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文檔簡(jiǎn)介

1、1 .范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品微生物檢驗(yàn)的基本要求。本規(guī)范適用于化妝品樣品的采集、保存及供檢樣品制備。2 .儀器和設(shè)備2.1 天平。2.2 高壓滅菌器。2.3 振蕩器。2.4 三角瓶,250mL。2.5 玻璃珠。2.6 琉璃棒。2.7 刻度吸管,1mL、 10mL。2.8 研缽或均質(zhì)器。2.9 恒溫水浴箱。3 .培養(yǎng)基和試劑3.1 生理鹽水成分:氯化鈉8.5g蒸餾水加至1000mL溶解后,分裝到加玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi),每瓶90 mL, 103.43kPa (121 15 lb)20min 高壓滅菌。3.2 SCDLP 液體培養(yǎng)基成分:酪蛋白胨17g大豆蛋白胨3g氯化鈉5g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖1g

2、吐溫 807g蒸餾水1000mL103.43 kPa制法: 先將卵磷脂在少量蒸餾水中加溫溶解后,再與其它成分混合,加熱溶解,調(diào) pH 為 7.2 7.3 分裝,(121 15 lb)20min 高壓滅菌。注意振蕩,使沉淀于底層的吐溫80 充分混合,冷卻至25左右使用。注:如無(wú)酪蛋白胨和大豆蛋白胨,也可用多胨代替。3.3 滅菌液體石蠟。3.4 滅菌吐溫80。4 . 樣品的采集及注意事項(xiàng)4.1 所采集的樣品,應(yīng)具有代表性,一般視每批化妝品數(shù)量大小,隨機(jī)抽取相應(yīng)數(shù)量的包裝單位。檢驗(yàn)時(shí),應(yīng)分別從兩個(gè)包裝單位以上的樣品中共取10g 或 10mL。包裝量小于20g 的樣品,采樣量可適當(dāng)增加樣品包裝數(shù)量。4

3、.2 供檢驗(yàn)樣品,應(yīng)嚴(yán)格保持原有的包裝狀態(tài)。容器不應(yīng)有破裂,在檢驗(yàn)前不得打開(kāi),防止樣品被污染。4.3 接到樣品后,應(yīng)立即登記,編寫(xiě)檢驗(yàn)序號(hào),并按檢驗(yàn)要求盡快檢驗(yàn)。如不能及時(shí)檢驗(yàn),樣品應(yīng)放在室溫陰涼干燥處,不要冷藏或冷凍。4.4 若只有一個(gè)樣品而同時(shí)需做多種分析,如細(xì)菌、毒理、化學(xué)等,則宜先取出部分樣品做細(xì)菌檢驗(yàn),再將剩余樣品做其它分析。4.5 在檢驗(yàn)過(guò)程中,從打開(kāi)包裝到全部檢驗(yàn)操作結(jié)束,均須防止微生物的再污染和擴(kuò)散,所用器皿及材料均應(yīng)事先滅菌,全部操作應(yīng)在無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)行,或在相應(yīng)條件下,按無(wú)菌操作規(guī)定進(jìn)行。4.6 如檢出糞大腸菌群或其它致病菌,自報(bào)告發(fā)出之日起該菌種及被檢樣品應(yīng)保存一個(gè)月。5 .

4、 供檢樣品的制備5.1 液體樣品5.1.1 水溶性的液體樣品,可量取10mL加到90mL滅菌生理鹽水中,如樣品少于10mL,仍按10 倍稀釋法進(jìn)行。如為5mL則加到45mL滅菌生理鹽水中,混勻后制成1: 10 檢液。5.1.2 油性液體樣品,取樣品10mL,先加5mL滅菌液體石蠟混勻,再加10mL滅菌的吐溫80, 在 4044水浴中充分混合,制成1 : 10 檢液。5.3 固體樣品稱(chēng)取 10g,加到90mL滅菌生理鹽水中,充分振蕩混勻,使其分散混懸,靜置后,取上清液作為1: 10 的檢液。如有均質(zhì)器,上述水溶性膏、霜、粉劑等,可稱(chēng)10g 樣品加入90mL滅菌生理鹽水,均質(zhì)1min 2min;疏

