D值是指在一定溫度下

1、D 值是指在一定溫度下，殺滅90%微生物（或殘存率為10%）所需的滅菌時間。在一定滅菌條件下，不同微生物具有不同的D 值；同一微生物在不同滅菌條件下，D 值亦不相同。因此D 值隨微生物的種類、環(huán)境和滅菌溫度變化而異。Z 值是指滅菌時間減少到原來的1/10 所需升高的溫度或在相同滅菌時間內(nèi)，殺滅99%的微生物所需提高的溫度。F 值為在一定溫度（T）下，給定Z 值所產(chǎn)生的滅菌效果與在參比溫度（T0）下給定Z 值所產(chǎn)生的滅菌效果相同時，所相當?shù)臏缇鷷r間，以min 為單位。F 值常用于干熱滅菌。F 值的數(shù)學表達式如下：式中，t 為測量被滅菌物溫度的時間間隔，一般為0.5 1min， T 為每個時間間隔

2、t所測得被滅菌物溫度，T0 為參比溫度。F0 值為一定滅菌溫度（T）下，Z 為 10時所產(chǎn)生的滅菌效果與121， Z 值為10所產(chǎn)生的滅菌效果相同時所相當?shù)臅r間（min） 。也就是說，不管溫度如何變化，t 分鐘內(nèi)的滅菌效果相當于在121 下滅菌F0 分鐘的效果。在濕熱滅菌時，參比溫度定為121 ，以嗜熱脂肪芽孢桿菌作為微生物指示菌，該菌在121 時， Z 值為10。則：顯然，即把各溫度下滅菌效果都轉(zhuǎn)化成121 下滅菌的等效值。因此稱F0 為標準滅菌時間（min ） 。 F0 目前僅應用于熱壓滅菌。干熱滅菌法系指物品于干熱滅菌柜、隧道滅菌器等設(shè)備中、利用干熱空氣達到殺滅微生物或消除熱原物質(zhì)的方法

3、。適用于耐高溫但不宜用濕熱滅菌法滅菌的物品的滅菌，如玻璃器具、金屬制容器、纖維制品、固體試藥、液狀石蠟等均可采用本法滅菌。干熱滅菌條件一般為160 170 ×120min 以上、170 180×60min 以上或 250 × 45min以上，也可采用其它溫度和時間參數(shù)?？傊?，應保證滅菌后的產(chǎn)品其SAL 10-6 。干熱過度殺滅后產(chǎn)品的SAL 應10-12 ，此時物品一般無需進行滅菌前污染微生物的測定。250 45min 的干熱滅菌也可除去無菌產(chǎn)品包裝容器及有關(guān)生產(chǎn)灌裝用具中的熱原物質(zhì)。采用干熱滅菌時，被滅菌物品應有適當?shù)陌b和裝載方式，保證滅菌的有效性和均一性。干

4、熱滅菌法驗證與濕熱滅菌法相同，應進行熱分布試驗、熱穿透試驗、生物指示劑驗證試驗或細菌內(nèi)毒素滅活驗證試驗。以確認滅菌柜中的溫度分布符合設(shè)定的標準、確定最冷點位置、確認最冷點標準滅菌時間（ FH） 能達到設(shè)定標準并達到SAL要求。 常用的生物指示劑為枯草芽孢桿菌孢子 （Spores of Bacillus subtilis）。細菌內(nèi)毒素滅活驗證試驗是證明除熱原過程有效性的試驗。一般將不小于1000 單位的細菌內(nèi)毒素加入待去熱原的物品中，證明該去熱原工藝能使內(nèi)毒素至少下降3 個對數(shù)單位。細菌內(nèi)毒素滅活驗證試驗所用的細菌內(nèi)毒素一般為大腸桿菌內(nèi)毒素Escherichia coli endoxin）。驗證

