PRL-3上調(diào)VEGF、VEGF-C表達(dá)并與肺癌的MVD、LVD呈正相關(guān)

1、PRL-3 上調(diào) VEGF、VEGF-C表達(dá)并與肺癌的MVD、LVD呈正相關(guān)前言 PRL-3（phosphatase of regenerating liver-3）是一種蛋白酪氨酸磷酸酶 , 通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)分子酪氨酸殘基的磷酸化調(diào)控蛋白質(zhì)活性, 參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)。 Saha 等篩選結(jié)直腸原發(fā)癌與肝轉(zhuǎn)移灶的差異表達(dá)基因時(shí)發(fā)現(xiàn), 正常結(jié)直腸組織、 良性腺瘤和結(jié)直腸癌原發(fā)灶中,PRL-3 基本不表達(dá)或低表達(dá) , 而在肝轉(zhuǎn)移灶中均高表達(dá) , 因此推測(cè) , 該基因與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。 隨后許多學(xué)者相繼發(fā)現(xiàn) PRL-3 在乳腺癌、卵巢癌、腸癌、胃癌和肺癌等腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)并與其轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。但 P

2、RL-3 的作用底物及分子機(jī)制尚不完全清楚。 鑒定出 PRL-3 底物對(duì)于理解它們?cè)谀[瘤演進(jìn)中的作用以及作為腫瘤治療的新靶點(diǎn)是很重要的。 VEGF是促進(jìn)血管形成 , 增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移能力的重要介質(zhì)。VEGF家族的 VEGF-C與其受體 VEGFR-3結(jié)合后 , 誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖, 促進(jìn)淋巴管形成。VEGF和 VEGF-C在腫瘤血管形成和淋巴管形成過程中其重要作用。本課題組以往研究發(fā)現(xiàn) :PRL-3 在 NSCLC組織中存在高表達(dá)且與VEGF和 VEGF-C的表達(dá)以及與 NSCLC組織的 MVD和 LVD數(shù)目呈正相關(guān)。我們推測(cè) PRL-3可能通過促進(jìn) VEGF、VEGF-C表達(dá)分

3、別誘導(dǎo)肺癌組織微血管、淋巴管形成 , 促進(jìn)肺癌血行和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)ERK1/2磷酸化為p-ERK,可以促進(jìn) VEGF基因轉(zhuǎn)錄 , 調(diào)控血管形成。我們探討 PRL-3是否通過 ERK1/2磷酸化 , 從而促進(jìn) VEGF、VEGF-C表達(dá)。材料和方法 1、細(xì)胞培養(yǎng)肺腺癌A549細(xì)胞在含 10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液中貼壁生長(zhǎng) ,37 ,5%CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期呈單層亞融合狀態(tài),加入含不同處理因素的培養(yǎng)液, 在不同時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞。2、方法 2.1 WesternBlot 法 : 在收集的細(xì)胞或組織內(nèi)加入裂解液充分裂解, 低溫高速離心 , 提取上清為總蛋白。上樣蛋白量為

4、 60ug。電泳（ 12%SDS-PAGE凝膠）、轉(zhuǎn)印（ 50V,120min）、 5%正常小牛血清封閉 , 一抗 ERK1/2（1:200 ）、p-ERK（ 1:200 ）, -actin （1:200 ）,VEGF（ 1:100 ）、VEGF-C（1:200 ） ,4 孵育過夜 , 分別與各自對(duì)應(yīng)的二抗（ 1:2500,chemicon,USA ）室溫孵育 2h,DAB顯色 , 結(jié)果經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀（ Chemi Imager 5500,Alpha Innotech,USA ）采集 , 進(jìn)行灰度值測(cè)定。2.2 細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測(cè)在 transwell 小室（ Corning 公

5、司）下室加入 600ul含 10%小牛血清 DMEM培養(yǎng)基 , 上室中加入 100ul 無(wú)血清 DMEM培養(yǎng)基 , 接種 A549細(xì)胞數(shù)為 2.5 ×10⁴個(gè)。37、5%C0₂孵箱中培養(yǎng) 6hr 后吸盡培養(yǎng)基 ,PBS 清洗后 , 甲醇室溫固定 15min, 用棉簽輕擦掉微孔膜上表面的細(xì)胞, 蘇木素染色 , 室溫干燥過夜。取下微孔膜 , 置載玻片上 , 鏡下觀察。細(xì)胞侵襲能力的測(cè)定用預(yù)冷的無(wú)血清培養(yǎng)基以 1:7 稀釋 Matrigel （BDBiosciences,USA ）加入上室 100u

