影響凝膠色譜的分離的因素及其改進(jìn)方法

1、影響凝膠色譜的分離的因素及其改進(jìn)方法吳承志張宇封樹(shù)林孫振鵬( 西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶， 400716)摘要：凝膠色譜技術(shù)是六十年代初發(fā)展起來(lái)的一種快速而乂簡(jiǎn)單的分離分析技術(shù)，由于設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對(duì)高分子物質(zhì)有很高的分離效果。凝膠色譜法乂稱分子排阻色譜法。凝膠色譜主要用于高聚物的相對(duì)分子質(zhì)量 分級(jí)分析以及 相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)試。目前已經(jīng)被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工 程學(xué)、分子免疫學(xué) 以及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛采用，不但應(yīng)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，而 且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè) 生產(chǎn)。關(guān)鍵詞：凝膠色譜；影響因素；填料；改進(jìn)方法Influence factors of the separatio

2、n gel chromatography and improving methodsWu chengzhi Zhang ning Fengshuling Sun zhenpeng(College of Pharmaceutical Sciences, SouthwestUniversity, Chongqing 400716)Abstract ： Gel chromatography was developed in the early sixties a quick and simple separation techniques, because the equipment is simp

3、le, easy to operate, does not require organic solvents, the polymer material has a high separation efficiency ? Also known as gel permeation chromatography molecular exclusion chromatography. GPC is mainly used for classification of polymer molecular weight and molecular weight distribution of the t

4、est? Hasnow been biochemistry, molecular biology, biological engineering, medicine, molecular immunology and related fields widely used, not only used inscientific experimental research, and has a large scale for industrial production.Keywords: gel chromatography; Influencing factors: Packing; Impro

5、vement methods凝膠色譜法乂叫凝膠色譜技術(shù)，是六十年代初發(fā)展起來(lái)的一種快速而乂簡(jiǎn)單 的分 離分析技術(shù)，山于設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對(duì)高分子物質(zhì)有很 高的分離 效果。凝膠色譜法乂稱分子排阻色譜法。凝膠色譜法主要用于高聚物的相 對(duì)分子質(zhì)量分 級(jí)分析以及相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)試。凝膠的代表是葡萄糖系列，洗脫 溶劑主要是水。用 于有機(jī)溶劑中可溶的高聚物（聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚 中基丙烯酸屮酯等）相 對(duì)分子質(zhì)量分布分析及分離，常用的凝膠為交聯(lián)聚苯乙烯凝 膠，洗脫溶劑為四氫咲喃等 有機(jī)溶劑。 凝膠色譜不但可以用于分離測(cè)定高聚物的相 對(duì)分子質(zhì)量和相對(duì)分子質(zhì)量分布， 同時(shí)根據(jù)所用凝

6、膠填料不同，可分離油溶性和水 溶性物質(zhì)，分離相對(duì)分子質(zhì)量的范圍從 兒白萬(wàn)到 100 以下。近年來(lái)，凝膠色譜也廣 泛用于分離小分子化合物?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)不同但 相對(duì)分子質(zhì)量相近的物質(zhì)，不可能通過(guò) 凝膠色譜法達(dá)到完全的分離純化的 U 的。凝膠色 譜主要用于高聚物的相對(duì)分子質(zhì)量 分級(jí)分析以及相對(duì)勿子質(zhì)量分布測(cè)試。目前已經(jīng)被生 物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工 程學(xué)、分子免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛采用，不但應(yīng) 用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，而且 已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。1 凝膠色譜的分離效果的因素主要影響的因素有色譜柱填料的孔徑大小及其粒徑分布均勻性， 其次是流動(dòng) 相、色 譜柱高度、色譜柱的直徑以及個(gè)人操作等。1.1 首