5、水性膏、霜及眉筆、口紅等,稱(chēng)10g 樣品,加入10mL滅菌液體石蠟,10mL吐溫 80,70mL 滅菌生理鹽水,均質(zhì)3min 5min。1. 范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中菌落總數(shù)的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范適用于化妝品菌落總數(shù)的測(cè)定。2. 定義本規(guī)范采用下列定義菌落總數(shù)(Aerobic bacterial count )是指化妝品檢樣經(jīng)過(guò)處理,在一定條件下培養(yǎng)后(如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、pH 值、需氧性質(zhì)等), 1g(1mL) 檢樣中所含菌落的總數(shù)。所得結(jié)果只包括一群本方法規(guī)定的條件下生長(zhǎng)的嗜中溫的需氧性菌落總數(shù)。測(cè)定菌落總數(shù)便于判明樣品被細(xì)菌污染的程度,是對(duì)樣品進(jìn)行衛(wèi)生總評(píng)價(jià)的綜合依據(jù)。3. 儀

6、器和設(shè)備3.1 三角瓶,250mL。3.2 量筒,200mL。3.3 pH 計(jì)或精密pH試紙。3.4 高壓滅菌器。3.5 試管: 15× 150mm。3.6 滅菌平皿:直徑9cm。3.7 滅菌刻度吸管,10mL、 1mL。3.8 酒精燈。3.9 恒溫培養(yǎng)箱:36±1。3.10 放大鏡。4. 培養(yǎng)基和試劑4.1生理鹽水:見(jiàn)總則中3.1 。4.1 卵磷脂、吐溫80- 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4.1.1成分:蛋白胨20g牛肉膏3g氯化鈉5g瓊脂15g卵磷脂1g吐溫 80 7g蒸餾水1000mL4.1.2 制法:先將卵磷脂加到少量蒸餾水中,加熱溶解,加入吐溫80, 將其他成分(除瓊脂外)加到

7、其余的蒸餾水中,溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐溫80, 混勻,調(diào)pH值為 7.1 7.4, 加入瓊脂,103.43kPa (121 15 lb)20min 高壓滅菌,儲(chǔ)存于冷暗處備用。4.2 0.5%氯化三苯四氮唑(2,3,5-triphenyl terazolium chloride,TTC )成分:TTC0.5g蒸餾水1000mL溶解后過(guò)濾,103.43kPa (121 15 lb)20min 高壓滅菌,裝于棕色試劑瓶,置4冰箱備用。5. 操作步驟5.1 用滅菌吸管吸取1: 10 稀釋的檢液2mL,分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi),每皿1mL。另取1mL注入到9mL滅菌生理鹽水試管中(注意勿使吸管接

8、觸液面),更換一支吸管,并充分混勻,制成1: 100 檢液。吸取2mL,分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi),每皿1mL。如樣品含菌量高,還可再稀釋成1 : 1000,1 : 10000, , 等,每種稀釋度應(yīng)更換1 支吸管。5.2 將融化并冷至4550的卵磷脂吐溫80 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注到平皿內(nèi),每皿約15 mL, 隨即轉(zhuǎn)動(dòng)平皿,使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻,待瓊脂凝固后,翻轉(zhuǎn)平皿,置36±1 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h± 2h。另取一個(gè)不加樣品的滅菌空平皿,加入約15mL卵磷脂吐溫80 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,待瓊脂凝固后,翻轉(zhuǎn)平皿,置36±1培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h± 2h,為空白對(duì)

