和可溶性蛋白的測(cè)定

1、SOD、POD、MDA、可溶性蛋白、脯氨酸、電導(dǎo)率、可溶性糖的測(cè)定一、磷酸緩沖液的配制：A液：0.2M的KH2PO4溶液 稱取分析純KH2PO427.216克，用蒸餾水定容至1000毫升。B液：0.2M的K2HPO4溶液 稱取分析純K2HPO43H2O45.644克，用蒸餾水定容至1000毫升。或（A液：0.2M的NaH2PO4溶液 稱取分析純NaH2PO42H2O 31.21克，用蒸餾水定容至1000毫升。B液：0.2M的Na2HPO4溶液 稱取分析純Na2HPO412H2O 71.64克，用蒸餾水定容至1000毫升。）二、 酶液的制備：稱取0.5g樣品放入研缽中，加2毫升 0.05M PH

2、=7.8的磷酸緩沖液及少量石英砂，冰浴研磨，勻漿倒入10毫升離心管中，再加3毫升磷酸緩沖液沖洗研缽，4冷凍離心20分鐘（若做可溶性蛋白，轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘，若不做，則10000轉(zhuǎn)/分鐘），上清液（酶液）倒入試管中，置于040C下保存待用。三、 SOD的測(cè)定：1.SOD反應(yīng)液的配制： 母液的配制：（1）0. 05M 磷酸緩沖液（PH=7.8）：A液21.25ml+B液228.25ml定容至1000ml; (2) 130mM Met(甲硫氨酸)：取1.9399克Met 用磷酸緩沖液定容至100ml；棕色瓶避光4保存。 （3）750M四氮唑藍(lán)（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸緩沖液定容至

3、100ml；棕色瓶避光4保存。 (4) 100M EDTA-Na2: 取0.0372g EDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至1000ml，棕色瓶避光保存； (5) 20M FD (核黃素): 0.00753gFD用蒸餾水定容至1000ml。隨用隨配。棕色瓶避光保存；SOD反應(yīng)混液：磷酸緩沖液：Met：NBT：EDTA-Na2：H2O的比例為15：3：3：3：2.5，按母液順序配制，然后依次加入核黃素和酶液。2.SOD的測(cè)定：取型號(hào)相同的試管，吸取20微升的酶液，加入3毫升，4000Lux照光30分鐘，同時(shí)取兩支試管，一支做對(duì)照，一支做空白（對(duì)照、空白不加酶液，以緩沖液代替）；空白置暗處，對(duì)照（C

4、K）與酶液同置于4000Lux條件下照光30分鐘，反應(yīng)后遮光保存，以空白調(diào)零，560nm比色。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)三次（3試驗(yàn)+3空白+3對(duì)照）3.結(jié)果計(jì)算 SOD總活性（吸光度/g·FW）=（ACKAE）×V（W×0.5 ×Vt×ACK）單位：NBT光還原50%為單位 SOD 比活性（酶單位/mg蛋白）= SOD總活性/蛋白質(zhì)濃度SOD總活性以鮮重酶單位每克表示（u/g FW）；比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示；Ack為照光對(duì)照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積；Vt為測(cè)定時(shí)的酶液用量（ml，30ul）；W為樣品鮮重（g）；蛋白質(zhì)含量

5、單位為mg/g。注意：1.要10ml離心管，不要大試管，否則槍頭夠不著，不好吸； 2提取液預(yù)冷； 3. 測(cè)的樣品值要在最大管的一半左右才合適，否則要調(diào)整酶量 4.照光時(shí)間和強(qiáng)度嚴(yán)格控制，試管要透明，質(zhì)地均一。四、POD的測(cè)定：1. 0.1M PH6.0磷酸緩沖液的配制：A液219.25+B液30.75，定容至1000毫升；2. POD反應(yīng)液的配制：0.1M PH 6.0的磷酸緩沖液50毫升于燒杯中，加入愈創(chuàng)木酚28微升，磁力攪拌器加熱攪拌使之完全溶解，冷卻后加入30%H2O219微升混合，保存于冰箱中。3. POD的測(cè)定：20微升酶液+3毫升反應(yīng)液于比色皿中，以PBS為對(duì)照調(diào)零，在470nm下

