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文檔簡(jiǎn)介
1、.轉(zhuǎn)染細(xì)胞的穩(wěn)定篩選1、藥物篩選前的準(zhǔn)備藥篩前應(yīng)確定藥物篩選濃度,不同細(xì)胞系具有不同的藥物敏感度,因此在篩選前應(yīng)該用在藥物濃度范圍內(nèi)設(shè)定濃度梯度來(lái)確定篩選穩(wěn)定克隆的藥物濃度。藥物濃度一般確定為能使未轉(zhuǎn)染細(xì)胞在7天之內(nèi)全部死亡,如G418一般需要7天,而puro一般時(shí)間很短,只需要3-4天即可。2、藥物篩選注意事項(xiàng)(1)藥篩的時(shí)間加藥時(shí)間一般為轉(zhuǎn)染后48h。但由于慢病毒表達(dá)較慢,因此利用慢病毒感染將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞的方法,加藥時(shí)間一般為72h空白對(duì)照加藥篩選時(shí),最好設(shè)置空白對(duì)照,即未轉(zhuǎn)染細(xì)胞同時(shí)加藥,待空白對(duì)照中細(xì)胞全部死亡,轉(zhuǎn)染組中不具有抗藥性的細(xì)胞基本藥殺完,但還需繼續(xù)加藥。(2)換液如果加藥后
2、,細(xì)胞死亡較多,需及時(shí)換液,以防死細(xì)胞釋放有害物質(zhì)導(dǎo)致具有抗藥性的細(xì)胞死亡。另外,隨著細(xì)胞的代謝,抗生素的活性會(huì)降低,因此,每隔3-5天應(yīng)更換一次抗生素篩選培養(yǎng)液。3、克隆篩選注意事項(xiàng) 若轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒帶有熒光標(biāo)記,不管是以下哪種篩選克隆的方法,都應(yīng)該選擇帶有熒光較強(qiáng)的細(xì)胞克隆,因?yàn)榧铀幒Y選時(shí),可能會(huì)產(chǎn)生耐藥性的細(xì)胞,因此最好選擇帶有熒光較強(qiáng)的細(xì)胞。若是轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒不帶有熒光,那么只能盲挑。不管是帶有或者不帶有熒光標(biāo)記,都應(yīng)該挑出克隆后進(jìn)行驗(yàn)證,驗(yàn)證存在不成功的概率。因此,挑克隆時(shí),應(yīng)盡量多挑幾個(gè)克隆,20個(gè)左右。精品.4、穩(wěn)定克隆篩選步驟(1)有限稀釋法步驟a) 將藥篩后的細(xì)胞(一般長(zhǎng)滿六孔板即可
3、,若細(xì)胞生長(zhǎng)很快藥篩時(shí)可以在10cm的dish中進(jìn)行)用胰酶消化下來(lái)b) 對(duì)消化后的細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)(如果細(xì)胞數(shù)量過(guò)大,可先稀釋后計(jì)數(shù))c) 計(jì)算后,用槍頭吸取約200個(gè)細(xì)胞(其中有部分為死細(xì)胞)到10ml培養(yǎng)液中充分混勻,剩下的大部分細(xì)胞凍存保種d) 然后將以上10ml細(xì)胞懸液加到96孔板中,每孔100ul,這樣有的孔就可能只有一個(gè)細(xì)胞,過(guò)程中注意不時(shí)用槍頭吹打混勻細(xì)胞懸液(一個(gè)96孔板得到的克隆可能較少,可以用同樣的方法做2-3個(gè)96孔板)e) 待細(xì)胞貼壁后,逐孔在顯微鏡下觀察,沒(méi)有細(xì)胞或者多余一個(gè)細(xì)胞的孔劃叉,只有一個(gè)細(xì)胞的孔劃勾,以做好標(biāo)記,如果只有一個(gè)細(xì)胞的孔數(shù)量太少,可將一個(gè)孔內(nèi)有
4、兩個(gè)細(xì)胞的孔也劃勾,但這樣克隆就可能不純。f) 等細(xì)胞長(zhǎng)起來(lái)以后,從96孔板到24孔板,再到6孔板逐漸擴(kuò)大培養(yǎng)g) 細(xì)胞分6孔板中養(yǎng)起來(lái)后,可分出部分細(xì)胞提蛋白,用western驗(yàn)證克隆是否為我們所需要的克隆,也可以用RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證,若驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)克隆并不是所需要的克隆,即失敗的克隆,就扔掉,保留驗(yàn)證成功的克隆并大量培養(yǎng)h) 首次驗(yàn)證成功的克隆養(yǎng)兩周后再次驗(yàn)證,若仍能保持特性,表示篩出的克隆較穩(wěn)定,這樣較為穩(wěn)定克隆即可大量培養(yǎng)保種,并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)精品.(2)無(wú)限稀釋法a) 將藥篩后的細(xì)胞(一般長(zhǎng)滿六孔板即可)用胰酶消化下來(lái)b) 對(duì)消化后的細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)(如果細(xì)胞數(shù)量過(guò)大,可先稀釋后計(jì)數(shù))c
5、) 計(jì)算后,吸出約5000個(gè)細(xì)胞,鋪到10cm的dish中,搖勻d) 待細(xì)胞貼壁后,在顯微鏡下找到單個(gè)細(xì)胞,用馬克筆在dish的底部做好標(biāo)記,然后放到孵箱里培養(yǎng)e) 待單個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)成了細(xì)胞團(tuán)(約10個(gè)),在顯微鏡下觀察,如果有兩個(gè)細(xì)胞團(tuán)靠得很近,則用馬克筆在底部做好標(biāo)記,然后在安全柜內(nèi)用白槍頭刮掉周圍舍棄的細(xì)胞團(tuán),并不斷在顯微鏡下觀察,看周圍的細(xì)胞是否已經(jīng)都被刮掉。然后換培養(yǎng)液(將刮掉的細(xì)胞棄去)f) 放到孵箱里培養(yǎng)數(shù)天(細(xì)胞團(tuán)較大,約一兩百個(gè)),克隆在肉眼下可見(jiàn)g) 將培養(yǎng)液倒掉,用PBS洗兩遍,再吸10ul的胰酶在標(biāo)記好細(xì)胞團(tuán)的地方不停的快速吹打約1-2min,最后將槍頭里細(xì)胞懸液打到24孔板內(nèi)培養(yǎng)即為挑出的一個(gè)克隆,此過(guò)程切記不能過(guò)長(zhǎng),以免dish太干導(dǎo)致細(xì)胞死亡h) 照7的方法每種細(xì)胞至少挑出15個(gè)克隆,培養(yǎng)一段時(shí)間后,消化到六孔板中培養(yǎng)(處理時(shí)間根據(jù)24孔板內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量而定)i) 細(xì)胞分6孔板中養(yǎng)起來(lái)后,可分出部分細(xì)胞提蛋白,用western驗(yàn)證克隆是否為我們所需要的克隆,也可以用RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證,若驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)克隆并不是所需要的克隆,即失敗的克隆,就扔掉,保留驗(yàn)證成功的克隆并大量培養(yǎng)j) 首次驗(yàn)
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