9、照。5.3 為便于區(qū)別化妝品中的顆粒與菌落,可在每100mL卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂中加入1mL0 .5%的 TTC溶液,如有細(xì)菌存在,培養(yǎng)后菌落呈紅色,而化妝品的顆粒顏色無(wú)變化。6菌落計(jì)數(shù)方法先用肉眼觀察,點(diǎn)數(shù)菌落數(shù),然后再用放大5 倍 10 倍的放大鏡檢查,以防遺漏。記下各平皿的菌落數(shù)后,求出同一個(gè)稀釋度各平皿生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)。若平皿中有連成片狀的菌落或花點(diǎn)樣菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí),該平皿不宜計(jì)數(shù)。若片狀菌落不到平皿中的一半,而其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻,則可將此半個(gè)平皿菌落計(jì)數(shù)后乘以2, 以代表全皿菌落數(shù)。7. 菌落計(jì)數(shù)及報(bào)告方法7.1 首先選取平均菌落數(shù)在30 個(gè) 300 個(gè)之間的平皿,作為菌

10、落總數(shù)測(cè)定的范圍。當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí),即以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)(見(jiàn)表1 中例1 ) 。7.2 若有兩個(gè)稀釋度,其平均菌落數(shù)均在30 個(gè) 300 個(gè)之間,則應(yīng)求出兩菌落總數(shù)之比值來(lái)決定,若其比值小于或等于2, 應(yīng)報(bào)告其平均數(shù),若大于2 則報(bào)告其中稀釋度較低的平皿的菌落數(shù)(見(jiàn)表1 中例 2 及例3) 。7.3 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300 個(gè),則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見(jiàn)表1中例4) 。7.4 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30 個(gè),剛應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見(jiàn)表1 中例 5) 。7.5 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在3

11、0 個(gè) 300 個(gè)之間,其中一個(gè)稀釋度大于300 個(gè),而相鄰的另一稀釋度小于 30 個(gè)時(shí),則以30 或 300 的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見(jiàn)表1 中例6) 。7.6 若所有的稀釋度均無(wú)菌生長(zhǎng),報(bào)告數(shù)為每g或每mL小于10 CFU。7.7 菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告,菌落數(shù)在10 以?xún)?nèi)時(shí),按實(shí)有數(shù)值報(bào)告之,大于100時(shí),采用二位有效數(shù)字,在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值,應(yīng)以四舍五入法計(jì)算。為了縮短數(shù)字后面零的個(gè)數(shù),可用10 的指數(shù)來(lái)表示(見(jiàn)表1 報(bào)告方式欄)在報(bào)告菌落數(shù)為“不可計(jì)”時(shí),應(yīng)注明樣品的稀釋度。表 1 細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果及報(bào)告方式例次不同稀釋度平均菌落數(shù)兩稀釋度 菌數(shù)之比菌落總數(shù)(CFU/mL或 CFU

12、/g)報(bào)告方式(CFU/mL或 CFU/g)10-110-210-311365164201640016000 或 1.6 × 10422760295461.63800038000 或 3.8 × 10432890271602.22710027000 或 2.7 × 1044不可計(jì)4650513513000510000 或 5.1 × 105527115270270 或 2.7 × 1026不可計(jì)305123050031000 或 3.1 × 1047000< 1× 10< 1× 10*CFU:菌落形成單

13、位。1. 范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中糞大腸菌群的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范適用于化妝品中糞大腸菌群的檢驗(yàn)。2. 定義本規(guī)范采用下列定義糞大腸菌群(Fecal coliforms )系一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌,在44±0.5 培養(yǎng)24h 48h能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。該菌直接來(lái)自糞便,是重要的衛(wèi)生指標(biāo)菌。3. 儀器3.1 恒溫水浴箱或隔水式恒溫箱:44±0.5 。3.2 溫度計(jì)。3.3 顯微鏡。3.4 載玻片。3.5 接種環(huán)。3.6 電磁爐。3.7 三角瓶,250mL。3.8 試管: 15× 150mm。3.9 小倒管。3.10 pH 計(jì)或 pH 試紙。3.11 高

