肝癌細(xì)胞凋亡調(diào)控的研究進(jìn)展

1、【摘要】 肝癌（hepatocellular carcinoma, hcc）為我國常見惡性腫瘤之一。體內(nèi)的動物實(shí)驗(yàn)以及未經(jīng) 治療 的hcc均存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。 細(xì)胞凋亡是一個(gè)簡單的 網(wǎng)絡(luò) 系統(tǒng), 受多系統(tǒng)、多水平、多因素共同調(diào)控。誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡的各種 方法 在 理論 上來說就可以治療肝癌。本文綜合論述了有關(guān)參加肝癌細(xì)胞凋亡的一些因素如p53, bcl-2, survivin，caspase，trail， cox-2在調(diào)整細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡平衡中的相互作用， 以及某些抗腫瘤治療的可能機(jī)制。【關(guān)鍵詞】 細(xì)胞凋亡; p53; survivin; caspase; trail; cox-2肝癌（hep

2、atocellularcarcinoma, hcc）有原發(fā)性肝癌和繼發(fā)性肝癌之分， 原發(fā)性肝癌為我國常見惡性腫瘤之一。體外培育的肝癌細(xì)胞, 體內(nèi)的動物實(shí)驗(yàn)以及未經(jīng)治療的hcc均存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象, 凋亡指數(shù)的凹凸直接關(guān)系到肝癌患者的預(yù)后。細(xì)胞凋亡是機(jī)體清除年輕、異常細(xì)胞, 維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要生理功能。免疫應(yīng)答、造血系統(tǒng)的調(diào)控、胚胎的發(fā)育、腫瘤的形成都與細(xì)胞凋亡息息相關(guān)。腫瘤的發(fā)生、 進(jìn)展 與正常的細(xì)胞凋亡過程被抑制， 破壞了細(xì)胞增殖與凋亡之間的平衡有肯定關(guān)系。 現(xiàn)在廣泛認(rèn)為細(xì)胞凋亡是一個(gè)簡單的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng), 受多系統(tǒng)、多水平、多因素、多基因共同調(diào)控。誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡的各種方法在理論上來說就可以治療肝

3、癌。本文簡潔介紹有關(guān)參加肝癌細(xì)胞凋亡的一些特異性（p53，fas，bcl-2/bax基因等）和非特異性信號分子以及其他因素在調(diào)整細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡平衡中的相互作用， 以及某些抗腫瘤治療的可能機(jī)制。1. 肝癌細(xì)胞凋亡通路的基因調(diào)控細(xì)胞凋亡是一個(gè)多基因調(diào)控的簡單過程， 主要是由誘導(dǎo)基因、 抑制基因和雙向掌握基因相互作用的結(jié)果。調(diào)控肝癌細(xì)胞凋亡的基因分為兩大類, 一類是抑制肝癌細(xì)胞凋亡的基因, 主要有bcl-2和生存素（survivin）；另一類是促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)基因, 有p53、fas/fasl、trail等。通過這些基因的表達(dá)和相互作用, 對肝癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控起著重要的作用。11 p53基

4、因 p53基因是 目前 為止發(fā)現(xiàn)的最重要的抑癌基因, p53全長20kb, 位于人染色體17q13.1,由11個(gè)外顯子構(gòu)成, 是細(xì)胞生長周期中的負(fù)調(diào)控因子, 對細(xì)胞周期的調(diào)控、dna的修復(fù)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等有重要生物學(xué)作用。幾乎全部的腫瘤都存在p53的突變, p53的突變不只是引起野生型p53蛋白的失活, 還可能產(chǎn)生功能不同的突變p53蛋白。突變的p53具有促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化, 引起腫瘤細(xì)胞的大量增殖,抑制細(xì)胞的凋亡。據(jù)統(tǒng)計(jì)p53在hcc中的突變率在（69.37±18.81）%, 分化越差, 突變率越高3, 由此產(chǎn)生的大量突變p53蛋白將 影響 下游基因的調(diào)控, 如bcl-2、bax等