7、先，填料的孔徑大小一定要合適， 孔徑太小， 待測(cè)物不易流出， 分析 時(shí)間長(zhǎng)， 展寬嚴(yán)重；孔徑太大則很可能導(dǎo)致組分分不開(kāi)。在做凝膠色譜時(shí)，需要先 大致估計(jì)下待 分析物的分子量，然后選擇合適的柱子，如果不知道粒徑，可先用大 孔徑的先試試，接 著再用小粒徑的以達(dá)到更高的精度。市售的柱子上都有該柱適用 的分子量范圍，一般選 待測(cè)物分子量在色譜柱的最大分子量的 20%-80%為宜。凝膠的顆粒粗細(xì)與分離效果有直接關(guān)系。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)顆粒分離效果好，但 流速 慢；而粗顆粒流速快，但會(huì)使區(qū)帶擴(kuò)散，使洗脫峰變平而寬。因此，如用細(xì)顆 粒凝膠宜 用大直徑的層析柱，用粗顆粒時(shí)用小直徑的層析柱。在實(shí)際操作中，要根 據(jù)工作

8、需要， 選擇適當(dāng)?shù)念w粒大小并調(diào)整流速。1.2 其次是流動(dòng)相。凝膠色譜中流動(dòng)相的影響不像別的色譜（如反相 or 離子 色 譜）那么明顯。其中主要影響的是流動(dòng)相的流速，一般流速越大，出峰越快，但 分離效 果可能不是很好。1.3 其次是色譜柱的高度和直徑。一般來(lái)說(shuō)，色譜柱越長(zhǎng)，樣品組分分的越 開(kāi)， 但過(guò)長(zhǎng)時(shí)會(huì)消耗太多的溶劑，而且柱展寬等也容易變的嚴(yán)重。色譜柱直徑太大 時(shí)，樣品 沿徑向的分布容易不均勻，容易出現(xiàn)柱中心處比柱四周跑的快，從而增加 了展寬。1.4 個(gè)人操作。這點(diǎn)在全手動(dòng)操作的柱色譜中影響較大，對(duì)半自動(dòng)的則影響較小。主要要注意加樣時(shí)一定注意保證樣品各組分在同一個(gè)“起跑線”上“起跑” .而凝膠

9、色譜中的凝膠采用合成葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠等有機(jī)凝膠，這些有機(jī)凝膠的膠質(zhì)軟，機(jī)械強(qiáng)度低，填料的粒度一般用 37-75 Po 色譜柱長(zhǎng) 12 尺以上，柱徑 7. 8 毫米，流速通常用 1 毫升/分。在這些條件下，一次 實(shí)驗(yàn)時(shí)間往往需 要三小時(shí)。加快流速會(huì)降低分離效率，因?yàn)槟z色譜是一個(gè)山擴(kuò)散 控制的分離過(guò)程，高 分子在溶液中擴(kuò)散較慢，這就必然使流速受到一定限制。最終 導(dǎo)致凝膠色譜的處理量 小，時(shí)間長(zhǎng)，分離效果不佳；分子尺寸相同的混合物（如異 構(gòu)體的混合物）不易分開(kāi)2 改進(jìn)方法最近凝膠色譜的大量研究匚作仍是多方面的，其中儀器、填料、檢測(cè)方法的研究、以及色譜理論等方面的進(jìn)展是和整個(gè)液

10、體色譜的進(jìn)展相關(guān)的。2. 1填料填料的粒度主要影響填充柱的兩個(gè)參數(shù)，即柱效和背壓。粒度越小，柱壓越大，柱壓的增加限制了粒度小于 3um的填料應(yīng)用。在相同選擇性條件下，提高柱效 可提高 分離度，但不是唯一的因素。凝膠色譜填料合成技術(shù)的進(jìn)展主要在下面四個(gè)方面：填料的微球化、窄粒度分布多孔硅微球的合成成功、小孔徑多孔硅微球合成成功以及新的硅微球表面化學(xué)改性的發(fā)展。這些新發(fā)展的無(wú)機(jī)凝膠填料機(jī)械強(qiáng)度高，粒徑小，可達(dá)到較高的柱效，孔容大，分離范圍廣，使用壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，下面是一些填料的介紹：硅膠基質(zhì)填料以硅膠為基質(zhì)的高效親水凝膠色譜填料，多以甘油瞇基（即二醇基）進(jìn)行硅膠的表面修飾，氨基、咪醴基、尿素及取代尿