14、壓滅菌器。3.12 滅菌吸管,10mL、 1mL。3.13 滅菌平皿:直徑90mm。4. 培養(yǎng)基和試劑4.1 雙倍乳糖膽鹽(含中和劑)培養(yǎng)基成分:蛋白胨40g豬膽鹽10g乳糖10g0.4%溴甲酚紫水溶液5mL卵磷脂吐溫 80蒸餾水制法: 將卵磷脂、2g14g1000mL吐溫 80 溶解到少量蒸餾水中。將蛋白胨、豬膽鹽及乳糖溶解到其余的蒸餾水中,加到一起混勻,調(diào) pH到7.4, 加入0.4%溴甲酚紫水溶液,混勻,分裝試管(每支試管中加一個(gè)小倒管)。 68.95 kPa (11510 lb)20min高壓滅菌。4.2 2 伊紅美藍(lán)(EMB )瓊脂成分:蛋白胨10g乳糖10g磷酸氫二鉀2g瓊脂20g

15、2%伊紅水溶液20mL0.5%美藍(lán)水溶液13mL蒸餾水1000mL制法:先將瓊脂加到900mL蒸餾水中,加熱溶解,然后加入磷酸氫二鉀、蛋白胨,混勻,使之溶解。再以蒸餾水補(bǔ)足至1000mL。 校正 pH值為 7.2 7.4, 分裝于三角瓶?jī)?nèi),103.43 kPa (12115 lb)15min 高壓滅菌備用。臨用時(shí)加入乳糖并加熱融化瓊脂。冷至60左右無(wú)菌操作加入滅菌的伊紅美藍(lán)溶液,搖勻。傾注平皿備用。4.3 蛋白胨水(做靛基質(zhì)試驗(yàn)用)成分:蛋白胨(或胰蛋白胨)20g氯化鈉5g蒸餾水1000mL制法:將上述成分加熱融化,調(diào)pH值為 7.0 7.2. 分裝小試管,103.43 kPa (12115

16、lb)15min 高壓滅菌。4. 4 靛基質(zhì)試劑柯凡克試劑:將5g 對(duì)二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中,然后緩慢加入濃鹽酸25mL。試驗(yàn)方法:接種細(xì)菌于蛋白胨水中,于 44± 0.5 培養(yǎng)24h± 2h。 沿管壁加柯凡克試劑0.3mL 0.5mL, 輕搖試管。陽(yáng)性者于試劑層顯深玫瑰紅色。注:蛋白胨應(yīng)含有豐富的色氨酸,每批蛋白胨買(mǎi)來(lái)后,應(yīng)先用已知菌種鑒定后方可使用。4.5 革蘭氏染色液:4.5.1 染液制備4.5.1.1 結(jié)晶紫染色液:結(jié)晶紫1g95%乙醇20mL1%草酸銨水溶液80mL將結(jié)晶紫溶于乙醇中,然后與草酸銨溶液混合。4.5.1.2 革蘭氏碘液:碘1g碘化鉀2g蒸

17、餾水加至300mL將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合,加入蒸餾水少許,充分振搖,待完全溶解后,再加蒸餾水至300mL。4.5.1.3 脫色液:95%乙醇。4.5.1.4 復(fù)染液:( 1 )沙黃復(fù)染液:沙黃0.25g95%乙醇10mL蒸餾水90mL將沙黃溶解于乙醇中,然后用蒸餾水稀釋。( 2)稀石碳酸復(fù)紅液:稱(chēng)取堿性復(fù)紅10g,研細(xì),加95%乙醇100mL,放置過(guò)夜,濾紙過(guò)濾。取該液10mL,加 5%石碳酸水溶液90mL,混合,即為石碳酸復(fù)紅液。再取此液10mL加水90mL,即為稀石碳酸復(fù)紅液。4.5.2 染色法4.5.2.1 將涂片在火焰上固定,滴加結(jié)晶紫染色液,染1min, 水洗。4.5.2.2 滴加革