5、時，一般采用最大裝載方式。注射劑2008新法規(guī)解析及應對方案系列培訓班注射制劑無菌保證工藝技術(shù)要求的探討注射制劑無菌保證工藝技術(shù)要求二、注射劑基本技術(shù)的要求三、無菌保證工藝研究與驗證要求四、無菌藥品生產(chǎn)關(guān)鍵工藝的法規(guī)要求（以最終濕熱滅菌藥品工藝為例）一、前言1970 年 1975 年， 美國因輸液污染所導致的并發(fā)敗血癥事件有400 多起， 這在美國國內(nèi)引起強烈的反響。FDA 從 1975 年開始進行了深入、廣泛的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)這些事件并不是出于企業(yè)違規(guī)生產(chǎn)，而是整個生產(chǎn)體系中的不穩(wěn)定因素所致。此后， FDA 于 1976 年首次將驗證列入GMP。承認在無保證系統(tǒng)中，過程控制優(yōu)于結(jié)果檢驗。30 多年

6、過去了，注射劑染菌所致的藥難事件降臨我國， “欣弗”事件使得無菌制劑的無菌保障問題成為公眾關(guān)注的焦點。 無菌檢查的局限性 研究無菌保證的途徑面臨的主要問題劑型選擇不合理無菌保證工藝選擇不合理無菌保證工藝研究不全面無菌保證工藝缺乏必要的驗證GMP 與發(fā)達國家要求還存在差距整頓和規(guī)范藥品研制、生產(chǎn)、流通秩序工作方案（國食藥監(jiān)辦2006 465 號）要求:嚴格審評審批化學藥品注射劑、中藥注射劑和多組分生化注射劑等安全性風險較大的3 類品種。二、注射劑基本技術(shù)的要求審評審批要求:1、 國家局已受理但尚未批準注冊的化學藥品注射劑和多組分生化藥注射劑應參照技術(shù)要求進行研究。2、 已經(jīng)批準注冊的化學藥品注射

7、劑和多組分生化藥注射劑也應參照技術(shù)要求進行相關(guān)研究，并在申報再注冊時提供相關(guān)研究資料。3、 對已上市化學藥品注射劑、多組分生化藥注射劑進行仿制、改變劑型或者改變給藥途徑研究時，研究者應當慎重考慮已上市品種的研究基礎(chǔ)。以化學藥品注射劑為例:一、化學藥品注射劑劑型選擇的必要性、合理性二、化學藥品注射劑規(guī)格的合理性、必要性三、化學藥品注射劑原、輔料質(zhì)量控制及來源4、 化學藥品注射劑處方及制備工藝合理性、可行性研究，特別是滅菌工藝的選擇及驗證研究、工藝穩(wěn)定性研究等五、化學藥品注射劑質(zhì)量研究及質(zhì)量標準制訂六、化學藥品注射劑穩(wěn)定性研究七、化學藥品注射劑非臨床安全性評價的技術(shù)要求八、化學藥品注射劑臨床研究技

8、術(shù)要求九、仿制化學藥品注射劑的技術(shù)要求十、化學藥品注射劑說明書和標簽內(nèi)容的技術(shù)要求本講座主要探討無菌保證工藝研究及評價包括： 制備工藝的選擇工藝參數(shù)的確定工藝的驗證注射劑滅菌工藝及其驗證三、無菌保證工藝研究與驗證要求1. 最終滅菌產(chǎn)品的無菌保證水平規(guī)定為:微生物污染概率不超過百萬分之一2 .采用無菌生產(chǎn)工藝的產(chǎn)品:其無菌保證水平為微生物污染概率不超過千分之一3 .與產(chǎn)品無菌保證相關(guān)的影響因素環(huán)境廠房、設(shè)備原材料（原輔料、包裝材料）無菌保證工藝生產(chǎn)過程控制人員衛(wèi)生4 .滅菌方法選擇按歐盟1999 年 8 月正式開始執(zhí)行滅菌方法選擇的決策樹決策樹的作用是在考慮各種復雜因素的情況下輔助選擇最佳的滅菌

9、方法凡是可以最終滅菌的產(chǎn)品務(wù)必要最終滅菌2.3. 決策樹越往下，風險越大 需要提供的必要證據(jù)越多5 .基本原則:無菌產(chǎn)品應在灌裝到最終容器后進行最終滅菌（首選）如因產(chǎn)品對熱不穩(wěn)定不能進行最終滅菌時，可采用最終滅菌方法的替代方法過濾除菌和 /或無菌生產(chǎn)工藝（退而求其次）同時明確如下要求：無菌藥品生產(chǎn)企業(yè)，首先應根據(jù)特定的處方選擇最佳的滅菌方法，然后再選擇包裝材料使用熱不穩(wěn)定的包裝材料不能作為選擇無菌生產(chǎn)工藝的理由因其他因素選擇的包裝容器不能進行最終滅菌，藥品生產(chǎn)企業(yè)仍有責任不斷尋找可接受的替代容器，使得產(chǎn)品可以在可接受的時間范圍內(nèi)采用最終滅菌的方法任何商業(yè)考慮均不能作為不使用具有最高無菌保證水平

