經(jīng)典液相色譜法(2010)

1、1第第7 7章章 經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相色譜包括經(jīng)典液相色譜包括柱色譜柱色譜和和平面色譜平面色譜。 以液體為流動(dòng)相的色譜稱為液相色譜。按以液體為流動(dòng)相的色譜稱為液相色譜。按固定相的規(guī)格、流動(dòng)相的驅(qū)動(dòng)力、分離效能和周固定相的規(guī)格、流動(dòng)相的驅(qū)動(dòng)力、分離效能和周期不同，又分為期不同，又分為經(jīng)典液相色譜經(jīng)典液相色譜和和現(xiàn)代液相色譜法現(xiàn)代液相色譜法（高效液相色譜法（高效液相色譜法). 經(jīng)典液相色譜法采用普通規(guī)格的固定相，常經(jīng)典液相色譜法采用普通規(guī)格的固定相，常壓輸送流動(dòng)相，以重力和毛細(xì)管作用力為驅(qū)動(dòng)壓輸送流動(dòng)相，以重力和毛細(xì)管作用力為驅(qū)動(dòng)力分離效能不高，周期較長(zhǎng)，一般不具有在線力分離效能不

2、高，周期較長(zhǎng)，一般不具有在線檢測(cè)器。經(jīng)典液相色譜法儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，費(fèi)用低，檢測(cè)器。經(jīng)典液相色譜法儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，費(fèi)用低，可用于中草藥有效成分的分離純化、藥品的純度可用于中草藥有效成分的分離純化、藥品的純度控制和雜質(zhì)檢查等。控制和雜質(zhì)檢查等。2 第第1 1節(jié)節(jié) 液液- -固吸附柱色譜法（固吸附柱色譜法（LSCLSC） 經(jīng)典的液經(jīng)典的液固吸附色譜（固吸附色譜（liquid solid adsorption chromatography，LSC）是）是以吸附劑為固定相，有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，利用不以吸附劑為固定相，有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，利用不同組分在吸附劑上吸附性能的差異，進(jìn)行分離分同組分在吸附劑上吸附性能的差

3、異，進(jìn)行分離分析的方法。析的方法。 用于分離分析極性至弱極性的化合物，不適用用于分離分析極性至弱極性的化合物，不適用于分離分析強(qiáng)極性的物質(zhì)。于分離分析強(qiáng)極性的物質(zhì)。一、基本原理一、基本原理 1 1吸附與吸附平衡吸附與吸附平衡 3 吸附過(guò)程是試樣中組分分子與流動(dòng)相分子吸附過(guò)程是試樣中組分分子與流動(dòng)相分子爭(zhēng)奪吸附劑表面活性中心的過(guò)程。爭(zhēng)奪吸附劑表面活性中心的過(guò)程。圖圖10-1 10-1 吸附色譜示意圖吸附色譜示意圖m.m.流動(dòng)相流動(dòng)相 a.a.吸附劑吸附劑 XmXm. .流動(dòng)相中溶質(zhì)分子流動(dòng)相中溶質(zhì)分子 YmYm. .流動(dòng)相分子流動(dòng)相分子 XaXa. .被吸附的溶質(zhì)分子被吸附的溶質(zhì)分子 4這種吸附

4、平衡過(guò)程可表示為這種吸附平衡過(guò)程可表示為Xm nYa Xa nYm +吸附 解吸附 namnmaYXYXK 吸附平衡常數(shù)吸附平衡常數(shù): 因?yàn)榱鲃?dòng)相的量很大，因?yàn)榱鲃?dòng)相的量很大， 近似于常數(shù)，而近似于常數(shù)，而且吸附只發(fā)生于吸附劑表面，所以，吸附平衡常且吸附只發(fā)生于吸附劑表面，所以，吸附平衡常數(shù)可寫成數(shù)可寫成 nanmYY5msmaCCmVmXaSaXXXK/的濃度為溶質(zhì)分子在流動(dòng)相中面的濃度為溶質(zhì)分子在吸附劑表maXX為流動(dòng)相的體積為吸附劑表面面積maVSCS為溶質(zhì)在固定相表面的分析濃度，為溶質(zhì)在固定相表面的分析濃度， Cm為溶質(zhì)在流動(dòng)相中的分析濃度為溶質(zhì)在流動(dòng)相中的分析濃度 K K與組分的性質(zhì)

5、、吸附劑的活性、流動(dòng)相的與組分的性質(zhì)、吸附劑的活性、流動(dòng)相的 性質(zhì)及溫度有關(guān)。性質(zhì)及溫度有關(guān)。6 K值小，說(shuō)明該物質(zhì)的吸附能力弱，在固定相值小，說(shuō)明該物質(zhì)的吸附能力弱，在固定相中滯留時(shí)間短，移動(dòng)速率快，先流出色譜柱；若中滯留時(shí)間短，移動(dòng)速率快，先流出色譜柱；若K值大，說(shuō)明該物質(zhì)值大，說(shuō)明該物質(zhì)的吸附能力強(qiáng)的吸附能力強(qiáng)，在固定相中，在固定相中滯留時(shí)間長(zhǎng)，移動(dòng)速率慢，后流出色譜柱。滯留時(shí)間長(zhǎng)，移動(dòng)速率慢，后流出色譜柱。在一在一定條件下，不同組分因吸附系數(shù)的差異得以分離。定條件下，不同組分因吸附系數(shù)的差異得以分離。 2 2吸附等溫線吸附等溫線 在一定溫度下，某一組分在固定相和流動(dòng)相在一定溫度下，某一

