SEC5蛋白與InsP_3R相互作用調(diào)控抗白念珠菌固有免疫

1、SEC5蛋白與 InsP_3R 相互作用調(diào)控抗白念珠菌固有免疫白念珠菌作為條件致病菌寄生在健康人體的口腔和小腸粘膜中, 當(dāng)機(jī)體免疫力低下時(shí) , 其可侵入機(jī)體引發(fā)系統(tǒng)性感染。系統(tǒng)性白念珠菌感染是最常見的院內(nèi)真菌感染 , 包括念珠菌血癥和深部組織感染。系統(tǒng)性白念珠菌感染患者死亡率較高, 即使接受藥物治療 , 死亡率仍可高達(dá)40%。因此 , 在治療過程中 , 改善患者的機(jī)體免疫力被認(rèn)為是增強(qiáng)治療效果的理想手段。入侵機(jī)體后 , 白念珠菌表面的病原相關(guān)分子模式被免疫細(xì)胞中表達(dá)的模式識(shí)別受體識(shí)別后激起機(jī)體的免疫反應(yīng)。目前研究已發(fā)現(xiàn)多種識(shí)別白念珠菌的模式識(shí)別受體 , 如 Toll樣受體 ,C 型凝集素受體等

2、。白念珠菌表面的 葡聚糖和甘露糖能夠分別結(jié)合C 型凝集素受體 Dectin-1和 Dectin-2, 激活磷脂酶 C （PLC） , 產(chǎn)生（ 1,4,5 ） - 三磷酸肌醇（ inositol1,4,5-trisphosphate,InsP₃）。InsP₃ 結(jié)合 InsP3R（ InsP₃R）引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子的釋放 , 使胞內(nèi)鈣離子濃度升高。細(xì)胞內(nèi)鈣離子調(diào)控多種細(xì)胞免疫功能 , 如活性氧的產(chǎn)生 , 細(xì)胞因子分泌和吞噬等。本課題從酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)篩選到SEC5

3、蛋白能夠結(jié)合 InsP₃R的碳末端出發(fā) , 對 SEC5與 InsP₃R 的相互作用及其對抗白念珠菌固有免疫的影響進(jìn)行了研究。第一部分 ,SEC5與 InsP₃R 相互作用。首先通過GST pull down實(shí)驗(yàn)和 CO-IP 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的篩選結(jié)果, 從蛋白水平證明SEC5與InsP₃R 結(jié)合。免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SEC5與 InsP₃R 主要分布在細(xì)

4、胞質(zhì)中 ,并在細(xì)胞核周圍與InsP₃R 共定位明顯。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（ Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET）實(shí)驗(yàn)證明 SEC5與InsP₃R 共定位區(qū)域的空間距離小于10nm,提示 SEC5與 InsP3R 在細(xì)胞內(nèi)直接相互結(jié)合。為進(jìn)一步驗(yàn)證我們的假設(shè), 我們對 SEC5與 InsP₃R 相互作用的區(qū)域進(jìn)行了深入探索。 InsP₃R 的 C末端含有 4 個(gè) 螺旋

5、結(jié)構(gòu)域（ H1-H4）,分別構(gòu)建 GST-H1/H2/H3/H4融合表達(dá)質(zhì)粒 , 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 , 表達(dá)純化獲得GST-H1/H2/H3/H4融合蛋白 beads, 并與 RAW264.7細(xì)胞裂解液進(jìn)行GSTpulldown實(shí)驗(yàn) , 結(jié)果發(fā)現(xiàn) H1 片段能夠結(jié)合裂解液中的SEC5蛋白。為研究 SEC5與 InsP₃R-H1 的結(jié)合區(qū)域 , 將 SEC5蛋白分為 4 段（ SEC5-1/2/3/4 ）, 融合 His 標(biāo)簽在大腸桿菌中表達(dá)。用純化得到的GST-InsP₃R-H1beads與表達(dá)有 SEC5

6、-1^SEC5-4蛋白片段的大腸桿菌裂解液進(jìn)行pull down實(shí)驗(yàn) , 結(jié)果發(fā)現(xiàn) SEC5-2段和 SEC5-4段能夠結(jié)合 InsP₃R-H1。綜合本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SEC5作為一個(gè)新的 InsP₃R 相互作用蛋白 , 直接結(jié)合于 InsP₃R 的碳末端。第二部分 ,SEC5-InsP₃R 相互作用調(diào)控 InsP₃R 離

7、子通道活性。首先利用鈣離子成像實(shí)驗(yàn)檢測 SEC5-InsP₃R相互作用對細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化的影響 , 結(jié)果發(fā)現(xiàn) , 在 HEK293細(xì)胞中 ,SEC5過表達(dá)能夠促進(jìn)卡巴膽堿激活 InsP₃R 引起的胞內(nèi)鈣離子濃度的升高, 而下調(diào) SEC5的表達(dá)能夠抑制卡巴膽堿激活I(lǐng)nsP₃R 引起的胞內(nèi)鈣離子的升高。InsP₃R 特異性的抑制劑Araguspongin B（ARB）能夠抑制 SEC5對卡巴膽堿激活 InsP&l