18、蘭氏碘液,作用1min, 水洗。4.5.2.3 滴加95%乙醇脫色,約30s, 或?qū)⒁掖嫉螡M(mǎn)整個(gè)涂片,立即傾去,再用乙醇滴滿(mǎn)整個(gè)涂片,脫色10s, 水洗。4.5.2.4 滴加復(fù)染液,復(fù)染1min, 水洗,待干,鏡檢。4.5.3 染色結(jié)果革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色,革蘭氏陰性菌呈紅色。注:如用1: 10 稀釋石碳酸復(fù)紅液做復(fù)染,復(fù)染時(shí)間僅需10s。5. 操作步驟5.1 取 10mL1 : 10 稀釋的檢液,加到10mL雙倍乳糖膽鹽(含中和劑)培養(yǎng)基中,置44±0.5 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 48h,如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣,則報(bào)告為糞大腸菌群陰性。5.2 如產(chǎn)酸產(chǎn)氣,則劃線(xiàn)接種到伊紅美藍(lán)瓊脂平板上,置36

19、±1培養(yǎng)18h 24h。同時(shí)取該培養(yǎng)液1 2 滴接種到蛋白胨水中,置44±0.5 培養(yǎng) 24h± 2h。經(jīng)培養(yǎng)后,在上述平板上觀察有無(wú)典型菌落生長(zhǎng)。糞大腸菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落呈深紫黑色,圓形,邊緣整齊,表面光滑濕潤(rùn),常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色,不帶或略帶金屬光澤,或粉紫色,中心較深的菌落,亦常為糞大腸菌群,應(yīng)注意挑選。5.3 挑取上述可疑菌落,涂片做革蘭氏染色鏡檢。5.4 在蛋白胨水培養(yǎng)液中,加入靛基質(zhì)試劑約0.5mL, 觀察靛基質(zhì)反應(yīng)。陽(yáng)性者液面呈玫瑰紅色;陰性反應(yīng)液面呈試劑本色。6. 檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告根據(jù)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,平板上有典型菌落,并經(jīng)

20、證實(shí)為革蘭氏陰性桿菌,靛基質(zhì)試驗(yàn)陽(yáng)性,則可報(bào)告被檢樣品中檢出糞大腸菌群。1. 范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中銅綠假單胞菌的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范適用于化妝品中銅綠假單胞菌的檢驗(yàn)。2. 定義本規(guī)范采用了下列定義銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa )屬于假單胞菌屬,為革蘭氏陰性桿菌,氧化酶陽(yáng)性,能產(chǎn)生綠膿菌素。此外還能液化明膠,還原硝酸鹽為亞硝酸鹽,在42±1 條件下能生長(zhǎng)。該菌對(duì)人有致病力,可使傷處化膿,引起敗血癥等。3. 儀器3.1 培養(yǎng)箱:42±1 、36±1。3.2 三角瓶,250mL。3.3 試管: 15× 150mm。3.4 滅菌平皿

21、:直徑90mm。3.5 滅菌刻度吸管,10mL、 1mL。3.6 顯微鏡。3.7 載玻片。3.8 接種針,接種環(huán)。3.9 電磁爐。3.10 高壓滅菌器。4. 培養(yǎng)基和試劑4.1 SCDLP 液體培養(yǎng)基見(jiàn)總則中3.2。4.2 十六烷基三甲基溴化銨培養(yǎng)基成分:牛肉膏3g蛋白胨10g氯化鈉5g十六烷基三甲基溴化銨0.3g瓊脂20g蒸餾水1000mL制法:除瓊脂外,將上述成分混合加熱溶解,調(diào)pH為 7.4 7.6, 加入瓊脂,68.95 kPa (11510 lb)20min 滅菌后,制成平板備用。4.3 乙酰胺培養(yǎng)基成分:乙酰胺10.0g氯化鈉5.0g無(wú)水磷酸氫二鉀1.39g無(wú)水磷酸二氫鉀0.73g