6、l, 在室溫下放置 6h。使用前用培養(yǎng)基重新水化并吸凈 , 其他與遷移實(shí)驗(yàn)相同 , 培養(yǎng) 18hr 后觀察結(jié)果。2.3 逆轉(zhuǎn)錄 - 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）: 提取細(xì)胞總 RNA,按 RT-PCR（TaKaRa）試劑盒方法進(jìn)行反應(yīng)。 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè), 采用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。2.4 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖率的變化, 以不含細(xì)胞的等體積培養(yǎng)基作對(duì)照, 重復(fù)3 次 , 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率, 重復(fù) 3 次取均值。細(xì)胞免疫熒光染色 , 觀察 VEGF（1:100 ）、VEGF-C（1:200 ）、ERK1/2（1:200 ）、p-ERK（

7、1:200 ）的定位及表達(dá)強(qiáng)度。3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件 ,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果 1、阻斷 PRL-3能抑制 VEGF、VEGF-C的表達(dá) , 抑制 ERK1/2磷酸化可下調(diào) VEGF。用 PRL-3 抗體封閉 PRL-3 24h 后 , 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示p-ERK、VEGF和VEGF-C的表達(dá)均降低。我們進(jìn)一步用 Western 和 RT-PCR檢測(cè)加入 PRL-3 抗體（ 100ng/mL）封閉后0h,1h,2h,4h,8h,24h,發(fā)現(xiàn) VEGF和 VEGF-C的 mRNA和蛋白表達(dá)隨封閉時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下調(diào)。加入PRL-3 抗體封閉

8、 PRL-3 后 p-ERK蛋白表達(dá)逐漸下調(diào) , 而 ERK1/2表達(dá)基本不變。 為了深入探討PRL-3調(diào)控 VEGF和 VEGF-C的機(jī)制 , 我們用 ERK1/2抑制劑 PD98059（20nmol/mL）培養(yǎng) A549細(xì)胞。結(jié)果顯示 , 加入 ERK1/2抑制劑 PD98059（20nmol/mL）后 VEGF的 mRNA和蛋白表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)明顯下調(diào), 但是 VEGF-C的表達(dá)基本保持不變。 2、阻斷 PRL-3、ERK1/2能抑制肺腺癌 A549細(xì)胞遷移和侵襲能力。 細(xì)胞遷移能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 , 加入 PRL-3 抗體組肺腺癌 A549 細(xì)胞的細(xì)胞穿透數(shù)目 （ 17.67 

9、7;2.46 ）, 與未加入 PRL-3 抗體組（ 37.465 ±5.32 ）相比明顯減少 , 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ t=4.236,P<0.001 ） ; 加入 ERK1/2 抑制劑 PD98059組肺腺癌 A549 細(xì)胞的細(xì)胞穿透數(shù)目（ 20.54 ± 3.77 ） , 與對(duì)照培養(yǎng)組相比 , 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ t=3.996,P<0.001 ）?；|(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 加入 PRL-3抗體組肺腺癌 A549細(xì)胞的細(xì)胞穿透數(shù)目（8.546 ±1.64 ）, 與對(duì)照培養(yǎng)組（ 27±3.325 ）相比明顯減少 , 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ t=7.295,P<0.001）; 加入 ERK1/2抑制劑 PD98059組肺腺癌 A549 細(xì)胞的細(xì)胞穿透數(shù)目（ 13.875 ± 2.9 ）, 與對(duì)照培養(yǎng)組相比明顯減少, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ t=4.52,P<0.001）。3、阻斷 PRL-3 對(duì)肺腺癌 A549 細(xì)胞增殖和凋亡無(wú)明顯影響。MTT法測(cè)定結(jié)果顯示 , 用 PRL-3 抗體培養(yǎng)的肺腺癌A549 細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比無(wú)明顯差異（ P>0.05 ）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期結(jié)果顯示, 用 PRL-3 抗體培養(yǎng)的肺腺癌A549細(xì)胞與對(duì)照