AFLP試驗方法

1、模塊八分子標記技術SSR技術1 .實驗目的利用現(xiàn)代分子生物學技術揭示DNA序列的遺傳多態(tài)性即建立DNA水平上的遺傳標記。為分子遺傳圖譜的構建、遺傳多樣性分析與種質鑒定、重要性狀基因定位與圖位克隆、轉基因生物鑒定、分子標記輔助育種等研究奠定實驗技能基礎。通過此實驗了解和掌握利用SSR和AFLP分子標記檢測日!物基因組DNA的遺傳多態(tài)性的基本原理和實驗方法。2 .實驗原理SSR:根據(jù)SSR兩端保守的單拷貝序列設計一對特異引物，通過PCR技術將其間的核心微衛(wèi)星DNA序列擴增出來，利用電泳分析技術就可獲得其長度多態(tài)性。每個SSR座位兩側一般是相對保守的單拷貝序列，擴增每個位點的微衛(wèi)星DNA序列，再經聚

2、丙烯酰胺凝膠電泳，比較擴增帶的帶型，就可檢測到不同個體在某個SSR座位上的多態(tài)性。3 .實驗儀器離心機、移液器(100-1000ul,10-50U1)、PCR儀、垂直板電泳設備。4 .實驗試劑MgC12,引物，dNTP,10XPCR緩沖?夜,DNA聚合酶，無菌去離子水。5 .實驗方法(1)將200山離心管、模板DNA、引物、dNTP、10Xbuffer、無菌去離子水和DNA聚合酶置于冰上溶解。(2)依次向無菌的200山離心管中加入如下成份，輕輕混勻，離心去除氣泡。模板DNA20-60ngMgCl215-40nmol引物(各)2-8pmoldNTP1-5nmolPCR緩沖液1XDNA聚合酶1-5

3、UTotal20L(3)將離心管置于PCR儀中，按照以下程序進行PCR反應。94C2min94C50sec150-65C30sec>35循環(huán)72C90secj72C7min4Coo(4)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳：利用聚丙烯酰胺凝膠檢測SSR-PCR結果。SSR-PCR擴增產物可能僅僅存在幾個堿基的差異，通常采用聚丙烯酰胺凝膠(銀染體系)電泳方法檢測。相對于瓊脂糖凝膠電泳而言，聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠更好的區(qū)分微小片斷的差異，能夠檢出的等位基因位點多，多態(tài)性信息含量值較高，因此適用于SSR標記的結果檢測。兩種銀染檢測體系是在聚丙烯酰胺凝膠電泳結束后，用固定劑將核酸固定到凝膠上，使銀染劑中的銀離

4、子與核酸牢固結合，再通過還原劑將銀離子還原而發(fā)生顯色反應。6 .實驗結果SSR-PCR聚丙烯酰胺凝膠電泳結果7 .注意事項由于SSR技術是基于PCR的一種分子標記，所以模板DNA、DNA聚合酶、dNTP以及Mg2+的濃度等因素會影響SSR的結果。如果參與反應的某些因子條件不適合，則會導致圖譜彌散狀背景的產生，擴增產物的消失以及電泳譜帶位置的改變。改進反應條件的措施主要有：(1)保證DNA模板的質量。DNA模板的質量直接影響到PCR的效果，要求模板中的蛋白質、糖及其它雜質含量低。(2)不同引物的退火溫度應根據(jù)引物的Tm略有變動。(3)設置模板DNA、DNA聚合酶、dNTP以及Mg2+的濃度梯度。

5、AFLP技術1 .實驗目的學習和掌握AFLP分子標技術的原理、操作方法和實驗注意事項，了解AFLP分子標記技術在分子輔助育種中的應用。2 .實驗原理基因組DNA用兩種限制性內切酶進行雙酶切，形成分子量大小不等的限制性酶切片段，然后把酶切片段與有共同粘性末端的人工接頭連接，連接后的粘性末端序列和接頭序列作為PCR反應引物的結合位點，通過PCR反應對酶切片段進行預擴增和選擇性擴增。由于限制性片段太多，全部擴增則產物難以在膠上分開，為此在引物的3'端加入1-3個選擇性堿基，這樣只有那些能與選擇性堿基配對的片段才能與引物結合，成為模板被擴增，從而達到對限制性片段進行選擇擴增的目的；最后通過聚丙

6、烯酰胺凝膠電泳，將這些特異性的擴增產物分離開來。3 .儀器設備離心機，培養(yǎng)箱，微量移液器，制冰機，離心機，PCR儀。4 .實驗試劑：MseI,EcoRI,10X酶切緩沖液，MseI接頭，EcoRI接頭，T4-連接酶，MseI引物，EcoRI弓I物，dNTP,10XPCR緩沖?夜,DNA聚合酶。MseI引物II,EcoRI引物II,dNTP,無菌去離子水。5 .實驗方法(1)接頭的設計AFLP接頭是雙鏈的寡核甘酸，其設計遵循隨機引物的設計原則，可采用primerpremier5.0軟件設計。人工接頭5'端去磷酸化，這樣接頭只有一端可以被連接到酶切片段的末端。AFLP接頭一般由二部分組成：