22、硫酸鎂(MgSO4.7H 2O)0.5g酚紅0.012g瓊脂20g蒸餾水1000mL制法:除瓊脂和酚紅外,將其它成分加到蒸餾水中,加熱溶解,調(diào)pH為 7.2, 加入瓊脂、酚紅,103.43 kPa (12115 lb)20min 高壓滅菌后,制成平板備用。4.4 綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基成分:蛋白胨20g氯化鎂1.4g硫酸鉀10g瓊脂18g甘油(化學(xué)純)10g蒸餾水1000mL制法:將蛋白胨、氯化鎂和硫酸鉀加到蒸餾水中,加溫使其溶解,調(diào)于試管內(nèi),68.95 kPa (11510 lb)20min 高壓滅菌后,制成斜面?zhèn)溆?。pH 至 7.4, 加入瓊脂和甘油,加熱溶解,分裝4.5 明膠培養(yǎng)基成分:牛

23、肉膏3g蛋白胨5g明膠120g蒸餾水1000mL制法: 取各成分加到蒸餾水中浸泡20min, 隨即攪拌加溫使之溶解,調(diào) pH至 7.4, 分裝于試管內(nèi),經(jīng) 68.95 kPa (11510 lb)20min 高壓滅菌后,直立制成高層備用。4.6 硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基成分:蛋白胨10g酵母浸膏3g硝酸鉀2g亞硝酸鈉0. 5g蒸餾水1000mL制法:將蛋白胨和酵母浸膏加到蒸餾水中,加熱使之溶解,調(diào) pH為 7.2, 煮沸過(guò)濾后補(bǔ)足液量,加入硝酸鉀和亞硝酸鈉,溶解混勻,分裝到加有小倒管的試管中,68.95 kPa (11510 lb)20min 高壓滅菌后備用。4.7 普通瓊脂斜面培養(yǎng)基成分:蛋白胨

24、10g牛肉膏3g氯化鈉5g瓊脂15g蒸餾水1000mL制法: 除瓊脂外,將其余成分溶解于蒸餾水中,調(diào) pH為 7.2 7.4, 加入瓊脂,加熱溶解,分裝試管,103.43 kPa (12115 lb)20min 高壓滅菌后,制成斜面?zhèn)溆谩?. 操作步驟5.1 增菌培養(yǎng):取1: 10 樣品稀釋液10mL加到90mLSCDLP液體培養(yǎng)基中,置36±1培養(yǎng) 18h 24h。如有銅綠假單胞菌生長(zhǎng),培養(yǎng)液表面多有一層薄菌膜,培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍(lán)綠色。5.2 分離培養(yǎng):從培養(yǎng)液的薄膜處挑取培養(yǎng)物,劃線(xiàn)接種在十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上,置36±1 培養(yǎng)18h 24h。凡銅綠假單胞菌在此

25、培養(yǎng)基上,其菌落扁平無(wú)定型,向周邊擴(kuò)散或略在蔓延,表面濕潤(rùn),菌落呈灰白色,在缺乏十六烷三甲基溴化銨瓊脂時(shí)也可用乙酰胺培養(yǎng)基進(jìn)行分離,將菌液劃線(xiàn)接種于平板上,置36±1 培養(yǎng)24h± 2h, 銅綠假單胞菌在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好,菌落扁平,邊緣不整,菌落周?chē)囵B(yǎng)基略帶粉紅色,其它菌落不生長(zhǎng)。5.3 染色鏡檢:挑取可疑的菌落,涂片,革蘭氏染色,鏡檢為革蘭氏陰性者應(yīng)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)。5.4 氧化酶試驗(yàn):取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內(nèi),用無(wú)菌玻璃棒挑取銅綠假單胞菌可疑菌落涂在濾紙上,然后在其上滴加一新配制的1%二甲基對(duì)苯二胺試液,在 15s 30s 之內(nèi),出現(xiàn)粉紅色或紫紅色時(shí),為