6、組分在固定相和流動(dòng)相 之間達(dá)到平衡時(shí)，以組分在固定相中的濃度之間達(dá)到平衡時(shí)，以組分在固定相中的濃度C Cs s為縱坐標(biāo)，以組分在流動(dòng)相中的濃度為縱坐標(biāo)，以組分在流動(dòng)相中的濃度C Cm m為橫坐為橫坐標(biāo)得到的曲線。標(biāo)得到的曲線。 7等溫線有三種類型：線性、凸形和凹形。通常在等溫線有三種類型：線性、凸形和凹形。通常在低濃度時(shí)，每種等溫線均呈線性，而高濃度時(shí)，低濃度時(shí)，每種等溫線均呈線性，而高濃度時(shí)，等溫線則呈凸形（常見）或凹形。等溫線則呈凸形（常見）或凹形。吸附等溫吸附等溫柱內(nèi)溶質(zhì)柱內(nèi)溶質(zhì)濃度分布濃度分布柱內(nèi)溶質(zhì)柱內(nèi)溶質(zhì)濃度的分濃度的分布曲線布曲線流出曲線流出曲線 保留時(shí)間保留時(shí)間與進(jìn)樣量與進(jìn)樣量

7、的關(guān)系的關(guān)系 8二、二、 吸附劑吸附劑 1. 1. 對(duì)吸附劑的要求：對(duì)吸附劑的要求： (1)表面積大，具有一定的吸附能力。表面積大，具有一定的吸附能力。 (2)不應(yīng)與流動(dòng)相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。不應(yīng)與流動(dòng)相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 (3)粒度要細(xì)，一般為粒度要細(xì)，一般為150目左右。目左右。2. 2. 常用吸附劑常用吸附劑有機(jī)類有機(jī)類 活性炭、淀粉、葡萄糖、聚酰胺、大孔活性炭、淀粉、葡萄糖、聚酰胺、大孔 樹脂等樹脂等無(wú)機(jī)類無(wú)機(jī)類 氧化鋁、硅膠、活性炭、碳酸鈣、氧化鋁、硅膠、活性炭、碳酸鈣、 硅藻土等硅藻土等（1 1）硅膠（）硅膠（SiOSiO2 2xHxH2 2O O）9結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)：內(nèi)部?jī)?nèi)部硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)硅氧交聯(lián)結(jié)

8、構(gòu)多孔結(jié)構(gòu)多孔結(jié)構(gòu) 表面表面有硅醇基有硅醇基氫鍵作用氫鍵作用吸附活性中心吸附活性中心SiOH S iOHOS i S iOS i游離羥基游離羥基(I) 鍵合羥基鍵合羥基() 硅醚結(jié)構(gòu)硅醚結(jié)構(gòu)() 硅醚結(jié)構(gòu)硅醚結(jié)構(gòu)()沒(méi)有吸附活性。沒(méi)有吸附活性。 10由于硅膠具有弱酸性，能與堿起反應(yīng)，只適用由于硅膠具有弱酸性，能與堿起反應(yīng)，只適用于分離酸性和中性化合物。于分離酸性和中性化合物。 堿性氧化鋁堿性氧化鋁 pH 9pH 910 10 適于分析堿性、中性物質(zhì)適于分析堿性、中性物質(zhì) 中性氧化鋁中性氧化鋁 pH7.5 pH7.5 適于分析酸性堿性和中性物質(zhì)適于分析酸性堿性和中性物質(zhì) 酸性氧化鋁酸性氧化鋁 p

9、H 4pH 45 5 適于分析酸性、中性物質(zhì)適于分析酸性、中性物質(zhì)（2 2）氧化鋁）氧化鋁(3) (3) 聚酰胺聚酰胺 由酰胺聚合而成的高分子物質(zhì)由酰胺聚合而成的高分子物質(zhì)。CH2CH2CH2CH2CH2CNHOn11 酰胺基中的羰基與酚類、黃酮類、酚類中酰胺基中的羰基與酚類、黃酮類、酚類中的羥基或羧基形成氫鍵；酰胺基中的氨基與醌的羥基或羧基形成氫鍵；酰胺基中的氨基與醌類、硝基類中的醌基、硝基形成氫鍵而產(chǎn)生吸類、硝基類中的醌基、硝基形成氫鍵而產(chǎn)生吸附作用。附作用。 （4 4）大孔吸附樹脂）大孔吸附樹脂 一種不含交換基團(tuán)，具有大孔一種不含交換基團(tuán)，具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑。理化網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高

10、分子吸附劑。理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸、堿及有機(jī)性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸、堿及有機(jī)溶劑。大孔樹脂可分為非極性和溶劑。大孔樹脂可分為非極性和中等極性兩類，在水溶液中吸附中等極性兩類，在水溶液中吸附力較強(qiáng)且有良好的吸附選擇性，力較強(qiáng)且有良好的吸附選擇性，而在有機(jī)溶劑中吸附能力較弱。而在有機(jī)溶劑中吸附能力較弱。12硅膠含水量硅膠含水量（%）氧化鋁含水氧化鋁含水量（量（%）活度級(jí)別活度級(jí)別051525380361015表表10-1 硅膠、氧化鋁的含水量與活度級(jí)別的關(guān)系硅膠、氧化鋁的含水量與活度級(jí)別的關(guān)系2. 2. 吸附劑的吸附活性：吸附劑的吸附活性： 氧化鋁、硅膠的吸附力的大小氧化鋁、硅膠的吸附力的大小, 還與

11、其含水量有還與其含水量有較大的關(guān)系：較大的關(guān)系：13 活度級(jí)數(shù)活度級(jí)數(shù) 含水量含水量 活性活性 吸附能力吸附能力 小小 少少 大大 強(qiáng)強(qiáng) 大大 多多 小小 弱弱 加熱除水，活性提高，吸附力加強(qiáng)（活化）加熱除水，活性提高，吸附力加強(qiáng)（活化） 吸水，活性下降，吸附力減弱。吸水，活性下降，吸附力減弱。 三、色譜條件的選擇三、色譜條件的選擇 選擇色譜分離條件時(shí)，必須從吸附劑、被分離物選擇色譜分離條件時(shí)，必須從吸附劑、被分離物質(zhì)、流動(dòng)相質(zhì)、流動(dòng)相(洗脫劑洗脫劑)三方面進(jìn)行綜合考慮。三方面進(jìn)行綜合考慮。 141. 1. 被分離物質(zhì)的極性被分離物質(zhì)的極性被分離物質(zhì)的極性越大被分離物質(zhì)的極性越大,被吸附劑吸附