8、t;sub>3</sub>R 引起的胞內(nèi)鈣離子的升高的促進(jìn)作用。為了驗(yàn)證 SEC5與 InsP₃R 的相互作用對 InsP₃R 介導(dǎo)的鈣離子釋放的影響 , 我們設(shè)計(jì)并合成了能夠透過細(xì)胞膜, 并具有干擾 SEC5與InsP₃R 的相互結(jié)合作用的干擾多肽H1-TAT及其對照多肽 H1S-TAT。利用 CO-IP 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證后 , 證明 HI-TAT 能夠抑制 SEC5與 InsP₃R的結(jié)合。利用鈣

9、離子成像實(shí)驗(yàn)檢測經(jīng)H1-TAT及對照多肽 H1S-TAT處理的細(xì)胞 , 發(fā)現(xiàn)H1-TAT能夠抑制對照細(xì)胞和SEC5過表達(dá)細(xì)胞中卡巴膽堿引起的胞內(nèi)鈣離子的升高 , 進(jìn)一步證明 SEC5與 InsP₃R 的相互作用影響 InsP₃R介導(dǎo)的鈣離子釋放。為考察SEC5是否直接影響 InsP₃R 的離子通道活性 , 利用體外表達(dá)純化的SEC5-2多肽片段進(jìn)行膜片鉗電生理實(shí)驗(yàn), 檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn) , 在相同的 InsP₃ 濃度刺

10、激條件下 ,SEC5-2 多肽能夠增強(qiáng)InsP₃R 的活性。綜合本部分研究結(jié)果 , 說明 SEC5與 InsP₃R 相互作用 , 能夠直接調(diào)控 InsP₃R 離子通道的活性 , 并影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子的升高。第三部分 ,SEC5蛋白與 InsP₃R 相互作用影響小鼠巨噬細(xì)胞對白念珠菌的吞噬。首先通過鈣離子成像實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) BMDM細(xì)胞吞噬白念珠菌起始階段細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度瞬時(shí)升高。而用細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM和

11、InsP₃R 特異性抑制劑 ARB預(yù)處理 , 能夠抑制 BMDM對白念珠菌的吞噬作用 , 說明InsP₃R 介導(dǎo)的胞內(nèi)鈣離子的釋放影響巨噬細(xì)胞的吞噬作用。為考察 SEC5在 BMDM吞噬白念珠菌中的功能 , 利用轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒或siRNA的方法改變細(xì)胞中SEC5蛋白的表達(dá)水平 , 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在 BMDM細(xì)胞中過表達(dá) SEC5能夠顯著促進(jìn) BMDM對白念珠菌的吞噬作用, 相反 , 下調(diào) SEC5表達(dá)能夠抑制 BMDM的吞噬功能。免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SEC5與 InsP<sub>3</sub&g

12、t;R 在吞噬小體上有明顯共定位 ; 同時(shí) ,CO-IP 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明白念珠菌刺激能夠促進(jìn)SEC5與InsP₃R 的結(jié)合。用 H1-TAT多肽干擾 SEC5與 InsP₃R 的相互作用 , 能夠顯著抑制BMDM細(xì)胞的吞噬作用。 上述研究結(jié)果說明SEC5與 InsP₃R 的相互作用影響 BMDM細(xì)胞對白念珠菌的吞噬作用。第四部分 ,SEC5與 InsP₃R 相互作用調(diào)控 TBK1-IRF3通路介導(dǎo)的抗白念珠菌天然免

13、疫反應(yīng)。 首先利用白念珠菌刺激BMDM細(xì)胞 , 并用 western blot實(shí)驗(yàn)檢測 TBK1的磷酸化激活水平及轉(zhuǎn)錄因子IRF3 的入核情況 , 發(fā)現(xiàn)白念珠菌刺激能夠激活 TBK1-IRF3 通路 , 而下調(diào) SEC5蛋白表達(dá)能夠抑制該通路的激活。GSTpulldown實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) InsP₃R 能夠與 SEC5,TBK1形成復(fù)合體 ,并且白念珠菌刺激促進(jìn)該復(fù)合體的形成。進(jìn)一步的機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)在SEC5蛋白分子內(nèi) ,SEC5-2 片段和 SEC5-rbd 結(jié)構(gòu)域結(jié)合 , 阻礙 SEC5-rbd 與 TBK1的結(jié)合 , 對SEC5-rbd 結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生自我抑制。InsP₃R 的 H1段與 SEC5-rbd 競爭性結(jié)合 SEC5-2區(qū)域。InsP₃R 的 H1段結(jié)合 SEC5時(shí)能夠?qū)?SEC5-rbd 結(jié)構(gòu)域從 SEC5-2區(qū)域中解離 , 促進(jìn) SEC5-rbd 與 TBK1的結(jié)合 , 導(dǎo)致 TBK1的激活。綜上四部分實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果, 我們發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了SEC5為一個(gè)未經(jīng)報(bào)道的InsP₃R 相互作用蛋白 , 并且能夠調(diào)控InsP<sub&g