11、素等也可作為其親水基團(tuán)。為提高其表面的親水性和生物相容性，將葡聚糖接枝在硅膠表面，以分離蛋白質(zhì)；但使用最廣泛的仍然是二醇基，這與二醇基填料合成簡(jiǎn)單且生物相容性好等特點(diǎn)不無(wú)關(guān)系。以硅膠為基質(zhì)的色譜填料因表面游離的硅羥基具有弱陽(yáng)離子交換作用，對(duì)極性化合物和離子型化合物都有一定的非特異性吸附，所以不能直接用作多肽和蛋口質(zhì)分離分析用的凝膠過(guò)濾色譜填料，需要鍵合親水官能團(tuán)才能成為親水性凝膠過(guò)濾色譜填料。在親水凝膠色譜中，多選用硅烷化試劑作為配基進(jìn)行修飾， 以產(chǎn)生親水性的二 醇基，其反應(yīng)如下：O0、S YX 4 (CH.O)CK；1 .-O-CBj- CH-CH, ? -S-O-SKCa.Oj-CCB,O

12、-CBj-Ca-CStV / H-CHj ? H ； 0 -SI O-SI(CH k0-CH,),-O-CMj-CH-CM,OH 6H且該填料也在相關(guān)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)：其分離度要比一些有機(jī)凝膠要好，而且該填料也表現(xiàn)出很好的機(jī)械強(qiáng)度，穩(wěn)定性和保持著很好的抗壓能力，相比時(shí)間上也縮短了不少。2. 2 檢測(cè)方法的研究檢測(cè)方法也是色譜學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，人們不斷更新 檢測(cè)器的靈敏度，使色譜分析能夠更靈敏地進(jìn)行分 析。人們還將其他光譜的技術(shù)引入色譜，如進(jìn)行色譜 質(zhì)譜連用、色譜一紅外光譜連用、色譜一紫外連用 等，在分離化合物的同時(shí)即行測(cè)定化合物的結(jié)構(gòu)。色 譜檢測(cè)器的發(fā)展還伴隨著數(shù)據(jù)處理技術(shù)的發(fā)展，檢測(cè) 獲得的數(shù)據(jù)隨

13、即進(jìn)行計(jì)算處理，使試驗(yàn)者獲得更多信 息。如今又很多應(yīng)用了，例如凝膠色譜凈化濃縮聯(lián)用 儀在毒物分析中的應(yīng)用；利用凝膠滲透色譜 - 激光光散 射聯(lián)用技術(shù) (GPC-MALLS) 測(cè)定醫(yī)用高分子材料的分子量 及分子量的分布；凝膠色譜與紫外吸收分析儀聯(lián)用技 術(shù)分離青霉素 G 中抗原性高分子雜質(zhì)等等，相信凝膠 色譜聯(lián)用技術(shù)會(huì)越來(lái)越廣泛的得到應(yīng)用。2. 3 儀器通過(guò)與其他儀器聯(lián)用，解決凝膠色譜法測(cè)定高聚物分子量分布從相對(duì)法向絕 對(duì)法 過(guò)渡。測(cè)定高聚物分子量分布是凝膠色譜最重要的應(yīng)用。試樣先根據(jù)分子體積( 即分子量) 分離后再檢測(cè)各組分的分子量及含量。在凝膠色譜中試樣的分離是在色 譜柱中進(jìn)行 的，被分離后的