12、得越牢被吸附劑吸附得越牢!常見的化合物極性大小順序常見的化合物極性大小順序: 烷烴烷烴 烯烴烯烴 醚類醚類 硝基化合物硝基化合物 二甲胺二甲胺 脂脂類類 酮類酮類 醛類醛類 硫醇硫醇 胺類胺類 酰胺酰胺 醇類醇類 酚類酚類 羧酸類羧酸類 被分離物質(zhì)的極性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系被分離物質(zhì)的極性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系 (1) 基本母核相同基本母核相同 , 基團(tuán)極性愈大基團(tuán)極性愈大 , 分子極性愈大。分子極性愈大。 基本母核相同基本母核相同 , 極性基團(tuán)數(shù)目愈多極性基團(tuán)數(shù)目愈多 , 分子極性愈大。分子極性愈大。(2) 分子雙鍵多分子雙鍵多, 吸附力吸附力 。(3) 空間排列空間排列 , 影響極性。影響極性。例如羥基處于

13、能形成分子內(nèi)氫鍵的位置時(shí)例如羥基處于能形成分子內(nèi)氫鍵的位置時(shí)15COOHOHCHOOHO2. 吸附劑的活性吸附劑的活性: 吸附劑的活性吸附劑的活性大，對(duì)被測(cè)組分的吸附能力大，對(duì)被測(cè)組分的吸附能力強(qiáng)強(qiáng) 物質(zhì)的極性物質(zhì)的極性 吸附劑活性吸附劑活性 大大 小小 防吸附太牢防吸附太牢,難洗脫難洗脫 小小 大大 防防tR太小太小,不易分離不易分離3. 3. 流動(dòng)相的極性流動(dòng)相的極性 流動(dòng)相極性大，對(duì)被測(cè)組分的洗脫能力強(qiáng)流動(dòng)相極性大，對(duì)被測(cè)組分的洗脫能力強(qiáng)16常用流動(dòng)相極性強(qiáng)弱順序常用流動(dòng)相極性強(qiáng)弱順序: 石油醚石油醚 環(huán)己烷環(huán)己烷 四氯化碳四氯化碳 苯苯 甲苯甲苯 乙醚乙醚 氯仿氯仿 醋酸乙酯醋酸乙酯

14、正丁醇正丁醇 丙醇丙醇 乙醇、甲醇乙醇、甲醇 1 , 說(shuō)明B+ 較牢地結(jié)合在樹脂上 KB/A 1 , 說(shuō)明A+ 較牢地結(jié)合在樹脂上 所以KB/A說(shuō)明了樹脂對(duì)A+、 B+兩種離子選擇性交換的能力,故也稱之為選擇性系數(shù)選擇性系數(shù)。 KB/A=B+ A+r A+ B+ rR A+ B+ R B+ A+22 用離子交換樹脂分離不同離子時(shí)，樣品組分離用離子交換樹脂分離不同離子時(shí)，樣品組分離子與流動(dòng)相離子在樹脂上產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)交換，交換能力子與流動(dòng)相離子在樹脂上產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)交換，交換能力弱的離子易被流動(dòng)相洗脫。選擇性系數(shù)大的離子交弱的離子易被流動(dòng)相洗脫。選擇性系數(shù)大的離子交換能力強(qiáng)，保留時(shí)間長(zhǎng)，后流出色譜柱。結(jié)果各

15、種換能力強(qiáng)，保留時(shí)間長(zhǎng)，后流出色譜柱。結(jié)果各種離子按選擇性系數(shù)的大小順序被洗脫。離子按選擇性系數(shù)的大小順序被洗脫。二、離子交換樹脂結(jié)構(gòu)與分類二、離子交換樹脂結(jié)構(gòu)與分類離子交換樹脂是具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的高分子多離子交換樹脂是具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的高分子多元酸或多元堿的聚合物。常用的是聚苯乙烯型元酸或多元堿的聚合物。常用的是聚苯乙烯型離子交換樹脂。它是以苯乙烯和二乙烯苯聚合離子交換樹脂。它是以苯乙烯和二乙烯苯聚合而成球形網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而成球形網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，聚苯乙烯型磺酸基陽(yáng)離子交換樹脂的制備：聚苯乙烯型磺酸基陽(yáng)離子交換樹脂的制備：23CH CH2CH CH2CH CH2單體+聚合磺酸化磺酸化交聯(lián)劑交聯(lián)劑如果用其

16、它基團(tuán)代替磺酸基，如果用其它基團(tuán)代替磺酸基，就可以得到一系列陽(yáng)離子交就可以得到一系列陽(yáng)離子交換樹脂。例如換樹脂。例如COOH、OH等。這些基團(tuán)上的氫離等。這些基團(tuán)上的氫離子可被樣品溶液中的陽(yáng)離子子可被樣品溶液中的陽(yáng)離子交換。交換。24陰離子交換樹脂具有與陽(yáng)離子交換樹脂同樣的有陰離子交換樹脂具有與陽(yáng)離子交換樹脂同樣的有機(jī)骨架，只是在骨架上引入了可離解的堿性基團(tuán)，機(jī)骨架，只是在骨架上引入了可離解的堿性基團(tuán)，如如季胺基季胺基(NR 3OH )等等，就成為陰離子交，就成為陰離子交換樹脂。其交換反應(yīng)如下：換樹脂。其交換反應(yīng)如下：OHXRNRXOHRNR33三、離子交換樹脂的性能三、離子交換樹脂的性能 1

17、. 交聯(lián)度交聯(lián)度: 交換樹脂中交換樹脂中 , 交聯(lián)劑交聯(lián)劑(二乙烯苯二乙烯苯)的含的含量為交聯(lián)度量為交聯(lián)度 , 以重量百分比表示。以重量百分比表示。25 交聯(lián)度交聯(lián)度 網(wǎng)眼網(wǎng)眼 交換速度交換速度 離子離子 選擇性選擇性 大大 小小 慢慢 小離子小離子 好好 小小 大大 快快 大小離子大小離子 差差 陽(yáng)離子交換樹脂一般交聯(lián)度陽(yáng)離子交換樹脂一般交聯(lián)度8 % 陰離子交換樹脂一般交聯(lián)度陰離子交換樹脂一般交聯(lián)度4 % 2. 2. 交換容量交換容量: : 交換容量是指每克干樹脂能參加交換反應(yīng)的交換容量是指每克干樹脂能參加交換反應(yīng)的活性基團(tuán)數(shù)。一般為活性基團(tuán)數(shù)。一般為110mmol/g。它反映了離子交換樹脂