26、氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性;若培養(yǎng)物不變色,為氧化酶試驗(yàn)陰性。5.5 綠膿菌素試驗(yàn):取可疑菌落2 個(gè) 3 個(gè),分別接種在綠膿菌素測(cè)定培養(yǎng)基上,置36±1培養(yǎng)24h± 2h,加入氯仿3mL 5mL,充分振蕩使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于氯仿液內(nèi),待氯仿提取液呈藍(lán)色時(shí),用吸管將氯仿移到另一試管中并加入1mol/L 的鹽酸1mL左右,振蕩后,靜置片刻。如上層鹽酸液內(nèi)出現(xiàn)粉紅色到紫紅色時(shí)為陽(yáng)性,表示被檢物中有綠膿菌素存在。5.6 硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn):挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物,接種在硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基中,置 36±1培養(yǎng)24h± 2h, 觀察結(jié)果。凡在硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基

27、內(nèi)的小倒管中有氣體者,即陽(yáng)性,表明該菌能還原硝酸鹽,并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮?dú)狻?.7 明膠液化試驗(yàn),取銅綠假單胞菌可疑菌落的純培養(yǎng)物,穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi),置36±1 培養(yǎng)24h±2h, 取出放冰箱10min 30min, 如仍呈溶解狀或表面溶解時(shí)即為明膠液化試驗(yàn)陽(yáng)性;如凝固不溶者為陰性。5.8 42 生長(zhǎng)試驗(yàn):挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物,接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上,放在42±1 培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24h 48h, 銅綠假單胞菌能生長(zhǎng),為陽(yáng)性,而近似的熒光假單胞菌則不能生長(zhǎng)。6. 檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告被檢樣品經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后,經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性桿菌,氧化酶及綠膿菌素試驗(yàn)

28、皆為陽(yáng)性者,即可報(bào)告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌;如綠膿菌素試驗(yàn)陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42生長(zhǎng)試驗(yàn)三者皆為陽(yáng)性時(shí),仍可報(bào)告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌。五、金黃色葡萄球菌1. 范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范適用于化妝品中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)。2. 定義本規(guī)范采用下列定義金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )為革蘭氏陽(yáng)性球菌,呈葡萄狀排列,無(wú)芽孢,無(wú)莢膜,能分解甘露醇,血漿凝固酶陽(yáng)性。該菌是葡萄球菌中對(duì)人類(lèi)致病力最強(qiáng)的一種,能引起人體局部化膿性病灶,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致敗血癥。3. 儀器和設(shè)備3.1 顯微鏡。3.2 恒溫培養(yǎng)箱:36±1。

29、3.3 離心機(jī)。3.4 滅菌吸管,1mL、 10mL。3.5 滅菌試管:15× 150mm。3.6 載玻片。3.7 酒精燈。4. 培養(yǎng)基和試劑4.1 SCDLP 液體培養(yǎng)基見(jiàn)總則中3.2。4.2 7.5% 的氯化鈉肉湯成分:蛋白胨10g牛肉膏3g氯化鈉75g蒸餾水加至1000mL制法:將上述成分加熱溶解,調(diào)pH為 7.4, 分裝, 103.43 kPa (12115 lb)15min 高壓滅菌。4.3 Baird Parker 氏培養(yǎng)基成分:胰蛋白胨10g牛肉膏5g酵母浸膏1g丙酮酸鈉10g甘氨酸12g氯化鋰(LiCl · 6H2O)5g瓊脂20g蒸餾水950mLpH 7.