10、的最終滅菌方法的理由常用的滅菌方式及其無菌保證水平1、過度殺滅法微生物殘存概率10-62、殘存概率法微生物殘存概率10-63、無菌生產(chǎn)工藝無菌保證一般只能達到10-3 水平4. 最終滅菌工藝的驗證要求最終滅菌工藝：過度殺滅法（Fo 12）殘存概率法（8Fo 12）目標：滅菌后的微生物殘存概率10-6過度殺滅設(shè)計方法：一種滅菌設(shè)計方法，只需要最少的關(guān)于產(chǎn)品生物負載的信息。最差條件的生物負載猜測用來確定所產(chǎn)生的殺滅力需要獲得滅菌物上的PNSU 為10-6。 在使用這個方法時，確效計劃必須證明FBIO 和 FPHY 都大于 12 分鐘。5. 殘存概率法：一種滅菌設(shè)計方法，當所產(chǎn)生的殺滅力需要達到PN

11、SU 為 10-6 時，以（滅菌物品上或內(nèi)的）生物負載的特性和產(chǎn)品對熱的敏感度為基礎(chǔ)。應產(chǎn)品而定的設(shè)計方法工藝驗證要求：過度殺滅法和殘存概率法均應進行工藝驗證驗證內(nèi)容：空載熱分布滿載熱分布熱穿透試驗微生物挑戰(zhàn)試驗（殘存概率法）滅菌前微生物污染水平-數(shù)量和耐熱性-過程控制6. 熱力滅菌的動力學原理微生物耐熱參數(shù) （ D 值）溫度系數(shù) Z 值FT 值T滅菌時間F0 值標準滅菌時間無菌保證值（SAL ）滅菌率 L對數(shù)規(guī)則：Arrhenius 質(zhì)量作用定律濕熱滅菌的對數(shù)規(guī)則始于1921 年 Bigeow 發(fā)表的論文-用對數(shù)規(guī)則闡述滅菌工藝過程，他認為，滅菌過程可以用阿倫尼烏斯的一級反應式來描述。根據(jù)質(zhì)

12、量作用定律，在恒定溫度及保持其它條件不變的情況下，單位時間內(nèi)被殺滅的微生物數(shù)正比于t0 時原有的數(shù)目，即：dN/dt K（N0 Nk）式中： N0 為 t 0 時，存活的微生物數(shù)；Nk 為 t 時被殺滅的微生物數(shù)；N 為 t 時存活的微生物數(shù)。由此得出，滅菌時微生物的死亡遵循對數(shù)規(guī)則。7. 微生物存活數(shù)與滅菌時間關(guān)系圖8. 微生物耐熱參數(shù)（D 值） :D 值是指在特定滅菌條件下，使微生物數(shù)量下降一個對數(shù)單位或殺滅90%所需要的時間（分鐘） 。D-值：在基本溫度時使微生物數(shù)量下降一個對數(shù)值（或 90% ）所需的時間9. 滅菌溫度系數(shù)（Z 值） :Z 值系指使某一種微生物的D 值變化一個對數(shù)單位，

13、滅菌溫度應升高或下降的度數(shù) .在沒有特定要求時:濕熱滅菌條件下Z 值通常取10；干熱滅菌條件下Z 值通常取20；干熱去熱原時Z 值通常取54。FT 值T（ ）:滅菌時間FT 值指T（ ）滅菌值，系指一個給定Z 值下，滅菌程序在溫度T（ ）下的等效滅菌時間。FT DT× lgN式中 :DT 為在 T（ ）下微生物的D 值； lgN 為 T（ ）下滅菌程序使微生物數(shù)下降的對數(shù)單位數(shù)。F0 值 :標準滅菌時間（用于濕熱滅菌）， 系滅菌過程賦予待滅菌物品在121下的等效滅菌時間（分鐘）。FH 值 :標準滅菌時間(用于干熱滅菌)， 系滅菌過程賦予待滅菌物品在170下的等效滅菌時間(分鐘)。滅菌