5、。12 fas基因 fas/fasl系統(tǒng)是機(jī)體重要的細(xì)胞凋亡系統(tǒng),它包括fas、fasl 及它們的可溶性形式sfas、sfasl。fas蛋白為型跨膜蛋白,屬于腫瘤壞死因子家族,分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)。胞外區(qū)的n端有一個(gè)約含80個(gè)氨基酸的死亡域, 與凋亡信號傳導(dǎo)有關(guān)。fas主要以膜受體形式存在, 可通過轉(zhuǎn)錄水平的不同剪接產(chǎn)生多種可溶性fas分子（sfas）, 它與fas較相像, 但缺少跨膜結(jié)構(gòu)域, 與fasl結(jié)合后可對fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起重要的負(fù)調(diào)節(jié)作用。一般認(rèn)為導(dǎo)致肝癌細(xì)胞凋亡是由于fas受體的激活和之后的caspase-8的激活， 或者通過fasl的上調(diào)9,10。部分抗肝癌藥物（如干擾

6、素）即是通過該途徑11。fas在hcc中表達(dá)明顯削減, 甚至完全丟失,而且fas的表達(dá)與hcc的分化程度有關(guān),分化程度愈低, fas表達(dá)愈少。多數(shù)hcc 對fas/fasl介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡耐受,可能是hcc 上的fas表達(dá)較少, 或者sfas競爭性地與fasl結(jié)合, 阻斷了fas/fasl介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。有報(bào)道hcc表達(dá)高水平的fas和fasl在同一個(gè)區(qū)域, 且對fas/fasl介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡耐受12, 認(rèn)為可能是hcc上的fasl與抗腫瘤淋巴細(xì)胞fas結(jié)合, 引起淋巴細(xì)胞的死亡, 逃脫免疫監(jiān)視；fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡受多種蛋白及酶類影響, 如腫瘤細(xì)胞上的fas相關(guān)磷酸脂酶-1、flip（flic

7、e/caspase-8inhibitoryprotein）可與fas受體結(jié)合, 抑制fas介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。bcl-2、p53以及一些癌基因?qū)as也具有重要的調(diào)節(jié)作用13。bcl-2在急性肝炎的膽管中存在，在肝癌中失表達(dá)。其高表達(dá)可導(dǎo)致肝癌細(xì)胞對多種促凋亡因素如藥物、射線及cytokin等耐藥，而誘導(dǎo)劑（天花粉、氧化砷）通過下調(diào)腫瘤細(xì)胞bcl-2的表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡。bax高表達(dá)能增強(qiáng)由adriamycin誘導(dǎo)的 hcc-9204細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞對凋亡的敏感性18。14 survivin基因 survivin是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis pro

8、tein, iap）的新成員，與其他iap成員不同，結(jié)構(gòu)獨(dú)特，只含有一個(gè)桿狀病毒iap重復(fù)序列（baculovirus iap repeat）和非鋅指結(jié)構(gòu)，survivin位于人染色體17q25,含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子,相對分子質(zhì)量為25×10319。商量發(fā)現(xiàn)survivin 在肝癌中具有選擇性表達(dá)的特性，這一特性為其在原發(fā)性肝癌中治療靶點(diǎn)作用供應(yīng)了理論依據(jù)。survivin與凋亡抑制呈正相關(guān)，與預(yù)后親密相關(guān)。 ikeguchi等20對57例hcc檢測發(fā)現(xiàn),41%的肝癌組織有survivin mrna的表達(dá),其表達(dá)與年齡、性別、腫瘤大小無關(guān),在正常肝組織中沒有檢測到,surviv

9、in表達(dá)陽性的肝癌組織的凋亡指數(shù)顯著低于survivin表達(dá)陰性的肝癌組織。但是目前對survivin的功能尚存爭議。一些商量顯示, survivin對細(xì)胞凋亡以及增殖并無明顯影響。另外一些商量則顯示，survivin具有抑制凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的雙重功能,有助于多種腫瘤細(xì)胞低預(yù)各種凋亡刺激。survivin抑制凋亡的機(jī)制是通過bir功能區(qū)直接影響凋亡信號傳導(dǎo)通路的終末效應(yīng)分子caspase-3或caspase-7的活化,從而抑制多種上游信號所誘導(dǎo)的凋亡, 也發(fā)現(xiàn)survivin抑制細(xì)胞色素c從線粒體釋放, 阻斷上游信號分子caspase-9的活化,從而阻斷細(xì)胞凋亡信號的傳導(dǎo) 19,27。gao