18、進(jìn)行離子交換反應(yīng)的能力，決它反映了離子交換樹脂進(jìn)行離子交換反應(yīng)的能力，決定于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)所含有的酸性或堿性基團(tuán)的數(shù)目。樹定于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)所含有的酸性或堿性基團(tuán)的數(shù)目。樹脂的結(jié)構(gòu)與組成、溶液的脂的結(jié)構(gòu)與組成、溶液的pH等因素都影響交換容量。等因素都影響交換容量。26第第4節(jié)節(jié) 空間排阻柱色譜法（空間排阻柱色譜法（SEC）利用被測(cè)組分分子大小不同，在固定相上選擇利用被測(cè)組分分子大小不同，在固定相上選擇性滲透，實(shí)現(xiàn)分離。性滲透，實(shí)現(xiàn)分離。主要用于大分子物質(zhì)如蛋主要用于大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖等的分離。白質(zhì)、多糖等的分離。 固定相固定相多孔性凝膠多孔性凝膠 流動(dòng)相流動(dòng)相水水凝膠過(guò)濾色譜凝膠過(guò)濾色譜 流動(dòng)相

19、流動(dòng)相有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑凝膠滲透色譜凝膠滲透色譜 一、基本原理一、基本原理1 1分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng) 27體積大的組分完全不能進(jìn)入凝膠體積大的組分完全不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)的孔隙中，只能經(jīng)過(guò)凝膠顆粒內(nèi)的孔隙中，只能經(jīng)過(guò)凝膠顆粒之間的間隙隨流動(dòng)相最先流顆粒之間的間隙隨流動(dòng)相最先流出色譜柱；而體積小的組分，可出色譜柱；而體積小的組分，可滲入凝膠顆粒內(nèi)的孔隙中，因此滲入凝膠顆粒內(nèi)的孔隙中，因此在流經(jīng)凝膠顆粒之間的間隙和全在流經(jīng)凝膠顆粒之間的間隙和全部凝膠顆粒的孔隙之后，最后流部凝膠顆粒的孔隙之后，最后流出；介于大小分子中間的組分，出；介于大小分子中間的組分，只能進(jìn)入一部分顆粒內(nèi)較大的孔只能進(jìn)入一部分顆粒內(nèi)

20、較大的孔隙，在中間時(shí)間段流出。隙，在中間時(shí)間段流出。 根據(jù)溶質(zhì)分子大小的不同進(jìn)行分離的現(xiàn)象稱根據(jù)溶質(zhì)分子大小的不同進(jìn)行分離的現(xiàn)象稱為分子篩效應(yīng)為分子篩效應(yīng)2 2滲透系數(shù)滲透系數(shù)K KP P 28XXKmSPXm與與Xs分別代表在孔外流動(dòng)相中和凝膠孔隙中分別代表在孔外流動(dòng)相中和凝膠孔隙中同等大小的溶質(zhì)分子。平衡時(shí)，兩者濃度之比同等大小的溶質(zhì)分子。平衡時(shí)，兩者濃度之比為滲透系數(shù)為滲透系數(shù)根據(jù)空間排阻理論，凝膠孔內(nèi)外同等大小的根據(jù)空間排阻理論，凝膠孔內(nèi)外同等大小的分子處于擴(kuò)散平衡狀態(tài)分子處于擴(kuò)散平衡狀態(tài) XmXs29在凝膠孔徑一定時(shí)，當(dāng)分子大到不能進(jìn)入凝膠所在凝膠孔徑一定時(shí)，當(dāng)分子大到不能進(jìn)入凝膠所

21、有空隙時(shí)（排斥極限），有空隙時(shí)（排斥極限）， XS=0，則，則KP=0；而當(dāng)分子小到能進(jìn)入所有空隙時(shí)（全滲透），而當(dāng)分子小到能進(jìn)入所有空隙時(shí)（全滲透）， XS=Xm，KP=1；分子尺寸在上述兩種分子之間時(shí)，能進(jìn)入部分空分子尺寸在上述兩種分子之間時(shí)，能進(jìn)入部分空隙，隙， 0KP1.在高分子溶液中，相同成分的分子尺寸大小與在高分子溶液中，相同成分的分子尺寸大小與分子量成比例，因此，在一定范圍內(nèi)，分子量成比例，因此，在一定范圍內(nèi)，KP與分與分子量相關(guān)，分子量小，子量相關(guān)，分子量小，KP大。大。30排斥極限與全滲透之間對(duì)應(yīng)的分子量范圍稱為排斥極限與全滲透之間對(duì)應(yīng)的分子量范圍稱為凝膠的分子量范圍。選擇凝

22、膠時(shí)應(yīng)使試樣的分凝膠的分子量范圍。選擇凝膠時(shí)應(yīng)使試樣的分子量落入此范圍。子量落入此范圍。當(dāng)組分的分子量在凝膠的分子量范圍之內(nèi)時(shí)，其當(dāng)組分的分子量在凝膠的分子量范圍之內(nèi)時(shí)，其保留體積與滲透系數(shù)有如下關(guān)系保留體積與滲透系數(shù)有如下關(guān)系:SP0mSP0RVKV)VVK1 (VV)VV(m0死體積VS為凝膠孔隙的總體積（固定相體積），為凝膠孔隙的總體積（固定相體積），Vm為凝膠的粒間體積（流動(dòng)相體積）為凝膠的粒間體積（流動(dòng)相體積）31固定相固定相常用的凝膠有葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠常用的凝膠有葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和和.聚苯乙烯凝膠等。聚苯乙烯凝膠等。 要選擇對(duì)樣品的溶解好，又能潤(rùn)濕凝膠，粘度要選

