流式細(xì)胞技術(shù)和流式細(xì)胞儀

1、流式細(xì)胞技術(shù)和流式細(xì)胞儀 流式細(xì)胞儀首頁 第十一章 流式細(xì)胞技術(shù)和流式細(xì)胞儀一、熒光染料在流式細(xì)胞術(shù)中的應(yīng)用（一）碘化丙啶染色碘化丙啶(propiolium iodide，PI)能嵌入DNA雙螺旋中，可使熒光強度增加約20倍，以488nm波長激發(fā)，DNA/PI復(fù)合物最大的放射波長約為615nm。1. 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞DNA含量測定方法（1）從C57BL/6小鼠上切除腫塊，在培育皿內(nèi)用PBS沖洗。（2）去除結(jié)締組織及脂肪，剪碎腫塊。（3）小碎片移入1.20×38mm注射針,加壓使其通過,于4條件下重懸細(xì)胞于HBSS中。（4）將200300L細(xì)胞懸液(5×105細(xì)胞/mL

2、)中加入3mL PI(50g/mL)，染色3LL細(xì)胞，于4存放2030分鐘。（5）測定580750nm之間的放射熒光，以去除末結(jié)合PI產(chǎn)生的激發(fā)光與放射光譜線之間的重疊部分。注：PI染色液：0.1%檸檬酸鈉1000mL+PI 5mg + 1% Nonide P40水。2.培育細(xì)胞DNA的流式細(xì)胞儀分析（1）從培育皿中吸去培育基，以HBSS沖洗二次。（2）加入PI5mL于培育皿中，在4放10分鐘。（3）用吸管反復(fù)次打細(xì)胞，使細(xì)胞破壞，胞核釋放出來，再行流式細(xì)胞儀分析。3. 完整細(xì)胞DNA的PI染色（1）70%乙醇固定的細(xì)胞懸液，離心，去固定液。（2）室溫條件下加入PI染色一批細(xì)胞（105106細(xì)

3、胞/mL），時間為30分鐘，然后行流式細(xì)胞儀分析。（二）吖啶橙染色1. DNA和RNA的鑒別染色利用吖啶橙的變色特性可鑒別DNA和RNA。吖啶橙作為一種熒光染料已被用于染色固定，非固定細(xì)胞核酸，或作溶酶體的一種標(biāo)記。觀察死亡細(xì)胞熒光變色性變化以及區(qū)分分裂細(xì)胞和靜止細(xì)胞群體。雖然測定DNA和RNA含量時較難獲得好的重復(fù)性結(jié)果，但該方法已被很多實驗室廣泛接受。方法如下：（1）試劑：1）溶液A：低溫保存，穩(wěn)定期約2周。Triton X-100(0.1%) 0.1mL，1mol/L HCL 8mL 1mol/L NaCL 15ml蒸餾水76mL，PH 1.5（100mL）2）溶液B：穩(wěn)定期數(shù)月，最好除

4、菌以后(高壓或過濾)貯存。0.01mol/L EDTA10mL,1mol/L NaCL 15mL0.4mol/L Na2HPO4 31.5mL,0.2mol/L檸檬酸18.5mL蒸餾水24mL，總體積為99mL pH6.03）吖啶橙母液：用吖啶橙/蒸餾水配成1mg/mL(致癌物，應(yīng)當(dāng)心)，吖啶橙應(yīng)用液0.1mL母液加9.9mL溶液B稀釋。4）注意事項：儀器鞘流系統(tǒng)應(yīng)保持4。氬激光激發(fā)波488nm，紅色熒光為DNA(F>600nm),綠色熒光為RNA或單鏈DNA(F>530nm)（2）方法：1）用含15%血清的PBS配制細(xì)胞懸液，取0.2mL(8×106細(xì)胞/mL)，加入0

5、.4mL溶液A，4放置4560秒。2）加1.2mL含吖啶橙的溶液B，室溫2分鐘。3）應(yīng)在加入溶液B后10分鐘內(nèi)進流式細(xì)胞儀分析。（3）注意事項：（1）細(xì)胞數(shù)保持恒定；（2）核酸與吖啶橙的比例；（3）染色時間及溫度。2. 單鏈和雙鏈DNA的鑒別染色（1）試劑：1）HBSS內(nèi)含1000u/mL RNA酶A，0.2mol/L KCl pH1.352）吖啶橙用0.1mol/L檸檬酸配成5 mg/L(16.7m),0.2mol/L Na2HPO4緩沖液，pH2.6。（2）方法1）2×106細(xì)胞懸于1mL HBSS/RNase液中。2）37溫育1小時。3）將0.2mL細(xì)胞懸液(含4×1

6、05細(xì)胞始終懸浮于HBSS/RNase)與0.5mL 0.2mol/L KCl(pH1.35)混勻，20 30分鐘。4）加2mL吖啶橙染色2分鐘。5）綠色熒光(530nm)和紅色熒光(600nm)分別代表細(xì)胞中單鏈及雙鏈DNA含量。（三）Hoechst33258染色以溴化脫氧尿嘧啶(Brdu)和Hoechst33258染料進行細(xì)胞周期分析。1.試劑：（1）用培育基配制33 mg/L Brdu及脫氧細(xì)胞苷26.4g/mL。（2）染色液：Hoechst33258溶于PBS，細(xì)胞染色24小時后進行分析，據(jù)報道染色的穩(wěn)定時間在30分鐘至24小時之間。2.方法：（1）將Brdu溶液按1:10加入細(xì)胞培育