6、每隔1分鐘讀數(shù)一次，共讀三次，以每分鐘吸光度變化值（A470/min·mg pr或A470/ mgFW）表示酶活力的大小。結(jié)果計(jì)算：POD活性POD=（A470×Vt）/（W×Vs×0.01×t） (u/g min) A470：為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；t為反應(yīng)時(shí)間(min)；Vt為提取酶液總體積（ml）；Vs為測(cè)定時(shí)取用酶液體積（ml）五、MDA的測(cè)定： 1.MDA反應(yīng)液的配置：0.6克TBA（硫代巴比妥酸），先用少量1MNaOH溶解，用10%TCA（三氯乙酸）定容至100毫升。1. MDA的測(cè)定：1毫升酶液+2毫升0.6

7、%的TBA，封口沸水浴15分鐘，迅速冷卻后1500轉(zhuǎn)10min離心，取上清液，在600、532、450nm 三個(gè)波長(zhǎng)下比色。2.結(jié)果計(jì)算：MDA濃度C (umol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450MDA含量(umol/g FW)=C×V/W V為提取液體積(ml)，W為樣品鮮重(g)六、可溶性蛋白的測(cè)定反應(yīng)液配制：0.1克G-250溶于50毫升90%乙醇中，加入100毫升85%磷酸，定容至1000毫升，在過夜后過濾并貯于棕色瓶中，常溫下可在暗中保存一個(gè)月。100g/ml牛血清蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液: 10mg BSA,0.9氯化鈉溶解，定容至100ml測(cè)定

8、：20微升酶液+80l，0.05M，pH7.8磷酸緩沖液+2.9毫升G-250放置2分鐘，595納米比色，同時(shí)做空白（100微升緩沖液+3毫升G-250為對(duì)照調(diào)零）。結(jié)果計(jì)算：可溶性蛋白可溶性蛋白質(zhì)含量（mg/g）=(C×VT)/(W×VS×1000)C為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的蛋白質(zhì)含量（g）；VT為提取液總體積（稀釋后的體積ml）；VS為測(cè)定時(shí)所用提取液體積（ml，20l）；W為樣品鮮重（g） 七、脯氨酸含量的測(cè)定試劑配制：0.3%磺基水楊酸：3克磺基水楊酸，定容至100毫升：2.5%酸性茚三酮（現(xiàn)配）：60 ml冰醋酸、16.4 ml磷酸加蒸餾水定容至100 ml，再

9、加入2.5 g茚三酮，溶解后避光保存標(biāo)準(zhǔn)脯氨酸液：25mg脯氨酸定容至100nl。測(cè)定：0.3克葉片，加入5毫升磺基水楊酸研磨提取，倒入離心管，沸水浴10分鐘，冷卻3000轉(zhuǎn)離心10min，吸取濾液2毫升（同時(shí)作空白，吸取2毫升蒸餾水）、2毫升冰醋酸和3毫升酸性茚三酮，沸水浴40分鐘，冷卻，加入5毫升甲苯，充分振蕩，靜止分層，取上層甲苯溶液于比色皿中，以甲苯為空白對(duì)照，520納米下比色。結(jié)果計(jì)算：脯氨酸含量（g/g鮮重）=C×V/Va/W八、植物細(xì)胞質(zhì)膜透性的測(cè)定（電導(dǎo)儀法）（1）取新鮮葉片或根系（不能萎蔫）0.3g，用自來水沖洗表面污漬，再用去離子水沖洗幾遍后用吸水紙吸干水分；（2）樣品剪碎（也可打孔取樣）放入試管（或15ml大離心管）中，加10ml去離子水，在室溫下放置3h，期間多次搖動(dòng)，使葉片充分吸水后測(cè)定溶液電導(dǎo)率(R1)；（3）再放入恒溫水浴鍋中在100沸水浴中煮20min以殺死葉片組織，用冷水冷卻到室溫后測(cè)定溶液電導(dǎo)率(R2)；（4）用公式計(jì)算質(zhì)膜相對(duì)透性（用相對(duì)電導(dǎo)率表示）：相對(duì)電導(dǎo)率（%）=R1/R2×100%還可以計(jì)算植株傷害程度： 傷害率=（處理電導(dǎo)率對(duì)照電導(dǎo)率）/（煮沸電導(dǎo)率對(duì)照電導(dǎo)率）×100%九、可溶性糖105殺青30 min，85烘干至恒重用于可溶性糖的測(cè)定 將處理后的葉片稱取0.02