23、擇對(duì)樣品的溶解好，又能潤(rùn)濕凝膠，粘度要低的溶劑，否則，會(huì)限制分子擴(kuò)散而影響分離要低的溶劑，否則，會(huì)限制分子擴(kuò)散而影響分離效果。一般水溶性試樣選水溶液，非水溶性試樣效果。一般水溶性試樣選水溶液，非水溶性試樣選四氫呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有機(jī)選四氫呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有機(jī)溶劑。溶劑。流動(dòng)相流動(dòng)相第第5 5節(jié)節(jié) 薄層色譜法（薄層色譜法（TLCTLC）32 將固定相均勻地涂鋪在具有光潔表面的玻璃、將固定相均勻地涂鋪在具有光潔表面的玻璃、塑料或金屬板上形成薄層，在此薄層上進(jìn)行色譜分塑料或金屬板上形成薄層，在此薄層上進(jìn)行色譜分離分析的方法稱為薄層色譜法（離分析的方法稱為薄層色譜法（TL

24、C）。）。鋪有固定相的板子稱為薄層板簡(jiǎn)稱薄板。在薄層鋪有固定相的板子稱為薄層板簡(jiǎn)稱薄板。在薄層色譜法中使用的流動(dòng)相又稱為展開劑。色譜法中使用的流動(dòng)相又稱為展開劑。 按分離機(jī)制薄層色譜法可分為吸附、離子交按分離機(jī)制薄層色譜法可分為吸附、離子交換、分配和分子排阻色譜法等。按薄層板的分離換、分配和分子排阻色譜法等。按薄層板的分離效率不同，又可分為經(jīng)典薄層色譜法效率不同，又可分為經(jīng)典薄層色譜法(TLC)及高及高效薄層色譜法效薄層色譜法(HPTLC)。本節(jié)主要討論應(yīng)用最。本節(jié)主要討論應(yīng)用最為廣泛的吸附薄層色譜法。為廣泛的吸附薄層色譜法。操作過(guò)程：操作過(guò)程：33特點(diǎn)：特點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，分析速度快，

25、分離效率設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，分析速度快，分離效率高，靈敏度高，顯色方便，結(jié)果直觀，高，靈敏度高，顯色方便，結(jié)果直觀，預(yù)處理簡(jiǎn)單預(yù)處理簡(jiǎn)單。應(yīng)用：應(yīng)用：定性、藥物雜質(zhì)檢查、純度測(cè)定定性、藥物雜質(zhì)檢查、純度測(cè)定一、基本原理一、基本原理 1.分離過(guò)程分離過(guò)程 將混合組分的試液將混合組分的試液, 點(diǎn)在鋪了吸附劑的玻璃板一點(diǎn)在鋪了吸附劑的玻璃板一端端, 在密閉容器中用適當(dāng)?shù)娜軇┰诿荛]容器中用適當(dāng)?shù)娜軇?(展開劑、流動(dòng)相展開劑、流動(dòng)相) 展開展開, 各組分不斷地被吸附各組分不斷地被吸附, 解吸附解吸附 隨展開劑前隨展開劑前移移, 利用吸附劑對(duì)不同組分的吸附能力利用吸附劑對(duì)不同組分的吸附能力 (吸附平衡吸附

26、平衡常數(shù)常數(shù))不同不同, 產(chǎn)生差速遷移產(chǎn)生差速遷移, 而達(dá)到分離。而達(dá)到分離。342. 比移值比移值 原點(diǎn)到斑點(diǎn)中心的距離原點(diǎn)到溶劑前沿的距離=Rf RfA= a / c RfB = b / c一般要求組分的一般要求組分的fR 值在值在0.20.20.80.8之間。之間。Rf = 0 ，被固定完全吸附，被固定完全吸附, K Rf = 1 ，組分不被固定相吸附，組分不被固定相吸附, K 0 ) 0 Rf 135 比移值是薄層色譜的基本定性參數(shù)，它說(shuō)明比移值是薄層色譜的基本定性參數(shù)，它說(shuō)明組分在色譜系統(tǒng)中的保留行為。比移值的數(shù)值除組分在色譜系統(tǒng)中的保留行為。比移值的數(shù)值除與組分的性質(zhì)有關(guān)外，還與薄

27、層板的性質(zhì)與組分的性質(zhì)有關(guān)外，還與薄層板的性質(zhì)(活性活性等等)、展開劑的性質(zhì)、展開劑的性質(zhì)(極性、組成等極性、組成等)和溫度有關(guān)。和溫度有關(guān)。值的因素很多，值的因素很多，重復(fù)性較差重復(fù)性較差 3相對(duì)比移值相對(duì)比移值 的距離原點(diǎn)到對(duì)照品斑點(diǎn)中心心的距離原點(diǎn)到樣品組分斑點(diǎn)中stRk11Rf在一定條件下，吸附平衡常數(shù)越大，在一定條件下，吸附平衡常數(shù)越大，容量因子容量因子k就越大，則比移值越小。就越大，則比移值越小。36討論討論 對(duì)照品與被測(cè)組分在完全對(duì)照品與被測(cè)組分在完全相同條件下展開，可以消相同條件下展開，可以消除系統(tǒng)誤差，大大提高重除系統(tǒng)誤差，大大提高重現(xiàn)性和可靠性；現(xiàn)性和可靠性； 對(duì)照品可以是

28、后加入純物對(duì)照品可以是后加入純物質(zhì)，也可是樣品中已知組質(zhì)，也可是樣品中已知組分。分。 相對(duì)比移值相對(duì)比移值Rst與組分、對(duì)與組分、對(duì)照品性質(zhì)等因素有關(guān)，可照品性質(zhì)等因素有關(guān)，可以大于或小于以大于或小于1。AB對(duì)對(duì)cabcaR)A(stcbR)B(st37二、固定相二、固定相吸附柱色譜的固定相薄層色譜也可以使用吸附柱色譜的固定相薄層色譜也可以使用,如如硅膠、硅膠、Al 2O 3等，但等，但粒度比柱色譜更細(xì)。粒度比柱色譜更細(xì)。硅膠微帶酸性，適用于酸性及中性物質(zhì)的分離。硅膠微帶酸性，適用于酸性及中性物質(zhì)的分離。 薄層色譜用硅膠粒度為薄層色譜用硅膠粒度為40m，硅膠硅膠G 硅膠硅膠 + 煅石膏（煅石膏