14、組分在流出柱子時(shí)就同時(shí)連續(xù)地用濃度檢測(cè)器和分子量 檢測(cè)器分別檢側(cè) 各組分的濃度和分子量，把兩個(gè)檢測(cè)器的輸出訊號(hào)用記錄儀記錄后 即得反映分子量分布 的凝膠色譜曲線。過(guò)去山于沒(méi)有比較靈敬和瞬時(shí)響應(yīng)的分子量 檢測(cè)器，因而利用一組不 同分子量的標(biāo)樣來(lái)標(biāo)定色譜柱，然后從分子量淋出休積的 標(biāo)定曲線來(lái)作數(shù)據(jù)換算。這種 用相對(duì)方法來(lái)檢測(cè)分子量雖然暫時(shí)解決了問(wèn)題，但是 隨之而來(lái)的是實(shí)驗(yàn)丄作量增加以及 數(shù)據(jù)處理方法上存在困難。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性在 很大程度上決定于標(biāo)定曲線、標(biāo)樣分子 量數(shù)值以及數(shù)據(jù)處理方法的可靠性。其中色 譜柱分離效率不理想所引起的色譜峰加寬效應(yīng)的改正，不但實(shí)驗(yàn)方法比較煩瑣，而 且數(shù)據(jù)處理也比較復(fù)雜

15、，需要用電子計(jì)算機(jī)來(lái)計(jì) 算。所以雖然文獻(xiàn)中已經(jīng)推薦許多 據(jù)說(shuō)是比較滿意的計(jì)算方法，但這總不是一個(gè)根本解 決的方法。只有真正找到絕對(duì) 分子量檢測(cè)器，問(wèn)題才算較好解決。原有的許多分子量測(cè) 定方法，山于不能做到足 夠靈敬的瞬時(shí)響應(yīng)而未能成功地在凝膠色譜上應(yīng)用。最近Ouano用激光小角光散射儀（LALLS）來(lái)作分子量檢測(cè)器得到比較好的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不需要標(biāo)定曲線，也不必進(jìn)行峰加寬改正。山于激光的準(zhǔn)直性較好，強(qiáng)度較大，可以允許在較小的角度下測(cè)量較稀溶液的散射光強(qiáng)，山此可以直接訃算出重均分子量的近似值而不需要象經(jīng)典光散射那樣實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還要對(duì)濃度和散射角度向零作雙外推。 實(shí)驗(yàn)上，凝膠色譜儀和激光小角光 散射儀

16、聯(lián)用后， 還可與計(jì)算機(jī)直接聯(lián)接進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。在一次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行完畢后，所 需要的數(shù)據(jù)可全部立 即取得。GPC-LALLS以乎得到更合理的數(shù)值。激光小角散射儀 已開(kāi)始商品化，預(yù)計(jì)不久 將會(huì)有更多的研究工作，來(lái)說(shuō)明已經(jīng)在何種程度上解決了 凝膠色譜的相對(duì)測(cè)定過(guò)渡到絕 對(duì)測(cè)定。凝膠色譜中的濃度檢測(cè)器和通常的液體色譜 一樣仍然是一個(gè)薄弱環(huán)節(jié)，繼續(xù)在 尋找更理想的檢測(cè)器。 LI 前最常用的仍然是示差 折光檢測(cè)器和紫外檢測(cè)器。最近 Hoffmann 和 Urban 用自動(dòng)濁度滴定裝置來(lái)作濃度檢測(cè)器也收到一定效 果， 特別對(duì)二元共聚中測(cè)定分子量分布和組成分布，效果比較顯著。 Jorgenson 等 用光散射 法側(cè)定淋出溶質(zhì)的沉淀，也證明是一個(gè)較靈敬的方法。 Francois 等用密 度計(jì)來(lái)檢側(cè)濃 度，提供了另一條通用性檢測(cè)器的途徑。其他如質(zhì)譜和原子吸收光譜 也都能與凝膠色 譜聯(lián)用。隨著應(yīng)用的擴(kuò)大，凝膠色譜可以用于測(cè)定高聚物長(zhǎng)支鏈的 支化度。2.4 在色譜理論上的改進(jìn)2. 4. 1 塔板理論保留時(shí)間是樣品從進(jìn)入色