7、液中。（2）依據(jù)細(xì)胞周期時間不同，選擇不同時間培育的細(xì)胞。（3）孵育后，搖散細(xì)胞以傳代培育。（4）直接用染液重懸細(xì)胞，進入流式細(xì)胞儀分析。Hoechst33258熒光值在410580nm之間，需用330360nm紫外光激發(fā)。應(yīng)特異性結(jié)合腺嘌呤-胸腺嘧啶堿基對。因此，不僅特異性標(biāo)記DNA，亦可標(biāo)記胸腺嘧啶。在細(xì)胞周期分析時，在與細(xì)胞孵育過程加入Brdu,Brdu可替代DNA中的胸腺嘧啶，因此，處于合成期內(nèi)的細(xì)胞表面上仍保持二倍體狀態(tài)，并在分裂后G1峰的半峰處產(chǎn)生一新峰，此項技術(shù)可用于直接測定細(xì)胞G2期及分裂時間。（四）Hoechst33342染色Hoechst33342染色活細(xì)胞DNA1.試劑：

8、Hoechst 33342,用蒸餾水配成0.25mol/L。2.方法：（1）制備106/m細(xì)胞懸液，以Hoechst33342染色，濃度為510 mg/L ，室溫下20分鐘。（2）分析前切勿洗滌細(xì)胞。Hoechst33342可用作細(xì)胞DNA的活體染料，據(jù)信可在保持細(xì)胞活性的同時，呈現(xiàn)出相當(dāng)好的DNA化學(xué)計量關(guān)系，激發(fā)波在紫外范圍350363nm之間，放射波則在450nm處。（五）異硫氰酸熒光素染色以異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyante，F(xiàn)ITC）染色蛋白質(zhì)。1.試劑： FITC用含40 mg/L RNase的PBS配成0.11.0 mg/L濃度。2.方法：(1)染

9、色前用終濃度70%乙醇固定細(xì)胞，至少18小時。(2)離心固定細(xì)胞，棄去固定液。(3)室溫下用FIFC染色細(xì)胞蛋白，30分鐘。(4)流式細(xì)胞儀分析，使用氬激光，激發(fā)波長488nm，熒光放射波長515535nm。也可于固定細(xì)胞中，以18 mg/L (0.1%檸檬酸鹽配制)和0.05 mg/L FIFC(含40 mg/L RNase，PBS配制)染色20分鐘以上可對DNA和蛋白質(zhì)雙重染色，分別呈現(xiàn)紅色熒光（DNA）和綠色熒光（蛋白質(zhì)）。（六）若丹明染色若丹明標(biāo)記單克隆抗體的應(yīng)用該技術(shù)既可用于檢測帶有特異性膜抗原的細(xì)胞，可用若丹明標(biāo)記單克隆抗體處理上述細(xì)胞；也可用于測定胞漿中的蛋白質(zhì)(如凋亡BCL-2

10、蛋白，抗病毒蛋白MXA等)。1.說明：用磷酸鹽緩沖液Eagle's MEM稀釋FITC連接的抗體內(nèi)含0.1%疊氮鈉、2%牛血清。為判定FITC抗體的最適度的稀釋濃度，向微量滴定板的細(xì)胞中加入50L不同濃度的稀釋液，再以熒光顯微鏡確認(rèn)最佳染色濃度。使用抗人LEU-I抗體分析時，應(yīng)稀釋成5 mg/L或 0.25 mg/L。無論鼠或人細(xì)胞在2×107濃度時其存活率應(yīng)在90%以上。2.方法：(1)于微量滴定板加入50L若丹明標(biāo)記的抗體，再加入50L細(xì)胞懸液，混勻。(2)冰浴45分鐘，離心滴定板（1500r/min 10分鐘）。(3)棄上清，以培育基100L洗滌細(xì)胞沉淀2次，每次洗滌后

11、用1500r/min 10分鐘，棄上清。(4)以1ml預(yù)冷的培育基配成1×106細(xì)胞/mL的已染色細(xì)胞懸液，進樣前持續(xù)保持冷環(huán)境(4)。 （七）光輝霉素和PI的雙標(biāo)記DNA染色在熒光抗生素光輝霉素和PI聯(lián)合染色過程中，光輝霉素的供體分子被PI的受體分子接受產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移，該染色技術(shù)主要用于實體腫瘤組織，精子細(xì)胞及婦科標(biāo)本，同時也適用于體外培育的細(xì)胞。1.分離制備的細(xì)胞懸液即可使用，若用70%乙醇固定可保存一周。2以PI/光輝霉素染色，4 1小時（PI為10 mg/L、光輝霉素為10 mg/L）。3染色后進樣，以100W汞燈作為激光光源，使用BG123nm阻斷濾片，疊加K590型高通濾法