29、（CaSO4） 硅膠硅膠H 硅膠硅膠(未加任何物質(zhì)未加任何物質(zhì))硅膠硅膠HF254 硅膠硅膠+熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)硅膠硅膠GF254 硅膠硅膠+煅石膏煅石膏+熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)氧化鋁一般適用于堿性物質(zhì)和中性物質(zhì)的分離氧化鋁一般適用于堿性物質(zhì)和中性物質(zhì)的分離 38三、展開劑三、展開劑在吸附薄層色譜法中，展開劑選擇的一般原則與在吸附薄層色譜法中，展開劑選擇的一般原則與吸附柱色譜法中選擇流動(dòng)相的原則相同，主要根吸附柱色譜法中選擇流動(dòng)相的原則相同，主要根據(jù)被分離物質(zhì)的極性、吸附劑的活性以及展開劑據(jù)被分離物質(zhì)的極性、吸附劑的活性以及展開劑本身的極性來(lái)選則。本身的極性來(lái)選則。39 實(shí)驗(yàn)中，一般先選擇單一溶劑展開

30、，對(duì)難分實(shí)驗(yàn)中，一般先選擇單一溶劑展開，對(duì)難分離組分，則需使用二元、三元甚至多元的溶劑系離組分，則需使用二元、三元甚至多元的溶劑系統(tǒng)。統(tǒng)。 在多元展開劑中占比例較大的主要溶劑起在多元展開劑中占比例較大的主要溶劑起溶解樣品和基本分離的作用，占比例較小的溶溶解樣品和基本分離的作用，占比例較小的溶劑起調(diào)整劑起調(diào)整Rf 值、改善分離度和對(duì)某些組分的選值、改善分離度和對(duì)某些組分的選擇性作用。擇性作用。 如某一物質(zhì)在用苯作展開劑時(shí)，移動(dòng)距離太小，說(shuō)明如某一物質(zhì)在用苯作展開劑時(shí)，移動(dòng)距離太小，說(shuō)明展開劑的極性太小，此時(shí)可以加入一定量的乙醇等極性大展開劑的極性太小，此時(shí)可以加入一定量的乙醇等極性大的溶劑。再視

31、分離的效果適當(dāng)改變?nèi)軇┑呐浔?，如苯的溶劑。再視分離的效果適當(dāng)改變?nèi)軇┑呐浔?，如?乙乙醇為醇為91、82或或73等。必要時(shí)甚至還要加一些酸等。必要時(shí)甚至還要加一些酸或堿。一般希望或堿。一般希望Rf值在值在0.20.8之間較為滿意。之間較為滿意。 40四、操作方法四、操作方法1. 1. 薄層板制備薄層板制備 薄層板分為硬板與軟板。軟板的制備是直接薄層板分為硬板與軟板。軟板的制備是直接將吸附劑置于玻璃板上并使成為一均勻薄層便制將吸附劑置于玻璃板上并使成為一均勻薄層便制成了一塊軟板。硬板的制備需要以下幾個(gè)步驟：成了一塊軟板。硬板的制備需要以下幾個(gè)步驟： 載板的準(zhǔn)備。載板的準(zhǔn)備。 勻漿的制備：制備勻漿

32、時(shí)勻漿的制備：制備勻漿時(shí)有時(shí)需要加一些粘合劑，常有時(shí)需要加一些粘合劑，常用粘合劑有煅石膏、羧甲基用粘合劑有煅石膏、羧甲基纖維素鈉（纖維素鈉（CMC-Na）等。）等。41煅石膏：吸附劑的煅石膏：吸附劑的9-15%9-15%左右左右羧甲基纖維素鈉羧甲基纖維素鈉CMC-NaCMC-Na：0.5-1%0.5-1%水溶液水溶液 例如，取一定量的硅膠例如，取一定量的硅膠H放入研缽中，加入放入研缽中，加入3倍量的含有倍量的含有0.3%0.7%羧甲基纖維素鈉羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）的水溶液，朝同一方向研磨成）的水溶液，朝同一方向研磨成均勻稀糊狀均勻稀糊狀. 鋪板鋪板 手工涂鋪法手工涂鋪法 機(jī)械涂鋪法機(jī)械

33、涂鋪法 42活化：將鋪好的薄層板先涼干，再在活化：將鋪好的薄層板先涼干，再在105110進(jìn)行加熱活化，活化的程度等進(jìn)行加熱活化，活化的程度等要根據(jù)樣品的性質(zhì)決定。要根據(jù)樣品的性質(zhì)決定。2.2.點(diǎn)樣點(diǎn)樣 （1）樣品溶液的制備）樣品溶液的制備 應(yīng)盡量避免用水作溶劑，因?yàn)樗芤喊唿c(diǎn)容易應(yīng)盡量避免用水作溶劑，因?yàn)樗芤喊唿c(diǎn)容易擴(kuò)散，且不易揮發(fā)。一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯擴(kuò)散，且不易揮發(fā)。一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等揮發(fā)性有機(jī)溶劑，最好用與展開劑極性相似的仿等揮發(fā)性有機(jī)溶劑，最好用與展開劑極性相似的溶劑。水溶性樣品可先用少量水溶解，再用甲醇或溶劑。水溶性樣品可先用少量水溶解，再用甲醇或乙醇稀釋定容。乙