30、0 ± 0.2增菌劑的配制:30%卵黃鹽水50mL與除菌過(guò)濾的1%亞碲酸鉀溶液10mL混合,保存于冰箱內(nèi)。制法: 將各成分加到蒸餾水中,加熱煮沸完全溶解,冷至25±1校正pH。 分裝每瓶95mL,103.43 kPa (121 15lb)高壓滅菌15min。 臨用時(shí)加熱溶化瓊脂,每 95mL加入預(yù)熱至50左右的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5mL, 搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在冰箱貯存不得超過(guò)48h± 2h。4.4 血瓊脂培養(yǎng)基成分:營(yíng)養(yǎng)瓊脂100mL脫纖維羊血(或兔血)10mL制法:將營(yíng)養(yǎng)瓊脂加熱融化,待冷至50左右無(wú)菌操作加入脫纖維羊血,搖勻,制成平板

31、,置冰箱內(nèi)備用。4.5 甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基成分:蛋白胨10g氯化鈉5g甘露醇10g牛肉膏5g0.2%麝香草酚藍(lán)溶液12mL蒸餾水1000mL制法:將蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏加到蒸餾水中,加熱溶解,調(diào)pH 7.4 ,加入甘露醇和指示劑,混勻后分裝試管中,68.95 kPa (11510 lb)20min 滅菌備用。4.6 兔(人)血漿制備取 3.8%檸檬酸鈉溶液,103.43 kPa (12115 lb)30min 高壓滅菌,1 份加兔(人)全血4份,混勻靜置;2000rpm3000rpm 離心3min 5min。血球下沉,取上面血漿。5. 操作步驟5.1 增菌:取1: 10 稀釋的樣品接種到90m

32、L SCDLP液體培養(yǎng)基中,置36±1培養(yǎng)箱,培養(yǎng)24h± 2h。注:如無(wú)此培養(yǎng)基也可用7.5%氯化鈉肉湯。5.2 分離:自上述增菌培養(yǎng)液中,取1 2 接種環(huán),劃線(xiàn)接種在Baird Parker 氏培養(yǎng)基,如無(wú)此培養(yǎng)基也可劃線(xiàn)接種到血瓊脂平板,置36±1培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h 48h。在血瓊脂平板上菌落呈金黃色,大而突起,圓形,不透明,表面光滑,周?chē)腥苎?。在Baird Parker 氏培養(yǎng)基上為圓形,光滑,凸起,濕潤(rùn),直徑2mm 3mm顏色呈灰色到黑,色,邊緣為淡色,周?chē)鸀橐换鞚釒?,在其外層有一透明帶。用接種針接觸菌落似有奶油樹(shù)膠的軟度。偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類(lèi)似菌

33、落,但無(wú)混濁帶及透明帶。挑取單個(gè)菌落分純?cè)谘傊桨迳?,?6±1培養(yǎng)24h± 2h。5.3 染色鏡檢:挑取分純菌落,涂片,進(jìn)行革蘭氏染色,鏡檢。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性菌,排列成葡萄狀,無(wú)芽孢,無(wú)莢膜,致病性葡萄球菌,菌體較小,直徑約為0.5 m 1 m。5.4 甘露醇發(fā)酵試驗(yàn):取上述分純菌落接種到甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)基液面上加入2mm 3mm高的滅菌液體石蠟,置36±1 培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h± 2h, 金黃色葡萄球菌應(yīng)能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸。5.5 血漿凝固酶試驗(yàn):吸取1 : 4 新鮮血漿0.5 mL,放入滅菌小試管中,加入待檢菌24h± 2h 肉湯培養(yǎng)物0.5 mL?;靹?,放36±1 恒溫箱或恒溫水浴中,每半個(gè)小時(shí)觀察一次,6h 之內(nèi)如呈現(xiàn)凝塊即為陽(yáng)性。同時(shí)以已知血漿凝固酶陽(yáng)性和陰性菌株肉湯培養(yǎng)物及肉湯培養(yǎng)基各0.5 mL, 分別加入滅菌1: 4 血漿 0.5

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