12、。（八）PI和FITC對DNA與癌基因探針雙標(biāo)記測定1. 說明：這種測定是先用癌基因探針按間接免疫熒光染色法標(biāo)記癌基因表達產(chǎn)物，然后用PI標(biāo)記DNA，現(xiàn)以商量白血病細(xì)胞增殖與癌基因的關(guān)系說明操作步驟：2.方法：（1）制備白血病細(xì)胞懸液，用100%甲醇在-20固定10分鐘。(2) 取50l50 mg/L的癌基因探針Y13-25(它是一種廣譜單克隆抗體，可特異性地直接與N-ras，Ki-ras和Ha-ras三種癌基因編碼的21Kd蛋白相結(jié)合)，4作用3045分鐘。(3) 用PB離心洗滌2次，重懸浮于50L HBSS中(含0.1%疊氮鈉和2%小牛血清)。(4) 加入50L 1:200兔抗鼠IgG，4

13、放置3045分鐘。(5) 同(3)洗滌后加入50L 1:40的FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，4反應(yīng)3045分鐘。(6) 同(3)洗滌后，細(xì)胞用RNA酶消化，室溫2030分鐘。(7) 同(3)洗滌后，用PI染液染20分鐘。(8) 同(3)洗滌后，用488nm激發(fā)波長測定。FITC染色顯示ras癌基因表達產(chǎn)物，PI染色顯示DNA含量。3. 注意事項：（1）制備樣品時，離心次數(shù)不宜過多，防止細(xì)胞丟失和凝集；（2）細(xì)胞固定時間不宜過長，不要用冰醋酸、乙醇、苦咪酸及汞固定劑；（3）為了降低本底，應(yīng)將細(xì)胞表面未結(jié)合的熒光染料洗凈；（4）進行雙標(biāo)記沉淀時，應(yīng)盡量選用激發(fā)光譜不接近的熒光色素。二、記活細(xì)胞免疫熒

14、光技術(shù)流式細(xì)胞儀標(biāo)本的制備流式細(xì)胞儀(FCM)是八十年月集單克隆抗體、熒光化學(xué)、激光、計算機等高技術(shù)進展起來的一種先進儀器，已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、生物化學(xué)、生物學(xué)、腫瘤學(xué)以及血液學(xué)等方面的商量和臨床常規(guī)工作。其中檢測人白細(xì)胞表面標(biāo)志可對白血病、淋巴瘤作用迅速正確的診斷，對淋巴細(xì)胞群和亞群進行精確分類，還能分離純化某一群或亞群細(xì)胞?；罴?xì)胞免疫熒光技術(shù)是用于FCM檢測的標(biāo)本籌備，染色后也能在熒光顯微鏡下進行觀察，在某些實驗條件下，活細(xì)胞免疫熒光染色后的特異性和敏感性要優(yōu)于滴片固定的常規(guī)間接免疫熒光的結(jié)果。(一)原理活細(xì)胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細(xì)胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合，

15、再用熒光標(biāo)記的其次抗體結(jié)合，依據(jù)所測定的熒光強度和陽性百分率即可知相應(yīng)抗原的密度和分布。(二)操作步驟制備活性高的細(xì)胞懸液(培育細(xì)胞系、外周血單個核細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞等均可用于本法)用10FCSRPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10×107ml取40l細(xì)胞懸液加入預(yù)先有特異性McAb(550l)的小玻璃管或塑料離心管，再加50l 120(用DPBS稀釋)滅活正常兔血清 4 30min用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2ml左右1000rpm×5min 棄上清，加入50l工作濃度的羊抗鼠(或兔抗鼠)熒光標(biāo)記物，充分振搖 4 30min用洗滌液洗滌2次，每次加液2ml

16、左右，1000rpm×5min加適量固定液(如為FCM制備標(biāo)本，一般加入1ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察，視細(xì)胞濃度加入100500l固定液)FCM檢測或制片后熒光顯微鏡下觀察(標(biāo)本在試管中可保存57天)(三)試劑和器材1.各種特異性單克隆抗體。 2.熒光標(biāo)記的羊抗鼠或兔抗鼠其次抗體，滅活正常兔血清。 3.10 FCS RPMI1640, DPBS、洗滌液、固定液(見附錄)。 4.玻璃管、塑料管、離心機、熒光顯微鏡等。(四)注意事項 1.整個操作在4下進行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN，上述實驗條件是防止一抗結(jié)合細(xì)胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。 2.洗滌要充分，以避開游離抗體封閉二抗與細(xì)胞膜上一抗相結(jié)合，消失假陰性。 3.加適量正常兔血清可封閉某些細(xì)胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。 4.細(xì)胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。附: 1. DPBS (×10, 貯存液)、NaCl 80g、KCl 2g 、蒸餾水加至1000ml，NaHPO 11.5g 臨用時用蒸餾水110稀釋，KHPO 2g 2.洗滌液：DPBS 900ml、FCS 50ml (終濃度5)、4NaN 50ml (終濃度0.2) 3.固定液：DPBS 1000ml、