膜，在膜的右下角剪一小角，以標明電泳方向e. 一張浸濕的濾紙f. 一張浸濕的海綿。3. 轉 移：小心地合上膠板，按膠側為負極，膜側為正極的方向放入轉

13、移電泳槽中，加轉移緩沖液至滿。插好轉移電泳裝置的電極，打開電泳儀開關調至穩(wěn)壓60V，電泳1h，轉移結束后打開膠板取出硝酸纖維素薄膜。 膜的酶聯(lián)免疫染色1. 封閉：用TBS緩沖液洗膜1min后，將膜封入塑料薄膜袋內，留一開口。加封閉液1ml后封閉開口，37搖床上搖動30min。2. 加封閉液及抗體 a)與第一抗體結合(1) 棄封閉液，加入適當稀釋的1ml第一抗體溶液(兔抗人IgG)，封口后37搖床上輕輕搖動50min。(2) 取出膜，用TTBS洗膜3次，每次1min。再封入一新的塑料薄膜袋內。 b)與酶標第二抗體結合(3) 加入適當稀釋的1ml辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG，37搖床上輕輕搖動5

14、0min。(4) 取出膜，用TTBS洗3次，每次1min，最后用TBS溶液洗1次，以去除Tween-20。 加底物溶液顯色將膜浸入10ml底物溶液中，至顯色清楚后，用水清洗，以除去多余的底物。轉入水中保存。3. 結果分析：在凝膠成像分析系統(tǒng)上照相，并分析結果。測量分子量標準蛋白的遷移距離，作出標準曲線，再測出硝酸纖維素膜上的人IgG帶的遷移距離，在標準曲線上查出人IgG重鏈的分子量。實驗結果： 做標準蛋白曲線的的凝膠的總長為7.53cm條帶1條帶2條帶3條帶4條帶5條帶6蛋白條帶標準分子量Mr/KDa66.245.035.025.018.414.4logMr1.821.651.541.401.

15、261.16蛋白質條帶遷移距離/cm1.582.413.174.185.155.82相對遷移率0.210.320.420.560680.77帶有人血清IgG的硝酸纖維素膜的總長為7.24cmIgG輕鏈遷移距離/cmIgG輕鏈相對遷移率IgG重鏈遷移距離/IgG重鏈相對遷移率數(shù)值4.080.562.380.33由公式y(tǒng) = -1.1451x + 2.0366知： 當x（重鏈相對遷移率）=0.33時，y=1.6587 得IgG重鏈相當分子量為：45.57KDa 當x（輕鏈相對遷移率）=0.56時，y=1.3953 得IgG輕鏈相當分子量為：24.85KDa討論：1、 實驗注意事項：1. .丙烯酰胺

16、和甲叉雙丙烯酰胺有神經毒性，注意不要沾在皮膚上，如有沾染可用水洗凈。聚合成聚丙烯酰胺后毒性即消失。2. 電泳槽只能用水沖洗，不能用刷子刷，以免刷斷鉑電極絲；注意保護玻璃板。3. 一抗的選擇是影響免疫印跡成敗的主要因素。多克隆抗體結合抗原能力較強、靈敏度高，但易產生非特異性的背景；單克隆抗體識別抗原特異性較好，但可能不識別在樣品制備時因變性而失去了空間構型的抗原表位，且易發(fā)生交叉反應。因此，兼有多克隆抗體和單克隆抗體優(yōu)點的混合單克隆抗體近年特別被推薦，它是由一組能與抗原分子中的不同且不易變性的抗原表位結合并不易出現(xiàn)交叉反應的單克隆抗體混合構成。4. .如果反應靈敏度不高，可增加凝膠的厚度到1.5

17、mm（厚度超過2.0mm時，凝膠轉移效率受限）；也可在電泳條帶不發(fā)生變形的前提下，盡量提高蛋白樣品的上樣量。5. 濾紙/凝膠/轉印膜/濾紙夾層組合中不能存在氣泡，可用玻璃棒在夾層組合上滾動將氣泡趕出，以提高轉膜效率；上下兩層濾紙不能過大，避免導致直接接觸而引起短路。6. 如果出現(xiàn)非特異性的高背景，可觀察僅用二抗單獨處理轉印膜所產生的背景強度，若高背景確由二抗產生，可適當降低二抗?jié)舛然蚩s短二抗孵育時間；并考慮延長每一步的清洗時間。7. 一抗與二抗的稀釋度、作用時間和溫度對檢測不同的蛋白要求不同，須經預實驗確定最佳條件。8. 一般情況使用0.45m的NC膜，0.10.2m的小孔徑膜只適合于分子量小于20kD的蛋白質。2、 實驗思考題：1. 12%的分離膠適合分離多少分子量范圍的蛋白質？答：由分子克隆中的分離膠濃度與蛋白質分子量線性關系圖知，12%的分離膠適合分離分子量范圍在15-60KDa的蛋白質。2. 電極緩沖液中甘氨酸的作用?答：SDS-PAGE中樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸，電泳