7、即核心序列和限制性內切酶識別序列。通常采用EcoRI和MseI兩個限制性內切酶進行酶切操作，設計的EcoRI接頭和MseI接頭如下表所示。EcoRI-接頭MseI-接頭5，/CTCGTAGACTGCGTACCGACGATGAGTCCTGAG5-CATCTGACGCATGGTAA5'TACTCAGGACTCT-5'AFLP接頭構成示意圖(2)引物的設計AFLP引物的設計主要由接頭的設計決定，其長度一般為16-20個堿基，AFLP引物的5'端是與接頭序列相對應的。AFLP引物的一個重要特征是所有引物起始于5-G殘基。值得注意的是，無論5'端是何種堿基，dNTP濃度過

8、低時容易產生雙鏈結構。3'端選擇性堿基一般不超過3個*6,當引物帶有1-2個選擇性堿基時，引物的選擇較好；當選擇性堿基增加到3個時，引物的選擇特異性仍可接受；當引物的選擇性堿基增加到4個時，引物與模板的錯配率增加，擴增特異性下降，會出現(xiàn)原指紋圖譜中未出現(xiàn)的條帶。對于雙酶切反應而言，引物組合數(shù)共有(2n)種，n為選擇堿基的數(shù)目。引物主要由3部分組成即5'端核心序列、酶切位點序列、3'端選擇性延伸序列(以EcoRI弓I物和MseI引物為例，下同)。AFLP接頭構成引物名稱5'端核心序列酶切位點序列選擇性延伸序列EcoRI引物5-GACTGCGTACCAATTCNNN

9、-3MseI引物5-GATGAGTCCTGAGiTAANNN-3(3)基因組DNA酶切為了便于靈活的調節(jié)擴增片段的大小，一般采用兩種限制性內切酶消化基因組DNA。一種是切點少的內切酶，如具有6堿基識別位點的EcoRI,它產生較大的DNA片段；一種是切點多的內切酶，如具有4堿基識別位點的MseI,它產生較小的DNA片段。由EcoRI和MseI酶切產生三種基因組片斷，MseI-MseI片段，EcoRI-EcoRI片段，EcoRI-MseI,其中EcoRI-MseI為主要酶切產物。將200I離心管、模板DNA、MseI、EcoRI、10buffer、無菌去離子水置于冰上溶解。20L。輕輕混勻，離心去

10、除氣泡。組分DNA模板MseIEcoRI10XBufferMS100ng2U2U2人依次向無菌的200人離心管中加入各成份，加水至終體積為37C恒溫培養(yǎng)箱酶切2-4hr。(4)接頭的連接將MseI接頭、EcoRI接頭、T4-連接酶和無菌去離子水置于冰上溶解。依次向無菌的200山離心管中加入如下成份，加水至終體積為20山。輕輕混勻，離心去除氣泡。組分酶切液EcoRI接頭MseI接頭T4-連接酶MS10山50pmol50pmol6U37C恒溫連接16hr。(5) DNA樣品的預擴增DNA樣品預擴增是為了充分利用連接產物，同時獲得較多擴增產物，為進一步篩選擴增引物提供保障。預擴增引物在設計時選擇性堿

11、基通常為一個。 將MseI引物I、EcoRI引物I、10XPCR緩沖?夜、dNTP、DNA聚合酶和無菌去離子水置于冰上溶解。 依次向無菌的200人離心管中加入如下成份，加水至終體積為50山。輕輕混勻，離心去除氣泡。連接后樣品5人引物(各)10ngdNTP10nmolPCR緩沖液1XDNA聚合酶2.5U按照如下程序進行PCR反應。94C2-5min94C30sec56c60sec72c60sec72c7min4coo35循環(huán)瓊脂糖凝膠電泳檢測：取20I預擴增產物和5L上樣緩沖液混合后在0.8%瓊脂糖凝膠中檢測預擴增的效果，樣品用0.1XTE稀釋20倍，-20C保存。(6) DNA樣品的擴增預擴增

12、產物需稀釋到一定倍數(shù)才能進行選擇性擴增，否則會產生類似“smea的現(xiàn)象，具體的稀釋倍數(shù)視預擴增結果而定。 將10XPCR緩沖?夜、MseI引物II、EcoRI引物II、dNTP、DNA聚合酶和無菌去離子水置于冰上溶解。 依次向無菌的200人離心管中加入如下成份，加水至終體積為20山。輕輕混勻，離心去除氣泡。稀釋的預擴增產物5山引物各25ngdNTP4nmolPCR緩沖液1XDNA聚合酶1U按照如下反應條件進行PCR反應。94C2min94C65C72C30sec30sec60sec”12循環(huán)，退火溫度每循環(huán)降低0.7C94C30sec156C30sec卜23循環(huán)72C60sec變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增結果。6 .注意事項(1)基因組DNA應具有較好的純度。(2)內切酶的選擇應慎重。(3)要確定適宜的酶切時間，酶切時間太長浪費時間，酶切時間太短則PCR產物大片段較多、帶型密集、不易分辨。必須保證基因組DNA酶切完全，否則會影響最終實驗結果。(4)制作聚丙烯酰胺凝膠時，膠平板應格外清潔，否則殘留去污劑會導致銀染時產生褐色背