34、醇稀釋定容。43（2）點(diǎn)樣量）點(diǎn)樣量點(diǎn)樣量的多少視薄層的性能及顯色劑的靈敏度等點(diǎn)樣量的多少視薄層的性能及顯色劑的靈敏度等而定，在檢測(cè)器靈敏度足夠時(shí)，應(yīng)降低點(diǎn)樣量。點(diǎn)樣而定，在檢測(cè)器靈敏度足夠時(shí)，應(yīng)降低點(diǎn)樣量。點(diǎn)樣量太多，展開后會(huì)出現(xiàn)斑點(diǎn)過(guò)大或拖尾等現(xiàn)象，而影量太多，展開后會(huì)出現(xiàn)斑點(diǎn)過(guò)大或拖尾等現(xiàn)象，而影響分離效果。響分離效果。點(diǎn)樣體積一般在點(diǎn)樣體積一般在幾到幾十微克（幾到幾十微克（ 1 10 l）, 點(diǎn)點(diǎn)樣量太大樣量太大, 斑易拖尾斑易拖尾, 影響分離效果。影響分離效果。(3)點(diǎn)樣方法點(diǎn)樣方法點(diǎn)樣方式：接觸式點(diǎn)樣與噴霧式點(diǎn)樣點(diǎn)樣方式：接觸式點(diǎn)樣與噴霧式點(diǎn)樣點(diǎn)樣形狀；點(diǎn)狀、條狀點(diǎn)樣點(diǎn)樣形狀；點(diǎn)狀

35、、條狀點(diǎn)樣點(diǎn)樣器具微量進(jìn)樣器、定量毛細(xì)管；點(diǎn)樣器具微量進(jìn)樣器、定量毛細(xì)管；底距：底距： 1.52cm點(diǎn)距：點(diǎn)距：0.5 1cm原點(diǎn)直徑原點(diǎn)直徑 ： 23 mm。（邊點(diǎn)邊熱風(fēng)吹）。（邊點(diǎn)邊熱風(fēng)吹）4445起始線起始線463.展開展開 將點(diǎn)好樣的薄層板浸入展開劑中，展開劑借薄層將點(diǎn)好樣的薄層板浸入展開劑中，展開劑借薄層板上固定相的毛細(xì)作用攜帶樣品組分在薄層板上板上固定相的毛細(xì)作用攜帶樣品組分在薄層板上遷移一定距離的過(guò)程稱為展開。遷移一定距離的過(guò)程稱為展開。（1）展開裝置）展開裝置 常用的展開裝置有直立型的單槽色譜缸和雙槽色譜缸、圓常用的展開裝置有直立型的單槽色譜缸和雙槽色譜缸、圓形色譜缸、臥式色譜

36、缸等。形色譜缸、臥式色譜缸等。 47(2)展開方式展開方式 一般展開方式一般展開方式 ：上行、下行、雙向等：上行、下行、雙向等展開距離：展開距離：615cm注意點(diǎn)：注意點(diǎn)： 展開劑浸薄層板下端展開劑浸薄層板下端0.5cm, 不能浸住起始線不能浸住起始線, 層析缸應(yīng)密閉。層析缸應(yīng)密閉。 先飽和先飽和1530分鐘分鐘,再展開再展開,防止邊緣效應(yīng)。防止邊緣效應(yīng)。 48 邊緣效應(yīng)是指同一物質(zhì)邊緣效應(yīng)是指同一物質(zhì)的色譜斑點(diǎn)，在薄層板上的色譜斑點(diǎn)，在薄層板上兩邊緣部分的兩邊緣部分的Rf值大于中值大于中間部分的間部分的Rf值的現(xiàn)象。值的現(xiàn)象。 這是由于色譜缸內(nèi)溶劑這是由于色譜缸內(nèi)溶劑蒸氣未達(dá)飽和，造成展開蒸

37、氣未達(dá)飽和，造成展開劑的蒸發(fā)速率在薄層板兩劑的蒸發(fā)速率在薄層板兩邊與中間部分不等。展開邊與中間部分不等。展開劑中極性較弱和沸點(diǎn)較低劑中極性較弱和沸點(diǎn)較低的溶劑在邊緣揮發(fā)的快些，的溶劑在邊緣揮發(fā)的快些，致使邊緣部分的展開劑中致使邊緣部分的展開劑中極性溶劑比例增大，故極性溶劑比例增大，故Rf值相對(duì)變大。值相對(duì)變大。 49原點(diǎn)12雙向展開雙向展開4.斑點(diǎn)定位斑點(diǎn)定位 有色化合物有色化合物直接定位直接定位50顯色劑有通用型和專用型兩種。通用型顯色劑有碘、硫酸顯色劑有通用型和專用型兩種。通用型顯色劑有碘、硫酸溶液、等。碘使許多化合物顯色，如生物堿、氨基酸衍生溶液、等。碘使許多化合物顯色，如生物堿、氨基酸

38、衍生物、肽類、脂類及皂甙等。它的最大特點(diǎn)是與物質(zhì)的反應(yīng)物、肽類、脂類及皂甙等。它的最大特點(diǎn)是與物質(zhì)的反應(yīng)是可逆的，當(dāng)?shù)馍A揮去后，斑點(diǎn)便于進(jìn)一步處理。硫酸是可逆的，當(dāng)?shù)馍A揮去后，斑點(diǎn)便于進(jìn)一步處理。硫酸能對(duì)大部分有機(jī)化合物顯色，但它是破壞性顯色劑。能對(duì)大部分有機(jī)化合物顯色，但它是破壞性顯色劑。物理?yè)斐龇ㄎ锢頁(yè)斐龇ɑ瘜W(xué)撿出法化學(xué)撿出法51 專用顯色劑是指對(duì)某個(gè)或某一類化合物顯色的試專用顯色劑是指對(duì)某個(gè)或某一類化合物顯色的試劑，例如茚三酮是氨基酸的專用顯色劑，。羧酸可劑，例如茚三酮是氨基酸的專用顯色劑，。羧酸可用酸堿指示劑作顯色劑，含酚羥基物質(zhì)可噴三氯化用酸堿指示劑作顯色劑，含酚羥基物質(zhì)可噴三氯