14、率 L：L 指在某一溫度T( )下滅菌lmin 所獲得的標準滅菌時間。L=10 (Ti-TR) /ZTi 滅菌溫度TR標準參照溫度Z 微生物死亡率常數(shù)10.11. 微生物挑戰(zhàn)試驗微生物挑戰(zhàn)試驗生物指示劑-簡稱為BI ( biological indicator) :是對特定滅菌工藝具有一定耐受性并且能夠定量測定滅菌效力的微生物制劑，適用于制備生物指示劑的微生物多為芽胞類細菌，這是因為，除輻射滅菌外，芽胞類細菌比常規(guī)的生長態(tài)微生物對滅菌工藝具有更強的耐受性。生物指示劑既可用來測定一個給定的滅菌工藝條件的滅菌效果，也可判別它是否符合無菌保證要求。12. 微生物挑戰(zhàn)試驗所謂濕熱滅菌工藝的生物指示劑微

15、生物挑戰(zhàn)試驗，系指將一定量已知D 值的耐熱孢子接入被滅菌的產(chǎn)品中，在設(shè)定的濕熱滅菌條件下滅菌，以驗證設(shè)定的滅菌工藝是否確實能賦予產(chǎn)品所需的SAL 為 10 6 而進行的試驗及評價過程。13.微生物挑戰(zhàn)試驗USP 和 BP 對這方面有專門的論述。一般說來，對生物指示劑選擇的原則性要求是： 孢子(菌株)穩(wěn)定 耐熱性強于被滅菌物品中常見的污染菌 系非致病菌 易于培養(yǎng)，孢子萌發(fā)率要在90%以上 有效期長 保存及使用方便 安全性好14. 微生物挑戰(zhàn)試驗濕熱滅菌工藝驗證用生物指示劑的來源主要有兩類:一類是采用標準生物指示劑，這類生物指示劑可從市場購買；另一類需用從日常生產(chǎn)污染菌監(jiān)控分離出的最耐熱微生物孢子

16、制備，并測得相關(guān)參數(shù)（最佳生長條件、耐熱性等）后方可使用。15. 濕熱滅菌工藝驗證中常用的生物指示劑菌 種 名 稱 常規(guī) D121 值 /min嗜熱脂肪芽胞桿菌Bacillus stereatherno philus 1.5 3.0枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis ATCC5230 0.3 0.7凝結(jié)芽胞桿菌Bacillus coagulans 0.4 0.8梭狀芽胞桿菌Clostridium sporogenes 0.40.8例:國產(chǎn)非治病性嗜熱肪芽胞菌芽胞（ATCC 7953 ）D 值 D121值1.74存活時間 121oC飽和蒸汽下,存活時間不少于3.9 分鐘死亡時間 12

17、1oC飽和蒸汽下,死亡時間不少于19 分鐘孢子量 5 × 105-6cfu/支16. 使用方法:將生物指示劑和被滅菌物品一起放置在滅菌柜（鍋）內(nèi)，上、中層、中央和排氣口（冷點處）滅菌后取出，然后直接置于56 60 oC 培養(yǎng) 24 48 小時，并另取一支未經(jīng)滅菌生物指示劑一起培養(yǎng)，作為陽性對照。結(jié)果判斷:根據(jù)顏色判斷滅菌效果，培養(yǎng)后全部保持紫色滅菌合格。若由紫色變?yōu)辄S色判為滅菌不合格。對照管應紫變黃色為該指示劑有效。例:進口 3MTMATTESTTM （1262） 蒸汽滅菌生物培養(yǎng)指示劑（嗜熱脂肪桿菌芽胞菌片）在 121 飽和蒸汽條件下，存活時間大于或等于5 分鐘，殺滅時間小于或等于