10、yan等21設(shè)計(jì)一對survivin-sirna,體外轉(zhuǎn)錄制備sirna, 觀察了 應(yīng)用 rnai技術(shù)靶向封閉survivin基因?qū)Ω伟┘?xì)胞株hepg2增殖和凋亡的影響, 細(xì)胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率并無變化。而王穎等22發(fā)現(xiàn)不同濃度 survivin sirna 轉(zhuǎn)染能下調(diào)survivin 蛋白和 mrna 表達(dá)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，增加肝癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性,提示接受基因技術(shù)封閉 survivin 蛋白表達(dá)，可以解除 survivin 對凋亡的抑制作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療的目的。另外據(jù) 文獻(xiàn) 報(bào)道, survivin反義核酸能夠明顯誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制增值，是腫

11、瘤反義期治療的較抱負(fù)的靶基因。chen等23發(fā)現(xiàn), 在smmc-7721 細(xì)胞中caspase-3的活性水平極低。這有利于肝癌細(xì)胞躲避凋亡,維持較高的增殖活性。而在survivin asodn 轉(zhuǎn)染后, caspase-3 活性水平呈劑量依靠性上升, 說明在smmc-7721 細(xì)胞中caspase-3 的低活性狀態(tài)可能是由于survivin 表達(dá)所致；以asodn 封閉survivin基因表達(dá)導(dǎo)致的caspase-3活化, 是其誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。cheng等24發(fā)現(xiàn)rnai能降低smmc-7721 細(xì)胞中survivin基因表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞的生長。盡管sur

12、vivin對細(xì)胞凋亡以及增殖的影響目前還存在爭議，已有結(jié)果顯示survivin機(jī)制的商量有助于對肝癌細(xì)胞凋亡的生疏，為抗癌治療供應(yīng)有效靶點(diǎn)有著重要的意義。2. 調(diào)控肝癌細(xì)胞凋亡的其他因素除基因外，很多酶、信號分子等參加凋亡的啟動和調(diào)節(jié)，如caspase家族，tgf/tgf受體, tnf家族, cox-2等，調(diào)整著細(xì)胞增殖與凋亡的平衡。2.1. 半胱天冬酶（caspase）家族 細(xì)胞凋亡的核心成分是半胱氨酸蛋白酶家族，凋亡可能就是蛋白酶級聯(lián)切割的過程。其中商量最多，功能相對較明確的為caspase-3, 是哺乳動物細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶之一，為凋亡的效應(yīng)分子，被稱為凋亡的“執(zhí)行者”25。經(jīng)典的細(xì)胞

13、凋亡途徑有兩條，分別是細(xì)胞外途徑（細(xì)胞表面死亡受體途徑）和細(xì)胞內(nèi)途徑（線粒體引發(fā)途徑）。在細(xì)胞外途徑中，死亡信號的傳導(dǎo)依靠于死亡配體與受體（如tnf-和tnfr, fasl和fas）的結(jié)合，接著死亡受體的死亡結(jié)構(gòu)域（dd）與信號傳導(dǎo)分子（如fadd）結(jié)合，而fadd又可與caspase-8酶原的ded相連接，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（disc），隨之caspase-8被激活，它通過裂解bid使線粒體釋放細(xì)胞色素c，或直接作用caspase-3及其他下游的caspase。有商量顯示激活的caspase-3可裂解相應(yīng)的胞核內(nèi)底物dna修復(fù)酶（poly adp-ribose polymerase， p

14、arp），使parp失去對dna的修復(fù)功能，導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)向凋亡 26。商量發(fā)現(xiàn)在fas介導(dǎo)肝癌細(xì)胞系凋亡過程中，caspase-3活性增高，使用caspase-3抑制劑devdcho能顯著抑制caspase-3的活化，藉此抑制fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。而ice抑制劑yvadcho則不能抑制fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。提示在fas介導(dǎo)的人肝癌細(xì)胞系凋亡過程中，主要起作用的是caspase-3，而不是icea。于合成紫花茄皂貳誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株bcl-7402凋亡的體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，紫花茄皂貳通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素c的表達(dá)水平而激活caspase-3，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡17。nk-104是日本新近研制的第三代hmg