39、化鐵鐵鐵氰化鉀試劑進(jìn)行顯色。鐵氰化鉀試劑進(jìn)行顯色。 顯色劑直接由噴霧器噴灑在硬板上，立即顯色顯色劑直接由噴霧器噴灑在硬板上，立即顯色或加熱至一定溫度顯色?；蚣訜嶂烈欢囟蕊@色。五、定性分析五、定性分析1. 1. 利用利用R Rf f 值定性或相對(duì)比移值值定性或相對(duì)比移值R Rstst（在同一塊板上）（在同一塊板上）2. 2. R Rf f 值值+ +斑點(diǎn)顏色特征（原位化學(xué)反應(yīng)）斑點(diǎn)顏色特征（原位化學(xué)反應(yīng)）; ;3. 3. 多種展開劑體系展開進(jìn)行驗(yàn)證多種展開劑體系展開進(jìn)行驗(yàn)證; ;4. 4. 與其他技術(shù)聯(lián)用。與其他技術(shù)聯(lián)用。52六、定量分析六、定量分析（一）洗脫法（一）洗脫法 薄層分離薄層分離

40、取下斑點(diǎn)取下斑點(diǎn) 洗脫洗脫 離心離心 取上清液進(jìn)行測(cè)定取上清液進(jìn)行測(cè)定 （二）薄層掃描法（二）薄層掃描法 又稱原位定量薄層掃描法又稱原位定量薄層掃描法 1.基本原理基本原理53 用一束一定波長(zhǎng)、一定強(qiáng)度的紫外或可見光對(duì)用一束一定波長(zhǎng)、一定強(qiáng)度的紫外或可見光對(duì)薄層板進(jìn)行掃描，測(cè)定薄層板上的樣品斑點(diǎn)對(duì)光的薄層板進(jìn)行掃描，測(cè)定薄層板上的樣品斑點(diǎn)對(duì)光的吸收強(qiáng)度或斑點(diǎn)經(jīng)激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，所得吸收強(qiáng)度或斑點(diǎn)經(jīng)激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，所得關(guān)系曲線下的面積與色譜斑點(diǎn)中待測(cè)物質(zhì)的濃度或關(guān)系曲線下的面積與色譜斑點(diǎn)中待測(cè)物質(zhì)的濃度或量成正比量成正比 。薄層掃描法的分類薄層掃描法的分類掃描方式掃描方式吸收法吸收

41、法熒光法熒光法反射法反射法透射法透射法 大多用于凝膠色譜大多用于凝膠色譜非透明界質(zhì)薄層板非透明界質(zhì)薄層板54方程是薄層掃描法定量的依據(jù)。方程是薄層掃描法定量的依據(jù)。Kubelka-Munk古柏爾卡古柏爾卡-曼克曼克55 通常在薄層掃描中都是以空白板為基準(zhǔn)，測(cè)通常在薄層掃描中都是以空白板為基準(zhǔn)，測(cè)定定相對(duì)透光率相對(duì)透光率及及相對(duì)反射率相對(duì)反射率來(lái)計(jì)算薄層色譜斑來(lái)計(jì)算薄層色譜斑點(diǎn)的吸光度。點(diǎn)的吸光度。透射法透射法 00lglgiiTTA空白薄層和樣品斑空白薄層和樣品斑點(diǎn)的透射率分別為點(diǎn)的透射率分別為000IiT 0IiT 56 反射法示意圖反射法示意圖 I0為照射光強(qiáng)度；為照射光強(qiáng)度；j0為空白板

42、反射光強(qiáng)度；為空白板反射光強(qiáng)度； j為斑點(diǎn)處反射光強(qiáng)度為斑點(diǎn)處反射光強(qiáng)度空白薄層和樣品斑點(diǎn)的反射率分別為空白薄層和樣品斑點(diǎn)的反射率分別為0000IjR,IjR斑點(diǎn)的吸光度斑點(diǎn)的吸光度00lglgjjRRA57SX=20SX=10SX=0根據(jù)根據(jù)Kubelka-Munk方程，色譜斑點(diǎn)中待測(cè)物質(zhì)的方程，色譜斑點(diǎn)中待測(cè)物質(zhì)的吸光度吸光度A與被測(cè)物質(zhì)存在嚴(yán)格的定量關(guān)系，但不是一與被測(cè)物質(zhì)存在嚴(yán)格的定量關(guān)系，但不是一種直線關(guān)系。因此，薄層掃描定量不遵從于種直線關(guān)系。因此，薄層掃描定量不遵從于Lambert-Beer定律。定律。 58SX=0SX=10SX=20為方便定量，必須對(duì)其曲線進(jìn)行校直。為方便定量

43、，必須對(duì)其曲線進(jìn)行校直。 59Kubelka-Munk曲線的校直：曲線的校直： 日本島津日本島津CS系列的薄系列的薄層色譜掃描儀均有線性補(bǔ)償器，其工作原理即根據(jù)層色譜掃描儀均有線性補(bǔ)償器，其工作原理即根據(jù)Kubelka-Munk方程式用電路系統(tǒng)將彎曲的曲線校正方程式用電路系統(tǒng)將彎曲的曲線校正為直線后用于定量，為直線后用于定量， 瑞士瑞士CAMAG公司公司SCANNER系列的薄系列的薄層色譜掃描儀，則采層色譜掃描儀，則采用計(jì)算機(jī)進(jìn)行線性回用計(jì)算機(jī)進(jìn)行線性回歸或非線性回歸，求歸或非線性回歸，求出回歸方程，然后進(jìn)出回歸方程，然后進(jìn)行定量分析。行定量分析。60 掃描模式掃描模式 直線掃描直線掃描應(yīng)用一長(zhǎng)應(yīng)用一長(zhǎng)方形光束（其長(zhǎng)度大于方形光束（其長(zhǎng)度大于斑點(diǎn)直徑）以直線軌跡斑點(diǎn)直徑）以直線軌跡通過(guò)色譜斑點(diǎn)。通過(guò)色譜斑點(diǎn)。 適用于圓形規(guī)則的斑點(diǎn)，適用于圓形規(guī)則的斑點(diǎn)，且掃描結(jié)果受掃描方向且掃描結(jié)果受掃描方向的影響。的影響。 鋸齒掃描鋸齒掃描照射在薄照射在薄層板上的光束與薄層板層板上的光束與薄層板的相對(duì)運(yùn)動(dòng)的軌跡呈鋸的相對(duì)運(yùn)動(dòng)的軌跡呈鋸齒形或矩形。齒形或矩形。 適用于任何形狀的斑點(diǎn)，適用于任何形狀的