18、15分鐘。滅菌完畢，取出生物指示劑后至少冷卻10 分鐘以上，方可擠破生物指示劑內(nèi)安瓿。否則有可能導致安瓿的碎片傷人。只有對照管為陽性，其生物結(jié)果才算有效。使用方法1、將壓力蒸汽滅菌生物培養(yǎng)指示劑放于一標準測試包中；2、按照國家規(guī)范，分別將測試包放于鍋內(nèi)不同位置；3、滅菌完畢，取出生物指示劑；4、擠破內(nèi)含的安瓿，與一支對照管一起放于56培養(yǎng)鍋培養(yǎng)；5、 48 小時后，閱讀結(jié)果。微生物挑戰(zhàn)試驗挑戰(zhàn)試驗合格標準生物指示劑的選用應構(gòu)成挑戰(zhàn)性的必要條件：可用藥典，如USP<1035>中規(guī)定的生物指示劑； 對存活概率滅菌程序的產(chǎn)品而言，應當強調(diào)，所用生物指示劑的耐熱性應大于產(chǎn)品中常見污染菌的耐

19、熱性，生物指示劑的用量也應大于產(chǎn)品中該污染菌的水平。經(jīng)生物指示劑驗證后，應能證明在設(shè)定的F0 條件下，產(chǎn)品的無菌保證水平低于10-6。微生物挑戰(zhàn)試驗方案制訂制訂驗證方案時，應當綜合考慮相關(guān)法規(guī)要求、滅菌熱分布及熱穿透試驗數(shù)據(jù)、產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性、日常生產(chǎn)監(jiān)控中所獲得的滅菌前產(chǎn)品中的微生物污染水平和污染菌的耐熱性數(shù)據(jù)。方案還包括驗證記錄的各種表格。微生物挑戰(zhàn)試驗濕熱滅菌程序通常分為兩類：過度殺滅程序(Overkill Design Approach )殘存概率程序(Product-Specific Design Approach )微生物挑戰(zhàn)試驗挑戰(zhàn)試驗(生物指示劑驗證試驗):生物指示劑的裝載滅菌檢

20、查和培養(yǎng)結(jié)果評價驗證試驗的頻率微生物挑戰(zhàn)試驗作為一項生物挑戰(zhàn)性試驗，盡管生物指示劑驗證不能替代物理驗證，但它能如實反映滅菌工藝條件對微生物的殺滅效果，從而證明該滅菌工藝所賦予相關(guān)產(chǎn)品的無菌保證水平是否符合要求。生產(chǎn)指示劑在試驗中扮演了各種可能因素造成的產(chǎn)品中的 “污染菌”的角色，以這種方式進行的驗證更切合實際，更能說明所設(shè)定的滅菌程序是否安全。微生物挑戰(zhàn)試驗對熱穩(wěn)定性很好的產(chǎn)品而言，通常采用過度殺滅程序，該程序能賦予產(chǎn)品足夠大的安全系數(shù)，使在121下D 值約為 1.0min 的細菌孢子至少下降12 個對數(shù)單位。在過度殺滅程序的一半時間時，可使該孢子至少下降6 個對數(shù)單位。由于殺滅微生物孢子(生

21、物指示劑)的滅菌條件極為苛刻，因此，從滅菌程序的標準滅菌時間F0 來看，毋須擔心產(chǎn)品滅菌后的無菌保證問題。微生物挑戰(zhàn)試驗并不是所有的滅菌程序都可進行生物指示劑驗證。有些產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性相當差，滅菌溫度僅能控制在100左右，整個滅菌程序的F0 值還不到1min，對此類程序進行生物指示劑驗證就沒有太多的意義。此類產(chǎn)品的無菌保證水平主要是通過無菌生產(chǎn)工藝來實現(xiàn)，滅菌僅 能作為提高產(chǎn)品無菌保證水平的手段。 微生物挑戰(zhàn)試驗WHO GMP 中強調(diào)，化學或生物指示劑可用于滅菌過程的監(jiān)控，但不得代替物理 監(jiān)控（溫度、時間）。FDA 均認為生物指示劑驗證并不能取代物理驗證，這是由生物指示劑驗證的復雜性所決定的。