15、-coa還原酶抑制劑，商量結(jié)果表明10 mol/l nk-104能夠增強(qiáng)caspase-3的活性，加入mev能夠消除nk-104的這種誘導(dǎo)作用 27。caspase可被多種物質(zhì)激活，一般認(rèn)為化療藥物以及高滲引起細(xì)胞凋亡大多通過激活caspase-3起作用28。 低濃度的谷胱甘肽-阿霉素（gsh-dxr）比dxr更有效地引起鼠肝細(xì)胞（ah66）的凋亡，并能提高caspase-3大約100倍。兩種藥物處理12和15h后可見caspase-3的活性增加和dna的斷裂29?？梢姷蛲銮案鞣N強(qiáng)信號激活caspase-3是凋亡突增的必經(jīng)途徑。在細(xì)胞內(nèi)途徑中，細(xì)胞內(nèi)的死亡信號，如dna損傷、毒素、bax、癌基

16、因抑制劑、紫外照耀和atp耗竭等均可誘發(fā)線粒體釋放細(xì)胞色素c（ cyt c）到胞質(zhì)，隨即 atp 依靠性激活凋亡蛋白水解酶活化因子-1（apoptotic protease-activating factor1，apaf-1）。 在這一途徑中， cyt c 的釋放是該調(diào)節(jié)通路中的關(guān)鍵大事，它可導(dǎo)致由 cyt c，apaf-1 和 procaspase-9 構(gòu)成的“凋亡體”（apoptosome）形成，從而激活 caspase-9。 活化的caspase-9 從“凋亡體”中釋放出來，進(jìn)而引發(fā) caspase級聯(lián)放大反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。以往商量中已證實(shí)氟尿嘧啶可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，并有外源性通路

17、上的相關(guān)基因參加調(diào)控。最近商量顯示在氟尿嘧啶誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過程中caspase-9 被活化，活性明顯增強(qiáng)，caspase-9 抑制劑可阻斷這一過程。表明 caspase-9參加了氟尿嘧啶誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡30。 cyt c 由核基因編碼，在核糖體中合成前體物阿樸細(xì)胞色素 c（apocytochrome c）后轉(zhuǎn)運(yùn)入線粒體。 diekert 等31發(fā)現(xiàn)，在apocytochrome c 轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體時(shí)需要 tom 復(fù)合體，并認(rèn)為 tom 復(fù)合體是包括 apocytochrome c 在內(nèi)的細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)入線粒體的共同通路。在三氧化二砷（as2o3）誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的基因 分析 中顯示線粒

18、體外膜受體tom20基因表達(dá)上調(diào)。綜上所述，caspase-3、 caspase-9 的活化被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。目前的關(guān)鍵 問題 是caspase-3、 caspase-9等在多種因素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡中是否起獨(dú)立作用，其表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的凋亡是否存在必定關(guān)系，另外，其激活機(jī)制及聯(lián)系尚未清晰，有待于我們進(jìn)一步的深化商量。2.2. 壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumornecrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand, trail）trail是腫瘤壞死因子（tumornecrosisfamily, tnf）家族成員, 可與tnf受體超家族

19、成員類似的胞漿死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合, 通過死亡結(jié)構(gòu)域激發(fā)和傳導(dǎo)死亡信號, 激活caspase蛋白酶級聯(lián)反應(yīng), 導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。trail的一個(gè)顯著特點(diǎn)就是能在各種轉(zhuǎn)化細(xì)胞中選擇性導(dǎo)致凋亡，但在正常組織中卻無此作用。在對肝癌的商量中發(fā)現(xiàn), 盡管大部分的人類腫瘤對trail誘導(dǎo)的凋亡敏感, 但hcc對trail誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡明顯耐受32。trail可以誘導(dǎo)nf-b表達(dá)的增高, 后者可抗細(xì)胞的凋亡。有學(xué)者用特異性的nf-b抑制劑sn50 作用于trail 誘導(dǎo)的hcc細(xì)胞凋亡, 發(fā)現(xiàn)該抑制劑對trail誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡沒有多大影響, 表明trail誘導(dǎo)的nf-b活性上升與trail對hcc誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡耐受并不相關(guān)聯(lián)。 認(rèn)為hcc對trail誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡耐受可能是腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在凋亡抑制劑, 如cfilp（caspase8/fliceinhibitory protein, cfilp）、bcl-xl、bax、bid等33。 也有商量發(fā)現(xiàn)經(jīng)trail處理后，肝癌細(xì)胞消失了凋亡的同時(shí)bcl-2, bcl-xl抗凋亡蛋白的表達(dá)均呈上升趨勢，而促凋亡蛋白bax的表達(dá)卻呈現(xiàn)出下降的趨勢。深化商量發(fā)現(xiàn)經(jīng)trail處理后細(xì)胞的nf