22、Dry heat sterilization D value is F 值為在一定溫度（T）下，給定Z 值所產(chǎn)生的滅菌效果與在參比溫度（T0 ）下給定Z 值所產(chǎn)生的滅菌效果相同時，所相當?shù)臏缇鷷r間，以min 為單位。F 值常用于干熱滅菌。F 值的數(shù)學表達式如下： 式中， t 為測量被滅菌物溫度的時間間隔，一般為0.5 1min ， T 為每個時間間隔t 所測得被滅菌物溫度，T0 為參比溫度。 Z 值是指滅菌時間減少到原來的1/10 所需升高的溫度或在相同滅菌時間內(nèi)，殺滅 99% 的微生物所需提高的溫度。 1. 將指示劑與待滅菌的物品一同放入滅菌器內(nèi)，一同滅菌。 2. 滅菌結(jié)束后，取出指示劑，待

23、冷卻（約15 分鐘）后，將蓋子按下以密封塑料管。3. 用所提供的工具擠壓塑料管，使安培瓶破裂，培養(yǎng)基溢出，與紙片接觸。 4. 置于56 攝氏度培養(yǎng)，定時觀察生長情況5.48 小時內(nèi)出結(jié)果D 值是指在一定溫度下，殺滅90% 微生物（或殘存率為10% ）所需的滅菌時間。在一定滅菌條件下，不同微生物具有不同的D 值；同一微生物在不同滅菌條件下，D 值亦不相同。因此D 值隨微生物的種類、環(huán)境和滅菌溫度變化而異。 F0 值為一定滅菌溫度（T）下，Z 為 10時所產(chǎn)生的滅菌效果與121 ， Z 值為10所產(chǎn)生的滅菌效果相同時所相當?shù)臅r間（ min） 。 也就是說，不管溫度如何變化，t分鐘內(nèi)的滅菌效果相當于

24、在121 下滅菌F0 分鐘的效果。 在濕熱滅菌時，參比溫度定為121 ，以嗜熱脂肪芽孢桿菌作為微生物指示菌，該菌在121 時， Z 值為10 。則： 顯然， 即把各溫度下滅菌效果都轉(zhuǎn)化成121 下滅菌的等效值。因此稱 F0 為標準滅菌時間（ min ） 。F0 目前僅應用于熱壓滅菌。 2、什么是化學滅菌法，分為哪幾類，有何應用特點？ 答：化學滅菌法系指用化學藥品殺死微生物的方法。 化學滅菌法分為：氣體滅菌法：有環(huán)氧乙烷、臭氧、過氧乙酸、甲醛、丙二醇、乳酸等。以環(huán)氧乙烷最 為常用。氣體滅菌法用于塑料容器、玻璃制品、金屬制品等表面，設(shè)備表面，室內(nèi)空氣的滅菌，也可用于 包裝紙箱，注射針、筒，衣著敷料

25、，紙或塑料包裝的藥物的滅菌?；瘜W滅菌劑滅菌法：常用的有0.1 0.2的新潔爾滅溶液，2左右的酚或甲酚皂液，75的乙醇液等。主要作為物體表面，無菌室墻面、地面、臺面等的消毒。 17 、物理滅菌法可分為哪幾類，各有何應用特點？ 答：物理滅菌法可分為干熱滅菌法、濕熱滅菌法、過濾滅菌法。射線滅菌法。 1） 干熱滅菌法是一種利用干熱空氣進行滅菌的方法。分為火焰滅菌法和干熱空氣滅菌法，火焰滅菌法適于 耐火焰材料的滅菌，如金屬、玻璃及瓷器等。干熱空氣滅菌法適于耐高溫的玻璃器具、金屬容器、耐高溫 的藥物粉末及不允許濕氣穿透的油性物質(zhì)（如油脂性軟膏基質(zhì)、注射用油等）的滅菌，不適于橡膠、塑料及大部分藥品。2)濕熱滅菌法分為熱壓滅菌法、流通蒸氣滅菌法、煮沸滅菌法和低溫間歇滅菌法。熱壓滅菌法時濕熱滅菌中最可靠的方法，適用于耐熱壓滅菌的藥物、玻璃器皿、金屬容器、瓷器、橡膠塞、濾膜過濾器、醫(yī)院手術(shù)用品等的滅菌。流通蒸氣滅菌法與煮沸滅菌法均不能保證殺死所有的耐熱芽孢，適用于必須加熱滅菌，但不耐高溫